王福鑫 矯筱蔓 趙志龍 史延通

【摘要】目的：發(fā)現(xiàn)潛在可用于保濕功效評(píng)價(jià)體外研究新靶點(diǎn)。方法：通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)收集正常人體皮膚數(shù)據(jù)和因皮膚保濕功能異常引起的與疾病相關(guān)的基因數(shù)據(jù)，利用GEO2R對(duì)兩者基因數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，得到潛在與皮膚保濕相關(guān)的差異基因;再利用STRING關(guān)聯(lián)絲聚蛋白基因（Filaggrin，F(xiàn)LG）與其他差異基因，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO/KEGG富集分析，并將這些基因的生物學(xué)功能與得到的信號(hào)通路關(guān)聯(lián)，闡釋潛在靶基因的現(xiàn)實(shí)意義。結(jié)果：與絲聚蛋白基因強(qiáng)相關(guān)的基因有FGF1、KLK5和CASP14等。結(jié)論：FGF1、KLK5以及CASP14可作為潛在靶點(diǎn)化妝品保濕功效評(píng)價(jià)體外研究，具有進(jìn)一步驗(yàn)證開(kāi)發(fā)的前景。

【關(guān)鍵詞】化妝品;生物信息學(xué);絲聚蛋白;功效評(píng)價(jià)

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2022.03.017

Discovery of Potential New Targets for Moisturizing Efficacy Evaluation of Cosmetics by Bioinformatics

WANG Fu-xin，JIAOXiao-man，ZHAO Zhi-long，SHI Yan-tong

（Liaoning Institute of Drug Control，Shenyang 110036，China）

Abstract：Objective：Aiming to find potential new targets in vitro for moisturizing efficacy evaluation. Methods：Normal human skin gene data and gene data related to diseases caused by abnormal skin moisturizing function were collected through GEO database，the difference analysis between them was analyzed by GEO2R to obtain different genes;STRING was used to associate FLG and differential genes. GO and KEGG enrichment analysis were carried out with GeneCards database. The biological functions of these genes are associated with the obtained signal pathways to explain the practical significance of potential target genes related to skin moisturizing. Results：FGF1，KLK5 and CASP14 genes were strongly related to FLG gene. Conclusion：Potential targets as FGF1 KLK5 and CASP14 are thought to be prospective for the evaluation of moisturizing efficacy of cosmetic study in vitro which are required for further validation and development.

Key words：cosmetic;bioinformatics;Filaggrin;efficacy evaluation

皮膚是人體抵御外界侵襲的第一道屏障。它有助于保護(hù)人體免受細(xì)菌等有害物質(zhì)的侵害。皮膚時(shí)刻都在更新，這樣可維持屏障的保護(hù)功能。然而，各種不利因素會(huì)損害皮膚屏障自我維持和修復(fù)的能力。皮膚的保濕能力尤為重要。由于皮膚老化或環(huán)境因素導(dǎo)致皮膚角質(zhì)層增厚，屏障能力減弱，具體表現(xiàn)為：皮膚干燥，易受感染、刺激和過(guò)敏，以及其他相關(guān)的不良后果，如皮膚病、皮膚癌變等。皮膚需要足夠的水化水平來(lái)維持表皮屏障的完整性和正常的功能活動(dòng)。

支持皮膚水合作用的三個(gè)關(guān)鍵因素包括：天然保濕因子（Natural Mosterizing Factor，NMF）、皮膚脂質(zhì)雙層和透明質(zhì)酸（HA）。三者共同促進(jìn)、維持表皮和皮下結(jié)構(gòu)的保濕功能，以確保皮膚形成健康的屏障。其中，NMF由一組高效的保濕組分組成，這些組分吸引和結(jié)合大氣中的水分，對(duì)角質(zhì)層中的水分保持至關(guān)重要。NMF是Filaggrin在角質(zhì)層淺層轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，F(xiàn)ilaggrin是一種位于角質(zhì)層角細(xì)胞層的大蛋白，分布于胞漿中（如圖1）。FLG基因翻譯表達(dá)的絲聚蛋白前體（Profilaggrin）經(jīng)降解為絲聚蛋白（Filaggrin）。

Filaggrin水解取決于角細(xì)胞內(nèi)的水活性以及外部相對(duì)濕度，并且只能在角細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)狹窄的水活性范圍內(nèi)發(fā)生，如果暴露在紫外線(xiàn)輻射下會(huì)損害Filaggrin，自然降解為NMF的發(fā)生。NMF的成分主要是氨基酸和氨基酸衍生物，如吡咯烷酮竣酸（PCA）、乳酸和尿素。乳酸刺激合成神經(jīng)酰胺，改善預(yù)防與干燥相關(guān)的癥狀;尿素刺激合成神經(jīng)酰胺和水通道蛋白（Aquaporin 3，AQP3）相關(guān)酶的表達(dá)。這也側(cè)面說(shuō)明AQP3與Filaggrin間接相關(guān)。隨著皮膚保濕機(jī)制相關(guān)研究的深入，一些對(duì)AQP3、透明質(zhì)酸合成酶等靶點(diǎn)已被大家熟知，挖掘其背后與FLG及其相關(guān)的基因，對(duì)研究具有保濕功效的化妝品及其原料有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

生物信息學(xué)是一門(mén)利用計(jì)算機(jī)技術(shù)研究生物系統(tǒng)規(guī)律的學(xué)科。隨著生命科學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的迅猛發(fā)展，使用信息學(xué)技術(shù)可在大分子層面理解和組織與生物大分子相關(guān)的信息。利用已有臨床公開(kāi)數(shù)據(jù)，進(jìn)行收集、分析遺傳數(shù)據(jù)，并利用計(jì)算機(jī)技術(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，建立“生物學(xué)現(xiàn)象一尋找靶點(diǎn)一關(guān)聯(lián)聚類(lèi)一生物學(xué)意義”的研究思路，為探索新的化妝品保濕功效體外評(píng)價(jià)方法發(fā)現(xiàn)潛在新靶點(diǎn)。

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1皮膚數(shù)據(jù)的獲取

利用Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以 dermatitis、atoptic dermatitis作為關(guān)鍵詞檢索皮膚數(shù)據(jù)。按照與皮膚失水相關(guān)因素進(jìn)行篩選，選擇芯片數(shù)據(jù)GSE32924中的樣本進(jìn)行分析，把選擇的樣本分為兩組：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（皮膚異常組）。數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。

1.2差異分析

將GSE32924的選擇樣本導(dǎo)入GEO2R差異表達(dá)分析軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）進(jìn)行差異分析，得到的數(shù)據(jù)與FLG相關(guān)聯(lián)基因用Excel整理后，利用Prism 9.0軟件進(jìn)行火山圖和熱圖的分析，得到差異基因若干。

1.3交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以FLG基因?yàn)榘悬c(diǎn)，在GeneCards（https：//www.genecards.org/）上查詢(xún)其已知的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖，借用STRING分析得到FLG的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

1.4GO/KEGG通路富集分析

GO富集分析通過(guò)GeneCards，得到潛在作用靶點(diǎn)（FLG的交互網(wǎng)絡(luò)得到的相關(guān)基因）的GO富集結(jié)果，明確潛在靶基因所參與調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞構(gòu)成及分子功能。

2結(jié)果

2.1差異基因分析

將GEO收集到的皮膚數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)GEO2R差異分析后，按照p值由小到大順序排列，其升高降低的基因見(jiàn)圖2，之后把前45個(gè)p值差異顯著的基因列出備選。

2.2交互網(wǎng)絡(luò)

由于此前FLG在皮膚水合起到重要作用，因此，采用STRING的交互網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，如圖3。

該交互網(wǎng)絡(luò)與此前GEO2R的差異分析進(jìn)行綜合比對(duì)，把與皮膚保濕相關(guān)的靶基因一起進(jìn)行熱圖分析后發(fā)現(xiàn)，GEO2R差異分析得到的前45個(gè)基因（按p值從小到大排序）與FLG密切相關(guān)的基因（取經(jīng)篩選有相關(guān)生物學(xué)意義的基因：KLK5，F(xiàn)GF1和CASP14）相比，后者的在兩組樣品對(duì)比中有較大差異，如圖4。

2.3GO/KEGG通路富集分析

研究使用GeneCards檢索由差異分析及交互網(wǎng)絡(luò)得到潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，包括：生物學(xué)過(guò)程（Biological Process，BP）、細(xì)胞構(gòu)成（Cellular Component，CC）以及分子功能（Molecular Function，MF），以闡釋這些潛在靶點(diǎn)參與生命過(guò)程。結(jié)果顯示：這些潛在靶點(diǎn)主要通過(guò)參與人體多細(xì)胞生物發(fā)育（Multicellular Organism Development）、角質(zhì)形成細(xì)胞分化（Keratinocyte Differentiation）、皮膚屏障的建立（Establishment of Skin Barrier）、角質(zhì)化（Cornification）等生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮作用。在細(xì)胞構(gòu)成方面主要與細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）有關(guān)。分子功能方面主要涉及肽交聯(lián)（Peptide cross-linking）等。由KEGG通路富集分析，獲得FLG及相關(guān)靶基因交互關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路10條（見(jiàn)表1）。結(jié)果顯示：FLG 及其關(guān)聯(lián)的基因?qū)ζつw保濕效果影響顯著的信號(hào)通路為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)（Regulation of actin cytoskeleton）、FGFR1 在疾病中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signaling by FGFR1 in disease）和MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）等。

3討論

FGF1被稱(chēng)為修復(fù)之王，它在人體內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中高選擇性表達(dá)。該基因編碼的蛋白質(zhì)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）家族的成員（見(jiàn)圖5）。FGF家族成員參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)生、組織修復(fù)、腫瘤生長(zhǎng)和侵襲等。

現(xiàn)階段對(duì)FGF1的研究表明，F(xiàn)GF1具有很強(qiáng)的修復(fù)作用。它能主動(dòng)與傷口附近細(xì)胞膜上的特異性受體相結(jié)合，從而激活蛋白酶，加快蛋白質(zhì)的合成，促合皮膚和黏膜創(chuàng)面愈合并減少疤痕收縮和皮膚的畸形增生，快速高效修復(fù)受損皮膚。FGF1還可通過(guò)提高機(jī)體細(xì)胞免疫活性，抑制局部炎癥發(fā)生。這對(duì)抑制粉刺生長(zhǎng)，保護(hù)皮膚免受不良環(huán)境因素的損傷十分有益。不僅如此，F(xiàn)GF1還可促進(jìn)表皮成纖維細(xì)胞的分裂，加速合成膠原纖維、彈性纖維和HA等，對(duì)改善皮膚細(xì)胞萎縮、補(bǔ)充水分效果顯著。FGF1也可促進(jìn)堵塞或消失的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞新生、皮膚血管網(wǎng)增多、血流增加、增加皮膚營(yíng)養(yǎng)輸送。組織激肽釋放酶5（Kallikrein 5，KLK5），是絲氨酸蛋白酶的一個(gè)亞類(lèi)，具有多種生理功能（見(jiàn)圖6）。

絲氨酸蛋白酶與Profilaggrin共同存在于顆粒層，由板層顆粒分泌。KLK5在Filaggrin的生成方面起著重要作用。KLK5可水解Profilaggrin生成Filaggrin，進(jìn)而產(chǎn)生由Filaggrin引發(fā)的皮膚的多種生物學(xué)效應(yīng)。CASP14即Caspase-14，是指CED-3半胱氨酸蛋白酶家族（見(jiàn)圖7）。Caspase-14是表達(dá)在表皮層的蛋白酶，負(fù)責(zé)在表皮上層集中角蛋白和其他蛋白質(zhì)等形成角質(zhì)層。Caspase-14可降解Filaggrin為NMF、tUCA、PCA等小分子物質(zhì)。如果缺失Caspase-14那么人的皮膚會(huì)出現(xiàn)角質(zhì)層缺陷，容易失水，也更容易受到紫外線(xiàn)損傷。

本研究創(chuàng)新性地利用生物信息學(xué)為工具，篩選化妝品功效評(píng)價(jià)體外研究新靶點(diǎn)。后續(xù)研究可繼續(xù)圍繞以上三個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路及表達(dá)水平的體外試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及驗(yàn)證，以構(gòu)建完整的相關(guān)評(píng)價(jià)方法并開(kāi)展實(shí)際應(yīng)用，對(duì)化妝品其他功效評(píng)價(jià)研究也可利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行開(kāi)發(fā)驗(yàn)證以得到新的靶點(diǎn)。

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