袁霞 劉方慶 文隴英 徐婧 廖光祥 王強(qiáng)勝 王湘

（西南山地瀕危鳥(niǎo)類(lèi)保護(hù)四川省高等院校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/樂(lè)山師范學(xué)院，四川樂(lè)山 614000）

摘 要 峨眉黑雞（Gallus gallus）為原雞屬紅原雞種的一個(gè)地方亞種，肉蛋兼用型品種，不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還兼有藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值，是四川峨眉山地區(qū)養(yǎng)殖數(shù)量較多的特有的黑雞優(yōu)秀品種。為了給峨眉黑雞種質(zhì)資源的科學(xué)保存和可持續(xù)性利用提供一定的理論依據(jù)，采集峨眉山地區(qū)三個(gè)地點(diǎn)的峨眉黑雞各7只，以線粒體基因Cytb和COI作為分子標(biāo)記，分析種群的遺傳多樣性特征與種群遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，不同采樣點(diǎn)的峨眉黑雞遺傳多樣性存在差異，峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場(chǎng)的種群具有較高的單倍型多樣性（Hd=0.905），峨眉山市遠(yuǎn)大林下放養(yǎng)雞場(chǎng)的種群序列核苷酸平均配對(duì)差異最高（K=5.047 62）。通過(guò)分析認(rèn)為，峨眉黑雞的遺傳多樣性并不豐富，建議加強(qiáng)對(duì)峨眉黑雞種質(zhì)資源的保護(hù)，保持這一品種的特征性不丟失。

關(guān)鍵詞 峨眉黑雞（Gallus gallus）；遺傳多樣性；系統(tǒng)進(jìn)化；線粒體基因；四川省峨眉山市

中圖分類(lèi)號(hào)：S831；Q311+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.19.001

生物多樣性由遺傳多樣性、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性三個(gè)部分組成，既包括生物個(gè)體及其攜帶的遺傳信息，也包括它們與生態(tài)環(huán)境所組成的生態(tài)系統(tǒng)，以及各組分間的相互聯(lián)系[1]。遺傳多樣性可以作為進(jìn)一步分析生物個(gè)體在遺傳進(jìn)化方面的潛能和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力等各方面特征的重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)之一[2]。一個(gè)地區(qū)的物種遺傳多樣性越豐富，該物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，在生存和進(jìn)化方面也具有更大的優(yōu)勢(shì)[3]。

地方家禽種質(zhì)遺傳資源是畜禽遺傳多樣性的重要組成部分，是對(duì)地方禽類(lèi)進(jìn)行品種改良和可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用的重要依據(jù)[4]。隨著國(guó)內(nèi)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，引進(jìn)外來(lái)種類(lèi)（品種）逐漸增多；這些外來(lái)優(yōu)良資源在豐富當(dāng)?shù)匦笄萜贩N資源的同時(shí)，也會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)卦行笄萜贩N資源多樣性的保護(hù)造成沖擊和破壞[5]。例如我國(guó)本土豬在大量引進(jìn)進(jìn)口白豬的情況下，面臨著逐年減少甚至滅絕的情況[6-7]。地方品種雖然在生產(chǎn)性能方面比不上引進(jìn)品種，但其優(yōu)良的肉質(zhì)品質(zhì)和獨(dú)特的風(fēng)味遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于引進(jìn)品種，尤其是我國(guó)地方禽畜品種資源在遺傳育種方面還可能具有較高的研究利用價(jià)值[8]。通過(guò)研究家禽的遺傳結(jié)構(gòu)多樣性和家禽群體遺傳距離可以初步查明家禽各種類(lèi)型間的共同起源歷史及親緣關(guān)系，對(duì)合理地使用資源及有效保存家禽地方品種資源、建立優(yōu)良基因庫(kù)有著重要的參考意義，是家禽遺傳資源管理中的重要環(huán)節(jié)[9]。

峨眉黑雞（Gallus gallus）為原雞屬紅原雞種的一個(gè)地方亞種，是一種肉蛋兼用型品種，不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還兼有藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值，是四川峨眉山地區(qū)養(yǎng)殖數(shù)量較多的黑雞優(yōu)秀品種；屬于四川山地烏雞的兩大品系之一[10]。峨眉黑雞主要分布在峨眉山市的龍池、大為、龍門(mén)，樂(lè)山市沙灣區(qū)的范店、軫溪及峨邊縣的毛坪、共和等鄉(xiāng)鎮(zhèn)；主產(chǎn)區(qū)為峨眉山西南大渡河沿岸的三縣交界處[11]。

峨眉黑雞全基因組重測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了遺傳進(jìn)化分析及重要性狀候選基因的預(yù)測(cè)[12]，但針對(duì)其遺傳多樣性及品種形成的歷史研究?jī)?nèi)容還較少。目前，以mtDNA序列為分子標(biāo)記運(yùn)用DNA直接測(cè)序的方法，研究家禽遺傳多樣性[13-18]和系統(tǒng)分化[19-22]及起源的研究報(bào)道越來(lái)越多。本研究通過(guò)以峨眉山特有雞種峨眉黑雞作為研究對(duì)象，以線粒體DNA細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（cytochromecoxidase I， COI）和細(xì)胞色素b（cytochromeb）兩個(gè)基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，通過(guò)采集三個(gè)地點(diǎn)的峨眉黑雞群體樣本，分析種群遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，為峨眉黑雞種質(zhì)資源的科學(xué)保存和可持續(xù)性利用提供一定的理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 樣品采集及DNA提取

1.1.1? 樣品采集

21只峨眉黑雞分別來(lái)自峨眉山市三個(gè)的雞場(chǎng)：峨眉山市世海黑雞原種雞場(chǎng)（E1），峨眉山市遠(yuǎn)大林下放養(yǎng)雞場(chǎng)（E2），峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場(chǎng)（E3）。樣品編號(hào)見(jiàn)表1。所有個(gè)體用含有20 μL抗凝血?jiǎng)‥DTA和0.75%生理鹽水按3%～4%比例配制而成）的抗凝管進(jìn)行翅下靜脈采血，采樣體積為0.3 mL，放置于-20 ℃冰箱保存。

1.1.2? DNA提取

使用天根組織/血液試劑盒（北京天根）提取基因組上的DNA序列[22]。

1.2? 引物信息及PCR擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[23]選取合適的引物（見(jiàn)表2）。線粒體DNA 中的Cytb基因擴(kuò)增引物為Cytb-H16064、Cytb-L14731，線粒體DNA中的COI基因擴(kuò)增引物為COI-L6615、COI-H7956；其中L表示輕鏈，H表示重鏈；序列的順序均為5′—3′方向。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

以提取的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括模板DNA 2 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA聚合酶（Taq酶）12.5 μL（含dNTP、Mg2+、Buffer緩沖液）、上下游引物各1 μL，反應(yīng)體系在Easycycler Gradient 96型與SelectCycler Ⅱ型PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)[24]。

PCR反應(yīng)要求：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，45～46 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹24]。

1.3? PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化與測(cè)序

將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物取4～5 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[24]，將擴(kuò)增成功的產(chǎn)物和相應(yīng)的引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司（成都分公司）進(jìn)行分離純化和雙向測(cè)序。

1.4? 數(shù)據(jù)分析

1）將獲得的DNA雙向測(cè)序數(shù)據(jù)根據(jù)峰圖人工校對(duì)測(cè)序結(jié)果，用DNAMAN 軟件拼接、比對(duì)和剪切[25]，生成對(duì)應(yīng)的線粒體COI、Cytb全序列文件后，通過(guò)在NCBI上執(zhí)行BLAST相似性檢索，以保證得到的序列為目的基因片段。

2）用Bioedit對(duì)DNA序列進(jìn)行比對(duì)、拼接和校正[26]。

3）用DNAsp生成單倍型，并計(jì)算單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Pi）及核苷酸平均差異數(shù)（Average number of nucleotide differences， K）[27]。

4）對(duì)線粒體DNACytb和COI這兩個(gè)目的片段基因及串聯(lián)成的DNA片段分別構(gòu)建以下兩種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)：用PAUP4.0的鄰近結(jié)合法構(gòu)建NJ（Neighbor joining）樹(shù)[28]；用MrBayes 3.2的貝葉斯（Bayesian）推斷法構(gòu)建貝葉斯樹(shù)[29]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 堿基組成

三個(gè)采樣點(diǎn)的峨眉黑雞基因片段的堿基組成測(cè)試結(jié)果為：COI序列片段中A+T的百分比高于G+C，堿基G含量最低（見(jiàn)表3）；Cytb序列片段A+T含量較高，堿基C含量最高（見(jiàn)表4）；串聯(lián)片段中A+T的含量高于G+C的含量（見(jiàn)表5）。

2.2? 遺傳多樣性

2.2.1? 遺傳多樣性指數(shù)

COI基因有效測(cè)序長(zhǎng)度為846 bp，其中包含549個(gè)變異位點(diǎn)、397個(gè)缺失位點(diǎn)、1個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，兩堿基變異數(shù)為1個(gè)，三堿基變異數(shù)為1個(gè)。共定義了12種單倍型。

Cytb基因有效測(cè)序長(zhǎng)度為1 005 bp，其中包含554個(gè)變異位點(diǎn)、451個(gè)缺失位點(diǎn)、8個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，兩堿基變異數(shù)為5個(gè)，三堿基變異數(shù)為3個(gè)。共定義了6種單倍型。

按照文獻(xiàn)[30]提出的標(biāo)準(zhǔn)，單倍型多樣性以0.5為臨界值，核苷酸多樣性以0.005為臨界值，二者的值越大，群體的多樣性程度越高。本測(cè)試結(jié)果（見(jiàn)表6～表8）顯示：采樣于峨眉山市世海黑雞原種雞場(chǎng)的種群（E1）在三個(gè)種群中遺傳多樣性最低；采樣于峨眉山市遠(yuǎn)大林下放養(yǎng)雞場(chǎng)的種群（E2）的核苷酸多樣性及核苷酸平均差異數(shù)最高；采樣于峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場(chǎng)的種群（E3）的單倍型多樣性較高，核苷酸多樣性較低。

2.2.2? 遺傳距離

測(cè)試結(jié)果顯示，峨眉黑雞三個(gè)地區(qū)雞種間基因的遺傳距離（DA）如下：1）Cytb基因片段， E1和E2兩個(gè)種群的遺傳距離為0.002 9，E1和E3兩個(gè)種群的遺傳距離為0.002 7，E2和E3兩個(gè)種群的遺傳距離為0.002 8。2）COI基因片段，E1和E2兩個(gè)種群的遺傳距離為0.000 8，E1和E3兩個(gè)種群的遺傳距離為0.000 4，E2和E3兩個(gè)種群的遺傳距離為0.000 5。

2.2.3? 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

基于本研究測(cè)得的21條峨眉黑雞序列Dnasp 5分析得到3個(gè)采樣地點(diǎn)的峨眉黑雞COI基因序列共有11種單倍型，Cytb基因序列共有5種單倍型；采用鄰接法（NJ）和貝葉斯推論法（BI）構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

COI：1）NJ樹(shù)。單倍型H2、H3、H5聚在一起形成姊妹分支，H1、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11單獨(dú)形成一支（見(jiàn)圖1）。2）BI樹(shù)。所有單倍型均單獨(dú)形成分支（見(jiàn)圖2）。

Cytb：1）NJ樹(shù)。單倍型H2和H4聚在一起形成姊妹分支，H3和H5聚在一起形成姊妹分支，H1單獨(dú)形成分支（見(jiàn)圖3）。2）BI樹(shù)。H3和H5聚在一起形成姊妹分支，H1、H2、H4均單獨(dú)形成分支（見(jiàn)圖4）。

3? 結(jié)論與討論

3.1? 結(jié)論

群體內(nèi)反饋線粒體DNA變異水平程度的兩個(gè)關(guān)鍵要素是單倍型多樣性（Hd）及核苷酸多樣性（Pi），兩者的值越大，表明群體的遺傳多樣性越豐富，群體的多樣性程度也越高[31]，群體可供選擇的育種素材就越多，對(duì)將來(lái)變化多端的自然環(huán)境的適應(yīng)潛力也越大[32]。Cytb序列的多樣性（Hd=[0.667，0.905]，Pi=[0.002 35，0.005 14]）明顯高于COI序列的多樣性（Hd=[0.286，0.524]，Pi=[0.000 71，0. 0.001 05]），可能是由于COI基因相對(duì)保守，而Cytb基因突變率較高。對(duì)兩個(gè)基因片段及串聯(lián)序列多樣性的計(jì)算結(jié)果顯示，采樣于峨眉山市世海黑雞原種雞場(chǎng)的種群在三個(gè)種群中遺傳多樣性最低；采樣于峨眉山市遠(yuǎn)大林下放養(yǎng)雞場(chǎng)的種群的核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)最高；采樣于峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場(chǎng)的種群?jiǎn)伪缎投鄻有暂^高，核苷酸多樣性較低。本研究結(jié)果表明，以原雞（Gallus）為外群，兩種分析方法得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)構(gòu)基本一致；來(lái)自不同地區(qū)的三個(gè)種群的單倍型未按照地理位置各自聚類(lèi)，而是相互混雜在一起，進(jìn)化關(guān)系不明顯。

COI基因片段的遺傳多樣性分析顯示出單倍型多樣性（Hd）在0.286～0.524，核苷酸多樣性（Pi）在0.000 71～0.001 05，核苷酸平均差異數(shù)（K）在0.571 43～0.857 14。總體而言，在該基因片段序列中三個(gè)種群?jiǎn)伪缎投鄻有约昂塑账岫鄻有詳?shù)值較低，本片段的三個(gè)種群遺傳多樣性數(shù)值均較低（Pi＜0.100）。Cytb基因片段的遺傳多樣性分析顯示出單倍型多樣性（Hd）在0.667～0.905，核苷酸多樣性（Pi）在0.002 35～0.005 14，核苷酸平均差異數(shù)（K）在1.809 52～4.285 71。采樣于峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場(chǎng)的種群?jiǎn)伪缎投鄻有暂^高（Hd=0.905＞0.900），采樣于峨眉山市遠(yuǎn)大林下放養(yǎng)雞場(chǎng)的種群序列核苷酸平均配對(duì)差異最高（K=4.285 71）。Cytb和COI基因串聯(lián)片段的遺傳多樣性分析顯示出單倍型多樣性（Hd）在0.810～0.905，核苷酸多樣性（Pi）在0.001 14～0.005 14，核苷酸平均差異數(shù)（K）在1.809 52～4.285 71。采樣于峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場(chǎng)的種群?jiǎn)伪缎投鄻有暂^高（Hd=0.905＞0.900），采樣于峨眉山市遠(yuǎn)大林下放養(yǎng)雞場(chǎng)的種群序列核苷酸平均配對(duì)差異最高（K=5.047 62）。

遺傳距離是分析2個(gè)不同種群或親緣關(guān)系較近的物種之間遺傳差異的一種方法，一般是利用2個(gè)種群不同位點(diǎn)的等位基因頻率數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算的[33]。本研究結(jié)果表明，無(wú)論是基于Cytb基因還是COI基因，采樣于峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場(chǎng)與峨眉山市世海黑雞原種雞場(chǎng)的種群遺傳距離都最?。ㄟz傳距離分別為0.002 7和0.000 4），即親緣關(guān)系最近；采樣于峨眉山市世海黑雞原種雞場(chǎng)與峨眉山市遠(yuǎn)大林下放養(yǎng)雞場(chǎng)的種群遺傳距離最大（遺傳距離分別為0.000 4和0.000 8），即親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；但總體親緣關(guān)系都較近。

3.2? 討論

研究結(jié)果表明，峨眉黑雞的遺傳多樣性較低，三個(gè)地區(qū)間種群親緣關(guān)系都較近，推測(cè)可能產(chǎn)生該結(jié)果的原因是由于目前進(jìn)行保種的峨眉黑雞群體是來(lái)自2002年峨眉種雞的少量育種群體，這些雞種大部分來(lái)自當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)戶，與其他外來(lái)雞種的基因交流可能性較小，所以種群親緣關(guān)系較近，其變異程度較低；除此之外，由于基礎(chǔ)種群數(shù)目相對(duì)較少，并且大部分在2002年之前缺乏系統(tǒng)性的保種措施，小群體中的遺傳漂變也可能會(huì)造成整體遺傳多樣性的缺失，發(fā)生在封閉群體中有效群體數(shù)量的下降也會(huì)提高基因漂變的速率，進(jìn)而減少小群體的遺傳多樣性[34]。因此，未來(lái)為確保峨眉黑雞的可持續(xù)性開(kāi)發(fā)利用，需加強(qiáng)對(duì)其種質(zhì)資源的保護(hù)，減少這一品種的優(yōu)良性狀丟失。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）