袁橙 樊雪 王永娟 郭長明 董亞青 高曉茜

摘要：蛋雞生產(chǎn)中，雞舍水線的微生物含量是否達(dá)標(biāo)與蛋雞發(fā)病率、產(chǎn)蛋效率、產(chǎn)蛋質(zhì)量等密切相關(guān)。為客觀評價養(yǎng)殖常用消毒劑的消毒效果，合理制訂蛋雞養(yǎng)殖行業(yè)水線消毒程序并進(jìn)行實踐檢驗，選取7類養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的消毒劑進(jìn)行水樣消毒效果檢測，據(jù)此制訂蛋雞場水線消毒方案，并在江蘇省姜堰華杰養(yǎng)殖有限公司雞舍內(nèi)開展水線消毒方案的實施和效果評價。研究發(fā)現(xiàn)，三氯異氰尿酸、溴化二甲基二癸甲基烴銨、過氧化物類消毒劑能有效殺滅水樣內(nèi)所有微生物。使用三氯異氰尿酸粉對蛋雞舍水線的消毒效果研究顯示，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，消毒前雞舍水線菌落總數(shù)及大腸菌群不合格;對比2021年1月和5月兩次實施水線消毒方案的效果評價結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三氯異氰尿酸粉用于蛋雞舍水線消毒效果較好，但在氣溫較高的季節(jié)應(yīng)縮短消毒間隔至2 d內(nèi)，每輪消毒中需重復(fù)用藥3次以上才能取得較好的消毒效果。

關(guān)鍵詞：蛋雞;消毒劑;水線微生物;三氯異氰尿酸

中圖分類號：S831文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2022.03.002

Study on Disinfection Effect of Common Disinfectants on Water Line in Laying Hens farm

YUAN Cheng，F(xiàn)AN Xue，WANG Yongjuan，GUO Changming，DONG Yaqing，GAO Xiaoqian

（Agricultural and Animal Husbandry Science and Technology Vocational College，Taizhou Jiangsu 225300，China）

Abstract：Whether the microbial content of the waterline in the chicken house is up to standard is closely related to the incidence rate of laying hens，laying efficiency and egg quality. In order to objectively evaluate the disinfection effect of commonly used disinfectants in breeding，reasonably formulate the water line disinfection procedure in laying hens breeding industry and carry out practical test，select 7 kinds of disinfectants commonly used in breeding production to test the disinfection effect of water samples，and formulate the water line disinfection scheme of laying hens farm，The implementation and effect evaluation of waterline disinfection scheme were carried out in a hen house of JiangyanHuajie breeding Co.，Ltd.in Jiangsu Province. It is found that trichloroisocyanuric acid，dimethyl decyl methyl ammonium bromide and peroxide disinfectants can effectively kill all microorganisms in water samples. The study on the disinfection effect of trichloroisocyanuric acid powder on the waterline of egg hen house showed that compared with the national standard，the total number of colonies and coliform group of waterline of chicken house before disinfection were unqualified;Compared with the effect evaluation of the waterline disinfection scheme implemented twice in January and may 2021，it is found that trichloroisocyanuric acid powder has a good effect on the waterline disinfection of egg hen houses，but in the season with high temperature，the disinfection interval should be shortened to 2 days，and it needs to be repeated for more than 3 times in each round of disinfection to achieve a good disinfection effect.

Keywords：layer，disinfectant，waterline microorganisms，trichloroisocyanuric acid

0引言

中國的蛋品產(chǎn)量與消費(fèi)量世界第一。據(jù)統(tǒng)計，中國蛋品產(chǎn)量約占全球產(chǎn)量的40%[1]。隨著養(yǎng)殖技術(shù)和設(shè)備的更新發(fā)展，雞場的飲水系統(tǒng)由開放式水槽逐步更新為封閉式水線。水線系統(tǒng)相對于開放式水槽具有較好的密封性，可有效減少環(huán)境中污物的進(jìn)入。但也正因其封閉性，管理人員不易觀察到水線內(nèi)衛(wèi)生狀況，管內(nèi)易形成生物膜且難以清除，造成水線內(nèi)部微生物超標(biāo)[2]，引發(fā)雞體腸道健康問題，降低產(chǎn)蛋效率和質(zhì)量[3]。易產(chǎn)生沙殼蛋和軟殼蛋，還會增加交通運(yùn)輸中雞蛋損耗。研究顯示，有效的水線消毒程序可減少甚至消滅水線內(nèi)的病原微生物，降低雞場傳染性疾病、消化道疾病的發(fā)病率和雞群的死淘率[4]。

2020年5—12月，筆者依托江蘇省蛋雞產(chǎn)業(yè)體系項目通過問卷調(diào)查及采樣檢測等方法，對江蘇省45個蛋雞養(yǎng)殖場的消毒工作進(jìn)行了系統(tǒng)評估。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大部分養(yǎng)殖場并未制訂或堅持定期實施科學(xué)的雞場消毒程序，有些雞場甚至從不進(jìn)行水線消毒，導(dǎo)致蛋雞場水線菌落總數(shù)合格率和大腸菌群合格率僅為41.2%和54.1%，沙門氏菌合格率為85.8%。因此，對酸化劑類、過氧化物類、碘制劑、堿類、氯制劑、醛類和表面活性劑等常用消毒劑的消毒效果進(jìn)行對比研究，篩選出適用于水線微生物消毒的消毒劑，并據(jù)此制訂水線微生物控制技術(shù)熟化方案、檢驗方案在不同氣溫條件下的消毒效果，對于科學(xué)指導(dǎo)雞場開展水線消毒等工作具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料

（1）菌種來源。大腸桿菌菌株由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室保存[5]，沙門氏菌菌株由作者從淮陰、海安等地蛋雞養(yǎng)殖場源頭水、水線水中分離并保存。

（2）主要試劑。結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、菌落總數(shù)測試片、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、大腸菌群測試片、LB液體培養(yǎng)基、平板計數(shù)瓊脂（PCA）均購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司;三氯異氰脲酸粉（有效氯30%，終濃度有效率0.16%）等購自山東中抗藥業(yè)有限公司。引物合成和測序由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司完成;DNA聚合酶等試劑購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1國標(biāo)法和測試片法一致性評價

復(fù)蘇實驗室保存的大腸桿菌甘油菌，參考李亭玉等[6]的方法將細(xì)菌液體培養(yǎng)物進(jìn)行2次離心洗滌，進(jìn)行10^-5、10^-6、10^-7、10^-8梯度稀釋備用，分別用國標(biāo)法和試紙片法計數(shù)。

（1）國標(biāo)法菌落總數(shù)計數(shù)。按照GB4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗》[7]進(jìn)行菌落總數(shù)測定。

（2）國標(biāo)法大腸菌群計數(shù)。按照GB4789.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗》網(wǎng)進(jìn)行大腸菌群測定。

（3）測試片法菌落總數(shù)和大腸菌群計數(shù)。使用菌落總數(shù)測試片和大腸菌群測試片進(jìn)行檢測。揭開測試片表面透明覆蓋薄膜，吸取1 mL稀釋好的大腸桿菌菌液垂直懸空滴加于測試紙片上。樣品充分在測試片上擴(kuò)散后緩緩蓋上上層透明覆膜，將四周氣體排空，檢查膜是否封好。標(biāo)記樣號、時間，等待1 mm讓樣品在培養(yǎng)基中充分?jǐn)U散吸收。測試片的透明面朝上，置于密閉盒子中防止水分蒸發(fā)，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.2.2養(yǎng)殖場消毒劑消毒效果比較

從養(yǎng)殖場獲取酸化劑類、過氧化物類、碘制劑、堿類、氯制劑、醛類和表面活性劑這7類常用消毒劑的商品，在實驗室條件下，按照各商品的使用說明，分別檢測消毒劑對10 mL水樣（菌落總數(shù)1 721 CFU/mL、大腸菌群89 CFU/mL）的消毒效果。

1.2.3雞舍水線消毒程序

雞舍晚上熄燈后放空水線，按水和三氯異氰脲酸粉為180 ：1的質(zhì)量比在水箱中添加消毒劑，并放水充滿水線管道，浸泡過夜。第2 d清晨開燈前放空水線，并用清水反向沖洗水線至少2遍。消毒后96 h （第4 d晚間），重復(fù)以上操作，進(jìn)行下一輪消毒。

1.2.4雞舍水樣采集

1月進(jìn)行產(chǎn)蛋雞舍消毒1輪效果檢測。分別采集未消毒、消毒后第1 d、消毒后第2 d、消毒后第3 d、消毒后第4 d、消毒后第7 d、消毒后第11 d、消毒后第15 d的水樣。

5月進(jìn)行青年雞舍和產(chǎn)蛋雞舍消毒3輪效果檢測。分別采集未消毒、第1次水線消毒后第2 d、第1次水線消毒后第3 d、第2次水線消毒后第1 d、第2次水線消毒后第2 d、第3次水線消毒后第1 d、第3次水線消毒后第2 d的水樣。

采集進(jìn)行試驗雞舍內(nèi)的水箱水、水線前端乳頭水、水線后端乳頭水。具體方法為用無菌離心管抵住乳頭采集水樣，每個采樣點各采集10 mL （n=3），放于4 ℃保存?zhèn)錂z。

1.2.5水線水樣微生物檢測

（1）水樣菌落總數(shù)檢測。對水樣進(jìn)行10倍和100倍稀釋，每個稀釋度做3個重復(fù)，用測試片法檢測。選擇菌落密度適宜的水樣檢測測試片進(jìn)行菌落計數(shù)。將測試片上顯示紅色的菌落記為菌落總數(shù)。結(jié)果判定依據(jù)GB-5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，菌落總數(shù)（CFU/mL）≤100為合格。

（2）水樣大腸菌群檢測。對水樣進(jìn)行10倍和100倍稀釋，每個稀釋度做3個重復(fù)，用測試片法檢測。選擇菌落密度適宜的水樣檢測測試片進(jìn)行菌落計數(shù)。將測試片上顯示藍(lán)色的菌落記為大腸菌群。結(jié)果判定依據(jù)GB- 5749—2006 《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》和世界衛(wèi)生組織《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》第三版，飲用水中總大腸菌群不得檢出。

（3）水樣沙門氏菌檢測。采用PCR法檢測水樣中的沙門氏菌。取50 gL待檢水樣與5 mL緩沖蛋白胨水（BPW）混勻后加入增菌管中，37 ℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后取100 μL菌液，10^-4稀釋后取100 μL稀釋后菌液，涂布于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h。挑取10個疑似沙門菌氏的紫紅色單菌落，接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h。挑取平板上單菌落，接種于3 mLBPW振蕩培養(yǎng)過夜[9]。

從每管培養(yǎng)物中取2 mL菌液離心洗滌，沉淀中加50 μL無菌純水重懸后煮沸15 mm。樣品高速離心后取上清作為PCR檢測模板。根據(jù)文獻(xiàn)[10]合成沙門氏菌16SrDNA特異性片段擴(kuò)增引物，配置PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序為95 ℃作用5 min;95 ℃作用45 s，58 ℃作用30 s，72 ℃作用30 s為1個循環(huán)，共執(zhí)行30個循環(huán);72 ℃作用10 mm。同時設(shè)置沙門氏菌DNA模板陽性對照和無菌純水陰性對照。

運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。陽性對照反應(yīng)產(chǎn)物有152 bp條帶，陰性對照反應(yīng)產(chǎn)物無條帶，試驗成立。此時如檢測樣品反應(yīng)產(chǎn)物中出現(xiàn)152 bp條帶，則判定為沙門氏菌陽性，否則為陰性。依據(jù)GB—5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，沙門氏菌不得檢出。

2結(jié)果

2.1檢測方法的一致性評價結(jié)果

用國標(biāo)法和測試片法分別檢測10^-5、10^-6、10^-7、10^-8稀釋度的大腸桿菌，其中10^-5、10^-6稀釋度多不可計，10^-5、10^-6、10^-7、10^-8稀釋的菌落數(shù)量，見表1。平板法計算得菌落總數(shù)及大腸菌群分別為1.05×10⁹CFU/mL和1.0×10⁹CFU/mL;測試片計算得菌落總數(shù)及大腸菌群分別為1.08×10⁹CFU/mL和1.11×10⁹CFU/mL。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗》推薦的平板法與商品化測試片的檢測出的菌落數(shù)量在計數(shù)誤差范圍內(nèi)，結(jié)果具有一致性，表明測試法亦可用于菌落計數(shù)。

2.2養(yǎng)殖場消毒劑消毒效果比較

7類消毒劑對已知菌落總數(shù)和大腸菌群水樣的消毒效果檢測結(jié)果，見表2。從檢測結(jié)果可以看出酸化劑類產(chǎn)品中，枸櫞酸、DL-蘋果酸無消毒殺菌效果，甲酸鹽、丙酸鹽等鹽可在短時間內(nèi)（30 min）產(chǎn)生較好消毒效果，而其他復(fù)合酸與水作用24 h后雖可抑制微生物生長，但是消毒效果不能達(dá)到100%。三氯異氰尿酸、溴化二甲基二癸甲基烴銨、過氧化物類能在24h內(nèi)完全抑制微生物生長。聚維酮碘、二氯異氰脲酸鈉、醛類、水管疏通劑雖然在24h內(nèi)對水源微生物的抑制率未達(dá)到100%，但是能使微生物指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)。小蘇打（碳酸氫鈉）24 h的消毒作用較弱。同時發(fā)現(xiàn)，不同廠家的消毒劑，雖然標(biāo)注的主要成分相似，但消毒效果并不一致。

2.31月雞舍水線消毒效果

1月產(chǎn)蛋雞舍水線消毒前后均未檢測出沙門氏菌，菌落總數(shù)和大腸菌群檢測結(jié)果檢測結(jié)果，見表3。根據(jù)《水源微生物檢測方案》中微生物判斷標(biāo)準(zhǔn)，在消毒前水線中菌落總數(shù)和大腸菌群均不達(dá)標(biāo);在第1次消毒后水線內(nèi)菌落總數(shù)和大腸菌群均合格;水線前端水樣菌落總數(shù)和大腸菌群第7 d出現(xiàn)增長趨勢;水線后端水樣在第4 d菌落總數(shù)和大腸菌群出現(xiàn)增長趨勢。見圖1和圖2。

2.45月雞舍水線消毒效果

5月水線消毒前后均未檢測出沙門氏菌，菌落總數(shù)和大腸菌群檢測結(jié)果，見表4。根據(jù)前述結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，消毒前水箱內(nèi)的水源菌落總數(shù)和大腸菌群均合格，但是水線內(nèi)菌落總數(shù)及大腸菌群未能全部達(dá)標(biāo)。第1次消毒后各雞舍水線內(nèi)菌落總數(shù)和大腸菌群均合格。第1 次消毒后3 d水樣菌落總數(shù)只有產(chǎn)蛋雞舍前端水線合格，其他均不合格。因大腸菌群在消毒后3 d有明顯的回升，故之后改為每隔2 d進(jìn)行1次消毒，消毒后24 h采集水樣檢測發(fā)現(xiàn)，菌落總數(shù)和大腸菌群除產(chǎn)蛋雞舍后端水樣不合格，其他樣品均合格。消毒前后各雞舍菌落總數(shù)和大腸菌群變化趨勢，見圖3和圖4。

3討論

測試片利用特異性酶與特異性顯色底物反應(yīng)的原理，使目標(biāo)菌與非目標(biāo)菌呈現(xiàn)可明顯區(qū)別的不同特異性顏色[11]，可極大地方便細(xì)菌檢測計數(shù)。兩種方法的一致性評價顯示，測試片法的計數(shù)結(jié)果與國標(biāo)法具有一致性。相比而言，測試片法操作程序更為簡單，可有效降低檢測成本、縮短檢測時間。

對消毒劑消毒效果的比較研究發(fā)現(xiàn)，甲酸鹽、丙酸鹽、三氯異氰尿酸、漠化二甲基二癸甲基烴銨和過氧化物類消毒劑對水樣的消毒效果最好，而現(xiàn)階段養(yǎng)殖生產(chǎn)上流行使用的酸化劑，在本實驗條件下幾乎沒有殺滅大腸桿菌等細(xì)菌的作用。雖然有研究顯示添加飲水型酸化劑可提高蛋雞免疫力、緩解肝臟損傷和腎臟損傷[12]，對增加蛋重、蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度，維持蛋雞輸卵管健康亦有一定的作用[13]，但是本研究的結(jié)果證明酸化劑并無殺菌效果，不適用于水線消毒。

有研究人員檢驗了三氯異氰尿酸對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草桿菌黑色變種芽孢的殺菌效果。發(fā)現(xiàn)當(dāng)三氯異氰尿酸濃度在75 mg/L以上時，可在15 mm內(nèi)殺滅3種細(xì)菌懸液中99.9%以上的菌體[14]。該研究中，三氯異氰尿酸粉消毒水線前后的水樣檢測結(jié)果顯示，5月水線中細(xì)菌滋生速度明顯高于1月，可能與氣溫升高利于微生物繁殖等原因有關(guān)。提示冬季使用三氯異氰尿酸粉按照4 d一個周期進(jìn)行消毒，可有效降低水線微生物數(shù)量，同時抑制水線中微生物的繁殖。5月水線消毒采用1月的消毒方案，出現(xiàn)微生物在第3 d即超標(biāo)的問題。因此，蛋雞養(yǎng)殖中夏季水線消毒頻率要高于冬季，宜縮短消毒間隔至2 ～內(nèi)，消毒中需重復(fù)用藥3次以上以維持消毒效果。

4結(jié)束語

通過使用7種不同的常用消毒劑進(jìn)行水樣消毒檢測，結(jié)果表明，只有三氯異氰尿酸、漠化二甲基二癸甲基烴銨、過氧化物類消毒劑能有效殺滅水樣內(nèi)所有微生物。其中三氯異氰尿酸粉更適用于雞舍水線消毒。篩選并確定了3種有效滅殺蛋雞舍微生物的消毒劑，為產(chǎn)蛋雞舍滅殺微生物，提供科學(xué)數(shù)據(jù)和合理方案。

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