羅達(dá)龍 王華 覃藍(lán) 蔣德莉 文俊萍 楊梓瑩 宋妤

摘 要：目的：利用紫外分光光度法對六堡茶中茶色素含量進(jìn)行測定。方法：取多個(gè)不同批次等級1級的六堡茶樣品混合后制備茶色素對照品，通過頂空-氣相色譜質(zhì)譜法檢測殘留溶劑的量來進(jìn)行茶色素的純度標(biāo)定，并利用標(biāo)定的茶色素對照品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過測定不同六堡茶樣品的吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算出不同六堡茶樣品中茶色素的含量。結(jié)果：本方法重復(fù)性試驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～4.2%;當(dāng)加標(biāo)濃度為0.5%～15.0%時(shí)，回收率為92.6%～106.2%;在濃度為25.66～128.30 μg·mL-1時(shí)線性相關(guān)系數(shù)良好，r=0.997。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、可靠，適用于六堡茶中茶色素含量的測定。

關(guān)鍵詞：六堡茶;茶色素;頂空-氣相色譜質(zhì)譜法;紫外分光光度法

Determination of Tea Pigments in Liupao Tea

LUO Dalong1，3， WANG Hua1*， QIN Lan1， JIANG Deli1， Wen Junping1， YANG Ziying1， SONG Yu2，3

（1.Wuzhou Institute for Food and Drug Control， Wuzhou 543000， China; 2.Wuzhou Tianyu Tea Industry Co.， Ltd.， Wuzhou 543000， China; 3.Guangxi Engineering Research Center of Instant Liupao Tea， Wuzhou 543000， China）

Abstract： Objective： To establish a ultraviolet spectrophotometry method for the tea pigments content in Liupao tea. Method： Mix multiple batches grade one Liupao tea samples which take as tea pigments reference substance， headspace-gas chromatography-mass spectrometry （HS-GC-MS） method was used to detect the residual solvent for calibrating the purity of tea pigments， then the standard curve was drawn against tea pigments standard which was calibrated. Through the detection of the absorbance of different Liupao tea samples， tea pigments calculate by standard curve method. Result： The relative standard deviations of reproducibility test of the methods were 2.3%～4.2%; when the spiked concentrations were 0.5%～15.0%， recovery rates were 92.6%～106.2%; when the concentration ranged from 25.66 μg·mL-1 to 128.30 μg·mL-1， the linear correlation coefficient was good， r=0.997. Conclusion： This method is accurate， reliable， which is suitable for the determination of tea pigments in Liupao tea.

Keywords： Liupao tea; tea pigments; headspace-gas chromatography-mass spectrometry; ultraviolet spectrophotometry

六堡茶是具有獨(dú)特檳榔香氣的黑茶品種，屬于后發(fā)酵茶。六堡茶湯色紅濃明亮，口感醇和爽滑，香氣純陳，具有越陳越香的特性。貯存年份對六堡茶的品質(zhì)以及茶葉中茶多酚、氨基酸、茶黃素、茶紅素和茶褐素等內(nèi)含成分都會產(chǎn)生影響[1-5]。茶色素是茶葉體內(nèi)具有生物活性的一系列天然色素的總稱，主要由水溶性色素和脂溶性色素組成。六堡茶含有兒茶素、氨基酸、咖啡堿、維生素等生物活性物質(zhì)，不同陳化時(shí)間的六堡茶中茶褐素含量在9.49%～16.29%。隨著陳化時(shí)間的增加，六堡中茶色素含量逐漸增加，且增加明顯。

目前只有《紅茶中茶紅素和茶褐素含量的測定 分光光度法》（NY/T 3675—2020）進(jìn)行紅茶中茶褐素的測定，而紅茶的基質(zhì)與六堡茶差異較大，標(biāo)準(zhǔn)中的羅勃茲經(jīng)驗(yàn)系數(shù)不適用于六堡茶中茶色素的測定，得到的結(jié)果與實(shí)際情況相差較大，不能準(zhǔn)確獲得六堡茶中茶色素含量。六堡茶在降糖、降脂、抗氧化方面有一定功效，而茶色素在這些功效中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，故建立一種能對六堡茶中茶色素進(jìn)行定量測定的方法尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用該方法分析10個(gè)不同批次的六堡茶中茶色素含量，該方法的重復(fù)性、回收率、線性關(guān)系、靈敏度均較好，適用于六堡茶中茶色素含量的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六堡茶樣品均來源于廣西。

無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;乙酸乙酯（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;二甲基亞砜（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)ELGA PURELAB Classic UVF凈化系統(tǒng)制備的去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2450紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）;GC 7890B-7000C配備7697A頂空進(jìn)樣器氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）;EZ-2平行濃縮儀（英國Genevac公司）;PURELAB Classic UVF超純水機(jī)（英國ELGA公司）;XA205DU電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;3K15高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）;FD115鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱（德國Binder公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶色素對照品制備

取30批經(jīng)過評茶師評定等級為1級的六堡茶樣品，各批次稱取150 g，混合得到標(biāo)準(zhǔn)六堡茶樣品，隨后將該標(biāo)準(zhǔn)六堡茶樣品與沸水按1∶10的比例進(jìn)行浸泡，并在沸水浴中密封提取40 min，提取2次。使用紗布趁熱過濾提取后茶湯（過濾接收容器放置于冰浴中），收集到的茶湯使用平衡濃縮儀濃縮后得標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液。向標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液加入無水乙醇試劑，加入無水乙醇的量占溶液總量的90%，混合均勻后放置到4 ℃冰箱靜置3 h，9 000 r·min-1下4 ℃冷凍離心15 min，得到沉淀物1。向沉淀物1加入乙酸乙酯試劑，加入乙酸乙酯的量占溶液總量的90%，混合均勻后放置到4 ℃冰箱靜置3 h，9 000 r·min-1下4 ℃冷凍離心15 min，得到沉淀物2。沉淀物2在（65±2）℃烘箱下烘干1.5 h，得到茶色素粗品。取茶色素粗品5 g，用超純水溶解至100 mL，通過濾膜（>50 000 Da的濾膜），再使用冷凍干燥得到茶褐素精品，作為茶色素對照品。

采用頂空-氣相色譜質(zhì)譜法（Headspace-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-GC-MS）對茶色素對照品中的殘留溶劑乙醇、乙酸乙酯進(jìn)行測定，使用公式[純度=100%-殘留溶劑含量（%）]計(jì)算出對照品的純度，以完成茶色素對照品純度的標(biāo)定，茶色素對照品需避光密封保存在2～8 ℃冰箱。

1.3.2 茶色素對照品中乙醇、乙酸乙酯殘留溶劑測定

（1）色譜條件。DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;進(jìn)樣口溫度：250 ℃;分流比：20∶1;色譜柱溫度：初始溫度40 ℃，保持時(shí)間5 min，以20 ℃·min-1升至200 ℃，保持時(shí)間3 min，以60 ℃·min-1升至240 ℃，保持時(shí)間1 min;柱流量：1.2 mL·min-1。

（2）質(zhì)譜條件。離子源溫度：230 ℃;電子能量;70 eV;選擇離子檢測（SIM）;乙醇離子質(zhì)荷比：30、31、45、46;乙酸乙酯離子質(zhì)荷比：43、45、61、70和88;頂空進(jìn)樣器加熱箱溫度：90 ℃;定量環(huán)溫度：100 ℃;傳輸線溫度：120 ℃;樣品瓶平衡時(shí)間：15 min;進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間：0.5 min。

（3）供試樣品制備。精密稱取茶色素對照品0.50 g，置5 mL容量瓶，加水溶解并定容至刻度，搖勻，吸取3.00 mL到20 mL頂空瓶內(nèi)，待測定。

（4）對照品溶液配制。精密稱取無水乙醇、乙酸乙酯試劑各1.00 g，置100 mL容量瓶（容量瓶內(nèi)預(yù)先加入二甲基亞砜試劑80 mL），用二甲基亞砜試劑溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。吸取對照品儲備液0.10 mL置于5 mL容量瓶，加水溶解并定容至刻度，搖勻，吸取3.00 mL到20 mL頂空瓶內(nèi)，待測定。

1.3.3 六堡茶樣品前處理

精密稱取10個(gè)不同批次六堡茶樣品各5.00 g，加入沸水（由超純水煮沸得到）250 mL，攪拌均勻后在沸水浴中密封提取40 min，溶液趁熱過濾（過濾接收容器放置于冰浴中）后放至室溫，向?yàn)V液中加入無水乙醇試劑，加入無水乙醇的量占溶液總量的90%，混合均勻，4 ℃冰箱靜置3 h，在9 000 r·min-1下4 ℃冷凍離心15 min，得到沉淀物。將沉淀物用水溶解，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，精密吸取上述稀釋液0.50 mL到50 mL容量瓶，用水定容至刻度，搖勻，得到樣品待測溶液。

1.3.4 六堡茶樣品測定

樣品待測溶液使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，測定波長為280 nm±2 nm，比色皿厚度1 cm，以超純水作為空白調(diào)零，測定樣品吸光度。樣品中茶褐素吸光度應(yīng)落在0.1～0.7，如吸光度過高需對樣品作進(jìn)一步稀釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

取1.3.1項(xiàng)下對照品，精密稱定，加水稀釋成濃度約1 000 μg·mL-1，作為儲備液。分別精密吸取該儲備液0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL和1.25 mL至10 mL容量瓶中，并1.3.4項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。以濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（x），吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求得回歸方程為A=0.004 97x+0.027 45，茶色素標(biāo)準(zhǔn)曲線在25.66～128.30 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.997。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取10個(gè)不同批次的六堡茶樣品，每個(gè)批次稱取6份，每份5.00 g，精密稱定，按1.3.3項(xiàng)下方法提取供試品溶液，1.3.4項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，測得10個(gè)不同批次六堡茶樣品茶色素的平均含量在9.7%～14.2%，RSD分別為2.3%～4.2%，試驗(yàn)表明該提取方法重復(fù)性良好，結(jié)果見表1。

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取已測定含量的六堡茶樣品，分別加入相當(dāng)于樣品中茶色素含量的0.5%、5.0%、15.0%對照品，每個(gè)級別進(jìn)行3次加標(biāo)試驗(yàn)。按1.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.3.4項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，計(jì)算加標(biāo)回收率。加標(biāo)量在0.5%～15.0%時(shí)，平均回收率為92.6%～106.2%，結(jié)果見表2。

2.4 定量限試驗(yàn)

在空白溶液中精密加入適量1.3.1項(xiàng)下對照品，按1.3.3項(xiàng)下方法提取供試品溶液，1.3.4項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，茶色素吸光度應(yīng)落在0.1～0.7，并以吸光度值最低點(diǎn)濃度作為定量限，得到該方法中茶色素的定量限為0.5%。

2.5 樣品測定結(jié)果

10個(gè)不同批次的六堡茶樣品茶色素含量為9.7%～14.2%，結(jié)果見表3。

3 結(jié)論與討論

本方法通過使用頂空-氣質(zhì)色譜質(zhì)譜法對純化過程中的殘留溶劑進(jìn)行測定，來標(biāo)定茶色素的純度。頂空-氣相色譜質(zhì)譜法對于殘留溶劑的檢測比氣相色譜法靈敏度更高，且質(zhì)譜抗干擾能力更強(qiáng)，使用質(zhì)荷比進(jìn)行定性可以排除在氣相色譜法法中由于色譜峰的干擾而導(dǎo)致的檢測目標(biāo)物檢測不到的因素。頂空-氣相色譜質(zhì)譜法使用頂空進(jìn)樣器進(jìn)樣，設(shè)定加熱箱溫度只在殘留物的沸點(diǎn)以上，可保證其余高于該沸點(diǎn)的物質(zhì)不被揮發(fā)，不進(jìn)到檢測系統(tǒng)，進(jìn)而減少污染。得到茶色素對照品后該對照品用于檢測六堡茶中茶褐素，在基質(zhì)上對照品的來源為六堡茶，使用同樣基質(zhì)來源的對照品進(jìn)行檢測能進(jìn)一步排除由于基質(zhì)不同而影響測定結(jié)果的因素。

通過該方法制備茶色素對照品，對六堡茶樣品中的茶色素進(jìn)行測定，重復(fù)性、回收率、線性關(guān)系和靈敏度都較好，適用于六堡茶中茶色素含量的測定。

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