翟麗麗 陳文靜 劉惠銘

【摘要】目的：探討Girdin在胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：通過免疫組織化學(xué)方法檢測Girdin蛋白在人胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其和胃癌血管生成及患者臨床病理特征的關(guān)系及臨床意義。結(jié)果：胃癌組織中，Girdin表達(dá)和微血管密度（MVD）均顯著高于正常胃黏膜（P <0.05）。胃癌組織中，Girdin蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)，且與胃癌的分化程度、臨床分期、Lauren分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P <0.05）。胃癌組織中的 MVD與分化程度、臨床分期、Lauren 分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P <0.05）。胃癌組織中，Girdin表達(dá)與微血管壁周細(xì)胞覆蓋率（MPI）呈反比（P <0.01），且隨著Girdin表達(dá)的增高，MVD逐漸增加，而 MPI則逐漸減少。結(jié)論：Girdin在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。同時，Girdin的表達(dá)與胃癌的血管生成關(guān)系密切，而這種血管為不成熟血管，周細(xì)胞覆蓋率減低，其成為胃癌患者預(yù)后差的重要因素。

【關(guān)鍵詞】Girdin;胃癌;侵襲;轉(zhuǎn)移

【中圖分類號】R735.2【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-5249（2022）15-0189-05

胃癌的高死亡率與其侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，研究表明，腫瘤的血管生成在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用，腫瘤細(xì)胞通過新生血管提供氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)來促進(jìn)自身的增殖并侵入血管實現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Girdin蛋白是一種能被 Akt/蛋白激酶B激活的肌動蛋白結(jié)合蛋白，在重塑肌動蛋白細(xì)胞骨架和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成[1]。

本研究通過免疫組化方法檢測Girdin蛋白在人胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其和胃癌血管生成及患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取齊齊哈爾市第一醫(yī)院病理科2015年01月至2017年08月病理診斷為胃癌的石蠟標(biāo)本60例，其中男性44例，女性16例，年齡35～76歲，中位年齡60歲。按第5版世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[2]，組織學(xué)分級為高、中分化者41例，低分化和未分化者19例;臨床分期Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ～Ⅳ期23例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例，無轉(zhuǎn)移者23例。按1965年 Lauren 分型，腸型34例，彌漫型26例。同時收集20例相應(yīng)的癌旁正常胃黏膜組織（距腫瘤邊緣>2 cm）作為對照組。所有病例術(shù)前均未行放、化療。

1.2 方法

標(biāo)本均經(jīng)4%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm 厚連續(xù)切片，免疫組化采用EliVision法染Girdin蛋白及DouSPTM免疫組化雙染試劑盒染血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管周細(xì)胞，一抗分別為兔抗人Girdin多克隆抗體（稀釋度1∶200），購自于美國 Santa Cruz 公司，即用型鼠抗人 CD34單克隆抗體（克隆號：QB End/10）標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，即用型鼠抗人α-SMA 單克隆抗體（克隆號：1A4）標(biāo)記血管周細(xì)胞，上述兩種試劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。所有指標(biāo)的結(jié)果均由兩位高年資病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法判定。

1.3 結(jié)果判定

（1） Girdin陽性產(chǎn)物主要定位于胃癌細(xì)胞核和（或細(xì)胞質(zhì)，采用半定量積分法，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和著色強度判斷結(jié)果。陽性細(xì)胞所占百分比：0分為≤5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%;染色深度：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，兩者相乘：≤4分為陰性，>4分為陽性;（2）微血管密度（MVD）的判定標(biāo)準(zhǔn)參照 Weidner 等的方法，微血管計數(shù)以 CD34標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞形成一獨立管腔即為一血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也計作1個血管;（3）高倍鏡下計數(shù)相應(yīng)血管數(shù)及周細(xì)胞覆蓋血管數(shù)，并求其平均值，統(tǒng)計微血管壁周細(xì)胞覆蓋率（MPI）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 29.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，以[ n （%）]表示，計量資料采用 t 檢驗，MVD以（ x（—）± s ）表示，Girdin與 MVD、MPI 的相關(guān)性分析采用Mann-Whitney U 檢驗。以 P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Girdin表達(dá)

Girdin在20例癌旁正常胃黏膜中僅有5例陽性，且均為弱陽性;而在60例胃癌組織中42例陽性，二者差異顯著（P<0.01），見表1。Girdin主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)（圖1～2），尤其是腫瘤浸潤的最前緣。應(yīng)用抗α-SMA、CD34兩個第一抗體分別標(biāo)記同一張切片上的周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞，其中內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及胞膜染成深紅色，周細(xì)胞胞漿出現(xiàn)紫黑色顆粒沉積（圖3～4），有些血管的管壁只由一層內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，而無周細(xì)胞;而有些血管有兩層細(xì)胞：周細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞外側(cè)，緊貼內(nèi)皮細(xì)胞，在癌巢及其周圍的間質(zhì)中均有較豐富血管分布，尤其在腫瘤浸潤的前緣最為密集。60例胃癌中 MVD 平均值是（46.8±9.97）個/HPF，而20例癌旁正常胃黏膜中 MVD 平均值是（24.82±4.45）個/HPF，差異顯著（P<0.01），見表1。

2.2 胃癌中Girdin、MVD、MPI及臨床各病理參數(shù)

Girdin及 MVD 隨著胃癌分化程度的降低、臨床分期的升高而增加（表2）。 MPI 與胃癌的分化程度呈正相關(guān)（P <0.01），與脈管內(nèi)是否有癌栓呈負(fù)相關(guān)（P <0.01），與其他特征無關(guān)（P >0.05）。在60例胃癌組織中，42例Girdin陽性患者的 MVD 平均值為（54.23±10.95）個/HPF，而18例陰性患者的 MVD 平均值為（42.53±5.84）個/HPF，二者差異顯著（ P <0.01），且隨著Girdin表達(dá)的增多，MVD 亦逐漸增多。在60例胃癌組織中，Girdin陽性者的 MPI 平均值為（39.35±9.84）%，而陰性者的 MPI 平均值為（46.78±4.83）%，二者具有顯著的相關(guān)性（P<0.01），且隨著Girdin在胃癌組織中的表達(dá)增加，腫瘤間質(zhì)不成熟血管增多。但MVD與MPI之間不存在相關(guān)性（P>0.05，見圖5）。

3 討論

胃癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的腫瘤之一，而我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，年患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多。近30%患者在初診時已是晚期，40%局灶腫瘤患者在術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，10%～20%晚期胃癌患者對化療藥物如順鉑耐藥，且其他患者在化療6～15個月逐漸產(chǎn)生耐藥，從而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，預(yù)后極差[2-3]。胃癌發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟參與的復(fù)雜過程，具有明顯的侵襲性。為了提高胃癌患者的生存質(zhì)量，改善胃癌患者的預(yù)后，我們應(yīng)尋找胃癌新的治療靶點。磷脂酰肌醇3-激酶/Akt 絲氨酸/蘇氨酸激酶系統(tǒng)通過大量下游底物的磷酸化調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，現(xiàn)已被公認(rèn)為癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的重要信號通路，但關(guān)于 Akt 在細(xì)胞遷移中的作用的信息相對較少，這是與癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移直接相關(guān)的關(guān)鍵過程。Akt 結(jié)合蛋白Girdin（肌動蛋白絲束），也稱為 Akt 磷酸化增強劑、 Gα相互作用囊泡相關(guān)蛋白和 Hook 相關(guān)蛋白1，其由位于2號染色體上的Girdin基因表達(dá)，在哺乳動物細(xì)胞中普遍表達(dá)，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物由1870個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為2.2×105～2.5×105[4]。Girdin蛋白由3個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：氨基末端、卷曲螺旋區(qū)域和羧基末端。氨基末端與 HOOK 蛋白家族分子結(jié)構(gòu)類似并能夠與細(xì)胞內(nèi)微管、Dynamin 以及 GISC1蛋白相結(jié)合，調(diào)節(jié)肌動蛋白結(jié)構(gòu)的形成，參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建，對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)的完整以及運動起到至關(guān)重要的作用[5];中間為螺旋卷曲區(qū)域，其參與形成二聚體蛋白;羧基末端包括含質(zhì)膜結(jié)合位點以及 AKT 磷酸化位點的 CT1結(jié)構(gòu)域和含有肌動蛋白結(jié)合區(qū)、膜結(jié)合區(qū)以及 AKT磷酸化位點的CT2結(jié)構(gòu)域，具有特異性結(jié)合多種配體的功能[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Girdin蛋白通過自身的結(jié)構(gòu)特征發(fā)揮生物學(xué)作用，影響微環(huán)境的變化，尤其對腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用。通過下調(diào) MEG3降低Girdin的水平，從而減少其與血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，降低內(nèi)皮細(xì)胞的破壞，使血管的完整性得以保存，從而抑制腫瘤細(xì)胞侵及脈管，降低腫瘤血道及淋巴道的轉(zhuǎn)移[7]，可見Girdin在腫瘤的淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面起到了一個正向推動作用;腫瘤的增殖需要持續(xù)的營養(yǎng)輸送，那么這就需要大量的新生血管運送養(yǎng)料，Lan 等[8]發(fā)現(xiàn)Girdin蛋白及其磷酸化產(chǎn)物能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老及促進(jìn)新生血管的形成，對于這一發(fā)現(xiàn)，讓我們更加深入的了解了Girdin對腫瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。我們實驗發(fā)現(xiàn)Girdin蛋白高表達(dá)區(qū)域，MVD 密度增加，MPI 值降低，即Girdin蛋白與胃癌背景中的不成熟的血管的數(shù)量呈正相關(guān)，而這種不成熟血管的形成既利于腫瘤細(xì)胞的增殖，又利于腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。隨著胃癌分化程度的降低，侵襲能力的增加，Girdin蛋白表達(dá)率卻隨之增高，這可能與Girdin蛋白特殊的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，其與胃癌細(xì)胞的某些結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用，影響胃癌的分化，并通過改變胃癌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)域，影響其侵襲能力。眾所周知，細(xì)胞的運動離不開細(xì)胞內(nèi)的微管系統(tǒng)，腫瘤細(xì)胞所進(jìn)行的阿米巴運動，與腫瘤細(xì)胞內(nèi)微管系統(tǒng)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)，通過實驗建立3D 微膠原軌道模型，Girdin的敲低導(dǎo)致3D 膠原微軌跡遷移過程中的細(xì)胞速度降低。Girdin的缺失也會導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞方向的改變。此外，Girdin消耗會損害肌動蛋白組織和應(yīng)力纖維形成，這可以通過上調(diào) GTPase RhoA來恢復(fù)。RhoA的激活誘導(dǎo)肌動蛋白應(yīng)力纖維形成，在沒有Girdin的情況下恢復(fù)3D 膠原微軌道中拉長的遷移細(xì)胞形狀和部分細(xì)胞遷移，以此證實腫瘤內(nèi)Girdin蛋白通過自身的結(jié)構(gòu)域直接與細(xì)胞極性蛋白 Par-3（Partitioning defective-3）相互作用參與細(xì)胞的極化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的遷移不僅僅是單個細(xì)胞的行為，而是以群體的形勢侵襲周圍基質(zhì)，并且與周圍基質(zhì)相互作用產(chǎn)生適合腫瘤細(xì)胞生存的微環(huán)境，在器官類型培養(yǎng)模型中，Girdin對于皮膚癌細(xì)胞系 A431在膠原凝膠上的集體遷移以及基質(zhì)成纖維細(xì)胞領(lǐng)導(dǎo)的集體入侵是必不可少的[10]。腫瘤的增殖及遷移是個連續(xù)、復(fù)雜的過程，腫瘤通過增生及侵襲兩方面實現(xiàn)對機體的破壞，腫瘤細(xì)胞的不斷增生是腫瘤細(xì)胞浸潤的前提。腫瘤細(xì)胞通過促進(jìn)血管的增生提供自身所需的營養(yǎng)，通過不成熟的血管形成及自身增生導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)部壓力增高，趨向于向周圍基質(zhì)浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，而在此過程中，Girdin對前緣肌動蛋白的重塑起至關(guān)重要的作用，磷酸化的Girdin在遷移細(xì)胞的前沿增多，而細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸被丙氨酸所取代，從而使細(xì)胞拉長變形，形成偽足，表現(xiàn)出遷移能力的增加[11]。為了證實Girdin在前沿肌動蛋白重塑中很重要，通過將 siRNA 引入細(xì)胞來抑制內(nèi)源性Girdin表達(dá)。Girdin蛋白水平被Girdin siRNA 的轉(zhuǎn)染有效抑制，Girdin siRNA 的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致具有粗糙皮質(zhì)肌動蛋白絲的細(xì)胞數(shù)量增加，這表明Girdin可能對重塑外周肌動蛋白絲或細(xì)胞外基質(zhì)粘連起關(guān)鍵作用。此外，當(dāng)用 IGF-I 刺激細(xì)胞時，在Girdin siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，前緣片狀偽足的廣泛延伸顯著減弱，進(jìn)一步表明Girdin在遷移細(xì)胞外周片狀偽足中對肌動蛋白動力學(xué)的作用。Chen C[12]在紫外線誘導(dǎo)的 DNA 損傷作為放射治療的模型中，發(fā)現(xiàn)Girdin增加癌細(xì)胞對 UVC 介導(dǎo)的 DNA 損傷的敏感性，推測Girdin有可能干預(yù)腫瘤細(xì)胞周期，據(jù)報道，Girdin的消耗導(dǎo)致 DNA 合成減少，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加[13]?，F(xiàn)陸續(xù)證實Girdin在胰腺癌[14]、結(jié)腸癌[15]、乳腺癌[16]、腎母細(xì)胞瘤[17]等腫瘤當(dāng)中所起的作用，我們實驗也印證了Girdin促進(jìn)胃癌血管生成、癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。相信，通過后續(xù)的實驗研究，Girdin有可能成為胃癌治療新靶點。

參考文獻(xiàn)

[1]? Enomoto A，Ping J，Takahashi M. Girdin，a novel actin-binding protein，and its family of proteins possess versatile functions in the AKT and Wnt signaling pathways[J]. AnnN Y Acad Sci，2006，1086（1）：169-184.

[2]? 葉大勝，梁明琴，梁文勇，等.血清胃蛋白酶原檢測用于胃癌及其癌前病變篩查中的意義探討[J].醫(yī)學(xué)食療與健康，2022，20（3）：45-47.

[3] 黃琳.外泌體 MicroRNA-301在胃癌患者血清中的表達(dá)及臨床意義[J].醫(yī)學(xué)食療與健康，2019（22）：18-19.

[4]? 王靜，谷峰，馬勇杰.Girdin蛋白與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究進(jìn)展[J].中華腫瘤防治雜志，2010，17（3）：233-236.

[5]? Ha A，Polyanovsky A，Avidor-Reiss T. Drosophila hook-related protein （girdin） is essential for sensory endrite formation[J].Genetics，2015，200（4）：1149-1159.

[6]? 尹秀花，曲曉媛，姜平.Girdin蛋白在腫瘤中的作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（6）：873-875.

[7]? Lan Y，Li YJ，Li DJ，et al. Long non-coding RNA MEG3prevents vascular endothelial cell senescence by impairing miR-128-dependent Girdin down-regulation[J].Am J Physiol Cell Physiol，2018，316（6）：C830-C843.

[8]? Lan Y，Li Y，Li D，et al.Engulfment of platelets delaysendothelial cell aging via girdin and its phosphorylation[J]. Int J Mol Med，2018，42（2）：988-997，2018.

[9]? Rahman-Zaman A，Shan S，Reinhart-King CA . CellMigration in Microfabricated 3D Collagen Microtracks is Mediated through the Prometastatic Protein Girdin[J]. Cell Mol Bioeng 2018，11（1）：1-10.

[10]? Wang X，Enomoto A，Weng L，et al. Girdin/GIV regulatescollective cancer cell migration by controlling cell adhesion and cytoskeletal organization[J]. Cancer Sci，2018，109（11）：3643-3656.

[11]? Enomoto A，Murakami H，Asai N，et al. Akt/PKB regulatesactin organization and cell motility via Girdin/APE[J]. Dev Cell，2005，9：389-402.

[12]? Chen C，Atsushi E，Liang W，et al. Complex roles of theactin-binding protein Girdin/GIV in DNA damage-induced apoptosis of cancer cells[J].Cancer science，2020，111（11）：4303-4317.

[13]? Anai M，Shojima N，Katagiri H，et al. A novel proteinkinase B （ PKB ）/AKT-binding protein enhances PKB kinase activity and regulates DNA synthesis. J Biol Chem，2005（280）：18525-18535.

[14]? Wang S，Lei Y，Cai Z，et al . Girdin regulates theproliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells via the PI3K/Akt signalling pathway[J]. Oncol Rep，2018，40（2）：599-608.

[15]? Lu J，Zhang L，Zhou H，et al . Silencing of Girdinsuppresses the malignant behavior of colorectal carcinoma cells[J]. Oncol Rep，2018，40（2）：887-894.