張新 向俊 唐文杰 ?康紹英 胡小軍

摘 要：為解決富含膠原蛋白肉制品亞硝酸鹽檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的樣液混濁、難以過(guò)濾、實(shí)驗(yàn)回收率低等問(wèn)題，本方法引入木瓜蛋白酶對(duì)富含膠原蛋白肉制品進(jìn)行分解，通過(guò)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本方法加標(biāo)回收率在93.6%～97.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在1.7%～4.1%。方法的改進(jìn)有效地解決了該類食品的亞硝酸鹽檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的困擾，極大地提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

關(guān)鍵詞：膠原蛋白;肉制品;亞硝酸鹽;木瓜蛋白酶

Improved Detection Method of Nitrite in Collagen-Rich Meat Products

ZHANG Xin1，2， XIANG Jun1，2， TANG Wenjie1，2， KANG Shaoying1，2， HU Xiaojun1，2

（1.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Safety Monitoring and Early Warning， Changsha 410007， China; 2.Hunan Provincial Institute of Produce and Goods Quality Inspection， Changsha 410007， China）

Abstract： In order to solve the problems of turbidity of sample solution， difficult to filter and low experimental recovery in the detection process of collagen-rich meat products， papain was introduced in this method to decomposed collagen-rich meat products. The results were found by standard test and precision test： the recoveries were 93.6%～97.8%， and the relative standard deviations were 1.7%～4.1%. The improvement of the method effectively solved the trouble in the process of nitrite detection of this kind of food， and greatly improved the accuracy of detection.

Keywords： collagen; meat products; nitrite; papain

膠原蛋白為細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，具有良好的延伸性能[1]，主要?dú)w結(jié)于其含有一個(gè)或者多個(gè)由α-鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)還含有少量的葡萄糖和半乳糖。膠原蛋白在皮膚組織細(xì)胞中主要承擔(dān)儲(chǔ)水功能，保持皮膚的細(xì)嫩度，柔軟度及彈性度的生理功能[2-4]。近幾年，隨著人們生活品質(zhì)的提高和對(duì)健康的重視，富含膠原蛋白的肉制品越來(lái)越受到大家的青睞。在肉制品中加入亞硝酸鹽可以起到護(hù)色及防腐作用，但亞硝酸鹽可與血紅蛋白結(jié)合，生成高鐵血紅蛋白，使紅細(xì)胞運(yùn)輸氧的能力減弱，對(duì)人體造成危害，因此肉制品中亞硝酸鹽含量是每年國(guó)家抽檢的重點(diǎn)檢測(cè)項(xiàng)目，成人亞硝酸鹽中毒的劑量為0.3～0.5 g，亞硝酸鹽攝入量超過(guò)3.0 g會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的致死風(fēng)險(xiǎn)[5]。GB 2762—2017 規(guī)定，肉制品中亞硝酸鹽的限量值為30 mg/kg。有研究表明，長(zhǎng)期過(guò)量食用富含亞硝酸鹽的食品可能誘發(fā)高鐵血紅蛋白癥，同時(shí)還會(huì)增加患癌癥風(fēng)險(xiǎn)[6-9]。

目前亞硝酸鹽的檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為GB 5009.33—2016，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，樣品進(jìn)行前處理時(shí)需要進(jìn)行加熱，此時(shí)富含膠原蛋白的肉制品往往會(huì)出現(xiàn)溶液混濁、難以過(guò)濾、實(shí)驗(yàn)回收率低等現(xiàn)象。因此，很有必要對(duì)該類產(chǎn)品亞硝酸鹽的測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)。邵明華[10]通過(guò)先定性篩選，再定量檢測(cè)的方法對(duì)國(guó)標(biāo)法進(jìn)行了改進(jìn)，能一定程度上減少檢驗(yàn)時(shí)間，提高檢驗(yàn)員工作效率，但是該方法容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象，導(dǎo)致漏檢事故發(fā)生;同時(shí)樣品本身顏色較深時(shí)對(duì)定性結(jié)果也存在一定干擾。木瓜蛋白酶屬于一種半胱氨酸蛋白水解酶，具有良好的穩(wěn)定性和很強(qiáng)的蛋白水解能力，可以從番木瓜及其根莖中提取得到。它可以通過(guò)切割氨基酸的肽鍵的方式改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，從而有效降低蛋白質(zhì)的分子量[11-14]。本方法利用木瓜蛋白酶對(duì)膠原蛋白良好的分解作用，對(duì)膠原蛋白進(jìn)行分解處理，從而有效解決該類產(chǎn)品亞硝酸鹽測(cè)定過(guò)程中存在的難題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5種富含膠原蛋白的不同食品：樣A為香辣豬腳;樣B為鹵雞爪;樣C為臘豬臉;樣D為鹵鴨掌;樣E為五香豬皮，以上樣品均為市場(chǎng)上購(gòu)買。

木瓜蛋白酶（酶活力≥3 700 U/g）、硼酸鈉、亞鐵氰化鉀、鹽酸、鹽酸萘乙二胺、對(duì)氨基苯磺酸、乙酸鋅和亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液。所用試劑均為分析純，所用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

萬(wàn)分之一電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司;DZKW-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（T9CS），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g均勻試樣于錐形瓶中，再加入0.1 g木瓜蛋白酶，同時(shí)加12.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液，加入大約150 mL、70 ℃左右的超純水，手動(dòng)搖勻后放置沸水浴中加熱15 min。取出冷卻至室溫，將樣液全部轉(zhuǎn)移到200 mL容量瓶中，分別加入5 mL?106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和5 mL 220 g/L乙酸鋅溶液，最后用超純水定容。靜置30 min后用濾紙過(guò)濾，初濾液30 mL棄去不用，后面濾液備用。同時(shí)按照GB 5009.33—2016準(zhǔn)確稱取5 g均勻試樣于錐形瓶中，加12.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液，加大約150 mL、70 ℃左右的超純水，混勻，于沸水中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻，并放置至室溫。定量轉(zhuǎn)移上述提取液至200 mL容量瓶中，加入5 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5 mL 220 g/L乙酸鋅溶液。加水至刻度，搖勻，放置30 min后用濾紙過(guò)濾，棄去初濾液30 mL，濾液備用。相較于國(guó)標(biāo)法，本法前處理加入了木瓜蛋白酶對(duì)樣品中膠原蛋白進(jìn)行酶解。

1.3.2 亞硝酸鹽的測(cè)定

于50 mL具塞比色管中準(zhǔn)確吸取40.0 mL前處理好的濾液，同時(shí)另外準(zhǔn)確吸取相當(dāng)于0 μg、1.0 μg、2.0 μg、3.0 μg、4.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg和12.5 μg的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別置于50 mL具塞比色管中。將2 mL 4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液分別加入標(biāo)準(zhǔn)管與試樣管中，混勻，靜置5 min后各加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液。定容搖勻，靜置15 min。在波長(zhǎng)538 nm處用1 cm比色杯測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)液和樣液的吸光度，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到樣液濃度。同時(shí)做試劑空白。

2 結(jié)果與分析

2.1 本方法與國(guó)標(biāo)法前處理樣液吸光度對(duì)比

對(duì)樣A、樣B、樣C、樣D和樣E分別按國(guó)標(biāo)GB 5009.33—2016和本方法進(jìn)行前處理。將處理的樣液于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)吸光度，所測(cè)結(jié)果如表1所示。本方法處理的樣液吸光度明顯小于國(guó)標(biāo)法處理的樣液，國(guó)標(biāo)法處理的樣液混濁，而本方法處理的樣液明顯澄清透明，其原因在于富含膠原蛋白樣品受熱再冷卻溶液發(fā)生團(tuán)聚，造成樣液混濁，從而導(dǎo)致吸光度偏高，給后期亞硝酸鹽的測(cè)定造成偏高的影響。而本方法加入木瓜蛋白酶后膠原蛋白被酶解，樣液變得澄清，便于樣液亞硝酸鹽的測(cè)定，有利于實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度的提高。

2.2 本方法與國(guó)標(biāo)法加標(biāo)回收率對(duì)比

分別稱取5 g樣A、樣B、樣C、樣D和樣E，同時(shí)用本方法和國(guó)標(biāo)法分別加入方法測(cè)定低限（1 mg/kg）、2倍方法測(cè)定低限、10倍方法測(cè)定低限的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，做6次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，其結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，本方法加標(biāo)回收率在93.6%～97.8%，具有良好的準(zhǔn)確度。同時(shí)，本方法回收率明顯較國(guó)標(biāo)法好，其原因在于國(guó)標(biāo)法前處理時(shí)富含膠原蛋白的樣品會(huì)出現(xiàn)團(tuán)聚包覆，不利于亞硝酸鹽的有效提取，造成加標(biāo)回收率明顯偏低。本方法通過(guò)加入木瓜蛋白酶對(duì)樣品進(jìn)行酶解，避免了團(tuán)聚的發(fā)生，使得樣品澄清透明，便于提取，回收率及準(zhǔn)確度得到有效提升。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

分別稱取5.000 0 g樣A、樣B、樣C、樣D和樣E，采用本方法進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表3所示。經(jīng)過(guò)6次平行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)RSD在1.7%～4.1%，小于5.3%，滿足實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求，該方法具有良好的精密度。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了富含膠原蛋白肉制品亞硝酸鹽測(cè)定的前處理，通過(guò)木瓜蛋白酶的加入，水解膠原蛋白，有效地解決了該類產(chǎn)品樣液混濁，回收率低的檢測(cè)困擾。本方法加標(biāo)回收率在93.6%～97.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～4.1%，小于5.3%，該方法可以有效提高該類產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

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基金項(xiàng)目：食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（2020KFJJ11）。

作者簡(jiǎn)介：張新（1984—），男，湖南邵陽(yáng)人，碩士，工程師。研究方向：食品檢驗(yàn)與安全研究。