張銘書,夏永軍,艾連中,熊智強,宋 馨,王光強
(上海理工大學健康科學與工程學院,上海食品微生物工程技術(shù)研究中心,上海 200093)
近些年,益生菌因有促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[1]、提高機體免疫力[2]、維持腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡[3]、抑制腸道炎癥[4]等功能而被大家廣泛研究。益生菌及其代謝產(chǎn)物可以通過影響非特異性及特異性免疫反應(yīng)[5]、參與巨噬細胞極化[6]、調(diào)節(jié)黏膜屏障及免疫平衡[7]、幫助免疫微生態(tài)環(huán)境重建[8],從而達到輔助治療多種疾病的目的[9]。益生菌表面大分子物質(zhì)是引起宿主免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì),磷壁酸在其中起到關(guān)鍵作用[10]。不同結(jié)構(gòu)的磷壁酸會引起不同的免疫反應(yīng),研究表明致病菌磷壁酸可能與其致病性相關(guān)[11],而益生菌中磷壁酸對免疫應(yīng)答的影響具有不確定性。
因此,本文從細胞和分子水平對益生菌磷壁酸引起的免疫方應(yīng)進行總結(jié),并在此基礎(chǔ)上對益生菌磷壁酸突變型菌株在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)疾病、治療和預(yù)防腸炎方面進行綜述,旨在為益生菌治療免疫相關(guān)疾病提供新的調(diào)控靶點和研究思路,并為后續(xù)深入研究磷壁酸的免疫調(diào)節(jié)機理提供理論參考。
益生菌是一類攝入適量時會對宿主健康產(chǎn)生有益作用的活性微生物的總稱,可以調(diào)節(jié)樹突細胞(dendritic cell,DC)[12]、單核細胞[13]、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)[14]、調(diào)節(jié)性T細胞(T regulatory cells,Treg)和輔助性T細胞(T helper cell,Th)17[15]誘發(fā)的免疫反應(yīng),發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)能力[16-18]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)益生菌與人類健康關(guān)系密切,它能影響腸道淋巴系統(tǒng)免疫功能并在一定程度上預(yù)防和/或治療過敏性疾病[19-20],嬰兒早期腸道微生物群可能影響兒童食物過敏的發(fā)生,乳桿菌屬和雙歧桿菌屬也可以作為治療食物過敏的益生菌[21]。雖然傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑能夠緩解病情,使患者存活率升高,但是長期使用會造成一系列不良后果[22]。目前大量臨床試驗、動物模型和體外研究發(fā)現(xiàn),免疫系統(tǒng)的紊亂和失衡是引起自身免疫疾病發(fā)生和發(fā)展的主要原因,益生菌可以增強寄主的免疫功能,有效預(yù)防或治療自身免疫性疾病[23]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌細胞壁及細胞膜表面磷壁酸與機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)有極大相關(guān)性[10],但是益生菌和致病菌所引起的炎癥反應(yīng)均不相同[24-26],這與磷壁酸的結(jié)構(gòu)有關(guān),分析不同血清型金黃色葡萄球菌[27]、枯草芽孢桿菌[27]、糞腸球菌[28]、脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)結(jié)構(gòu)和功能后發(fā)現(xiàn),其LTA結(jié)構(gòu)中的D-丙氨酸(D-alanine,D-Ala)支鏈的數(shù)量與其致炎作用呈正相關(guān)。但與致病菌相比,益生菌的磷壁酸不易引起炎癥反應(yīng),對比植物乳桿菌和金黃色葡萄球菌的磷壁酸后發(fā)現(xiàn)兩者的最大不同點之一是甘油-磷酸鏈的糖基取代物以及D-Ala支鏈的結(jié)構(gòu)和數(shù)量。磷壁酸糖脂部分中?;湹娘柡统潭龋ㄖ参锶闂U菌的不飽和脂肪酸)和數(shù)量(植物乳桿菌的第三酰基鏈)也與炎癥反應(yīng)產(chǎn)生相關(guān)。由此可見,甘油-磷酸(D-Ala和糖基的含量)和磷壁酸的脂鏈(?;湹拈L度以及飽和程度)在磷壁酸發(fā)揮免疫刺激及調(diào)控方面具有重要作用[29]。
磷壁酸是在革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)的一種重要的細胞壁聚合物。根據(jù)其與細胞的連接方式不同可為兩類:LTA和壁磷壁酸(wall teichoic acid,WTA)[30]。WTA結(jié)構(gòu)與LTA結(jié)構(gòu)大致相同,但其糖脂錨定物結(jié)構(gòu)不同,WTA主要在細胞壁上,LTA在細胞膜上[11]。LTA的結(jié)構(gòu)不同所引起的免疫反應(yīng)也不同,其結(jié)構(gòu)大體分為3 個部分:修飾結(jié)構(gòu)D-Ala支鏈、糖基和磷膽堿殘基[31]。
在不同的革蘭氏陽性菌中,LTA的結(jié)構(gòu)也不同,共分為5種結(jié)構(gòu),其中I、II型磷壁酸多在益生菌中,III、IV、V型磷壁酸多存在致病菌中。聚甘油磷酸酯(I型)LTA具有未分支的1~3 個鏈接的甘油磷酸(glycerolphosphate,GroP)骨架結(jié)構(gòu),通常通過糖脂結(jié)構(gòu)與細菌膜相連[32]。在GroP重復(fù)單元中C2位置的羥基在不同程度上會被D-丙氨?;蛱腔揎?,是益生菌LTA的主要結(jié)構(gòu)并且多存在于厚壁菌門中[31]。II型LTA具有α-半乳糖基(galactosyl,Gal)(1,6)-α-Gal(1,3)-GroP重復(fù)單元的骨架,其中GroP單元可以進一步被α-Gal殘基取代。該聚合物通過α-葡萄糖(glucose,Glc)(1,2)-α-Glc(1,3)-二酰甘油(diacylglycerol,DAG)鏈式結(jié)構(gòu)連接到膜上,第一個葡萄糖分子可以攜帶其他?;湥嘣谝嫔邪l(fā)現(xiàn),如植物乳桿菌、雙歧桿菌的LTA就是由糖脂、聚甘油磷酸鏈以及D-Ala支鏈、糖基支鏈構(gòu)成(圖1)。III型LTA具有α-Gal(1,3)-GroP-重復(fù)單元的骨架結(jié)構(gòu),并且通過β-氨基葡萄糖(1,3)-α-Glc(1,3)-DAG脂質(zhì)連接到細胞膜上。GroP殘基被N-乙酰氨基葡萄糖(25%)或氨基葡萄糖(50%)殘基取代,主要在無害梭菌中發(fā)現(xiàn)。肺炎鏈球菌(IV型)LTA,其主鏈是由2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脫氧-D-半乳糖(AATGal)、Glc、核糖磷酸(ribitolphosphate,RboP)和兩個N-乙酰氨基葡糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)殘基重復(fù)單元組成[33]。V型LTA具有通過C-6連接的α-D-GlcNAc(1-3)-α-D-GlcNAc重復(fù)單元的骨架結(jié)構(gòu)[34],第二個N-乙酰氨基葡萄糖殘基用D-甘油酸修飾,該聚合物通過β-1-6-連接的三葡萄糖酰甘油糖脂連接在細菌膜上,多存在于厭氧菌和艱難梭菌中[35]。
圖1 植物乳桿菌LTA結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of lipoteichoic acid (LTA) from Lactobacillus plantarum
磷壁酸合成基因主要有脂磷壁酸合成酶(lipoteichoic acid synthase,LtaS)、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase,YpfP)、甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase,DgkB)、磷脂酸胞苷轉(zhuǎn)移酶(phosphatidate cytidyltransferase,CdsA)、磷脂酰甘油磷酸合酶(phosphatidylglycerol phosphate synthase,PgsA)和具有PgsA活性的未知酶[32]。
磷壁酸的糖脂結(jié)構(gòu)二酰甘油(diacylglycerol,Glc2-DAG)在細胞的細胞質(zhì)中由YpfP產(chǎn)生[36],YpfP利用核苷酸激活的糖作為底物合成脂質(zhì),并由脂壁酸蛋白A(lipoteichoic acid protein A,LtaA)酶協(xié)助轉(zhuǎn)移到膜外[37]。LtaS以脂質(zhì)磷脂酰甘油(lipid phosphatidylglycerol,PG)為底物,通過在生長鏈的末端重復(fù)添加GroP殘基來產(chǎn)生聚甘油磷酸酯鏈[38],同時形成的DAG通過DgkB、CdsA、PgsA酶以及未知的具有磷脂酰甘油磷酸酶活性的酶在細胞質(zhì)中催化循環(huán)從而繼續(xù)生成PG[32],在循環(huán)過程的第一步,DgkB將DAG轉(zhuǎn)化為磷脂酸[39]。磷脂酸隨后經(jīng)CdsA、PgsA和一種或多種具有磷脂酰甘油磷酸酶活性的酶通過常規(guī)的磷脂酰肌醇合成途徑將磷脂酰甘油磷酸轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇[32]。通過研究發(fā)現(xiàn),LTA的合成主要依賴于Ltas合酶,研究金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌LtaS酶域的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),其主要作用于GroP的共晶結(jié)構(gòu),幫助脂質(zhì)與酶的結(jié)合,是由I型信號肽酶在膜和細胞外酶域之間進行合成的[40],LtaS的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域可以將PG水解為DAG,但該結(jié)構(gòu)域的表達不足以合成LTA,只有全部的LtaS可在體內(nèi)產(chǎn)生LTA[41]。盡管所有I型LTA都含有相同的GroP骨架,但參與其合成的LtaS的數(shù)量因細菌種類而異。并且只在單核細胞增生李斯特菌中發(fā)現(xiàn)了LTA合酶雙酶系統(tǒng)[42],LtaP將第一個GroP連接到糖脂錨上,之后由LtaS合酶延伸該鏈[32]。
植物乳桿菌磷壁酸是其細胞壁和細胞膜的主要組成部分,會引起各種免疫反應(yīng)。Pam2CSK4(合成二酰脂肽-Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)2/6激動劑(S-[2,3-bis(palmitoyloxy)propyl]-Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys))可以刺激人腸上皮Caco-2細胞產(chǎn)生白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)細胞因子,LTA可以通過抑制Pam2CSK4引起的TLR2活化以及p38激酶、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和核因子-κB(nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)轉(zhuǎn)錄因子的激活從而阻斷IL-8的產(chǎn)生進而對人腸上皮細胞產(chǎn)生抗炎作用[43]。LTA通過A類清道夫受體(scavenger receptor class A,SR-A)通路刺激脾細胞吞噬植物乳桿菌,并誘導IL-12p40細胞因子產(chǎn)生[44],LTA的D-Ala支鏈以及脂質(zhì)部分可導致細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signalregulated kinase,ERK)、P38激酶磷酸化以及NF-κB的活性減弱,從而抑制poly(I∶C)(病毒雙鏈RNA合成類似物聚I∶C)誘導豬小腸上皮細胞分泌IL-8細胞因子[45],也可以激活TLR2依賴的ERK通路,從而刺激巨噬細胞IL-10/IL-12細胞因子產(chǎn)生的平衡,起到一定的抗炎效果[46]。LTA可以有效抑制由鞭毛蛋白刺激細胞產(chǎn)生的IL-8細胞因子,但是缺乏D-Ala支鏈和?;ф湹腖TA不能抑制IL-8細胞因子的產(chǎn)生,這說明LTA的?;糠謱τ谝种票廾鞍渍T導的IL-8產(chǎn)生至關(guān)重要,LTA在改善豬外周血單核細胞的抗炎反應(yīng)中也起重要作用[47]??偟膩碚f,植物乳桿菌LTA可刺激人腸上皮Caco-2細胞產(chǎn)生IL-8細胞因子,通過SR-A通路使脾細胞吞噬植物乳桿菌,進而誘導IL-12p40細胞因子產(chǎn)生,使ERK、P38激酶磷酸化以及NF-κB的活性提高,從而抑制腸上皮細胞分泌IL-8,激活TLR2依賴的ERK通路,保證巨噬細胞IL-10/IL-12產(chǎn)生的平衡,引起不同免疫反應(yīng)通路并分泌不同細胞因子(圖2)。
圖2 植物乳桿菌LTA引起的免疫反應(yīng)通路Fig. 2 Immune response pathways induced by LTA from Lactobacillus plantarum
雙歧桿菌LTA可以促進多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖并且降低其IL-17和IL-6的表達水平[48],用LTA進行灌胃處理后,小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、脾淋巴細胞增殖活性和NK細胞殺傷活性明顯升高,表明LTA能夠促進免疫器官的增殖發(fā)育。而血清IL-2和干擾素-γ(interferon-γ,INF-γ)水平明顯升高,IL-10明顯降低,說明LTA能夠通過增強IL-2和INF-γ的分泌釋放使機體免疫應(yīng)答由Th0向Th1轉(zhuǎn)化。Th1型細胞因子的分泌大大增加,促進胸腺和脾臟增生,增強脾淋巴細胞的增殖活性,提高NK細胞的殺傷活性,使Th1/Th2的紊亂得以糾正,從而提高了機體對白色念珠菌感染的抵抗力,具有良好的調(diào)節(jié)細胞免疫功能的作用[49],但其也能通過激活小鼠腹腔巨噬細胞MEK/ERK通路促進腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達。結(jié)果表明,雙歧桿菌LTA可以促進多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖并且降低其IL-17和IL-6的表達水平,激發(fā)深部白色念珠菌感染小鼠Th1型細胞的應(yīng)答,調(diào)節(jié)Th1/Th2的紊亂,但也會激活小鼠腹腔巨噬細胞MEK/ERK通路促進TNF-α的表達[50]。
酪酸菌LTA可抑制金黃色葡萄球菌LTA誘導的HT-29細胞炎癥反應(yīng)和凋亡以及NF-κB和ERK信號通路的激活,用LTA預(yù)處理也能夠抑制IL-8和TNF-α等細胞因子的表達和釋放[26]。干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌細胞壁表面LTA也可以有效抑制鞭毛蛋白誘導IL-8細胞因子的產(chǎn)生[47]。副干酪乳桿菌中的LTA可通過調(diào)節(jié)TLR2/p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/NF-κB途徑增強黏蛋白(Muc2)的表達,從而減輕與年齡有關(guān)的腸漏和炎癥[51]。保加利亞乳桿菌LTA可通過下調(diào)脂筏中淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶(lymphocyte-specific protein-tyrosine kinase,LCK)水平從而抑制大鼠肝臟Kupffer細胞TLR4通路[52]。
3.1.1 植物乳桿菌中磷壁酸D-Ala支鏈缺乏突變菌株引起的相關(guān)免疫反應(yīng)
植物乳桿菌磷壁酸上D-Ala殘基對長期缺乏營養(yǎng)果蠅的機體生長具有一定調(diào)節(jié)作用,相關(guān)研究人員通過篩選果蠅幼蟲中植物乳桿菌的轉(zhuǎn)座子插入文庫,鑒定了pbpX2-dlt操縱子編碼的細菌細胞壁的修飾機制,該機制對增強宿主消化能力和促進動物生長和成熟至關(guān)重要[53]。這個操縱子的缺失導致細菌細胞壁表面LTA的D-Ala支鏈缺失。結(jié)果表明,果蠅腸細胞直接接觸植物乳桿菌細胞WTA上的D-Ala支鏈,以保證慢性營養(yǎng)不良時腸道肽酶的表達和活性,幫助幼體生長和成熟[53]。在體外(單核細胞刺激)和體內(nèi)(結(jié)腸炎小鼠模型)研究中發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌D-Ala基因缺失突變體在磷壁酸生物合成途徑中具有一定的抗炎特性。與野生型菌株相比,Dlt-突變體(LTA表面D-Ala支鏈大量減少)刺激的外周血單核細胞和單核細胞分泌的炎癥因子明顯減少并刺激了抗炎因子IL-10的產(chǎn)生,Dlt-突變體在小鼠結(jié)腸炎模型中具有更大的保護作用,而從植物乳桿菌中純化的LTA刺激產(chǎn)生炎癥因子的能力是具有TLR2依賴性的,以上結(jié)果說明植物乳桿菌LTA的組成可以引起炎癥或抗炎免疫反應(yīng)[54]。在其他研究中發(fā)現(xiàn)此突變菌株有調(diào)節(jié)由TLR3激活觸發(fā)的腸道抗病毒先天免疫的能力,用LTA支鏈D-Ala基因敲除菌株刺激豬腸上皮細胞,評估其調(diào)節(jié)TLR3誘導的免疫反應(yīng)的能力。用TLR3誘導劑poly(I∶C)對細胞的刺激顯著上調(diào)了干擾素-β(interferon-β,IFN-β)、IL-6和單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein,MCP)-1的表達。與poly(I∶C)處理相比,用突變型和野生型菌株處理的PIE細胞均顯示出較高的IFN-β表達水平,而野生型菌株顯著降低IL-6和MCP-1的表達。突變菌株處理的小鼠在poly(I∶C)誘導劑攻擊后顯示出更強的IFN-β水平。但是,用突變型菌株治療的小鼠不能上調(diào)IL-10細胞因子的表達以及減少CD3+、NK1.1+、CD8 alpha alpha+、細胞量和下調(diào)TNF-α、IL-6、IL-15的表達。這些結(jié)果表明,在TLR3誘導炎癥的情況下,LTA支鏈上的D-Ala是誘導的抗炎作用的關(guān)鍵分子[55]。綜上所述,植物乳桿菌磷壁酸D-Ala支鏈基因缺失突變菌株對預(yù)防、治療腸炎以及免疫性疾病有一定的作用,但D-Ala支鏈也可以保證慢性營養(yǎng)不良的果蠅腸道肽酶的表達和活性,可以幫助幼體生長和成熟并且在TLR3誘導炎癥的情況下,可以發(fā)揮一定的抗炎作用(圖3)。
圖3 植物乳桿菌突變體的免疫調(diào)節(jié)作用Fig. 3 Immune regulation by Lactobacillus plantarum mutants
3.1.2 植物乳桿菌細胞壁上的WTA缺乏突變菌株的抗炎作用機制
植物乳桿菌缺乏WTA突變菌株,在體外細胞實驗中TLR2/6的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的表達量不顯著,而野生型菌株與細胞共培養(yǎng)時,幾乎沒有TLR2/6的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的表達,這表明WTA雖不直接參與TLR2/6信號,但以一種獨特的方式減弱這種信號,可能是通過影響LTA等免疫調(diào)節(jié)化合物的釋放和暴露。當使用純化的WTA時,人樹突狀細胞不分泌任何細胞因子,而與野生型相比,在WTA突變體刺激后,它們分泌的炎癥細胞因子IL-12p70和TNF-α水平急劇下降[56]。
嗜酸乳桿菌中,磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶基因在LTA生物合成中起關(guān)鍵作用,研究表明,與野生型嗜酸乳桿菌相比,不產(chǎn)生LTA的嗜酸乳桿菌可下調(diào)IL-12水平,而且還可下調(diào)TNF-α水平,顯著增強了DC產(chǎn)生IL-10細胞因子的水平,增強其誘導激活CD4+T細胞的能力。此外,不產(chǎn)生LTA的嗜酸乳桿菌能更有效地治療結(jié)腸炎癥[57]。IL-10依賴性途徑是嗜酸乳桿菌LTA缺乏突變體保護作用的基礎(chǔ),并且與野生菌株相比,突變菌株會抑制TLR2通路,抑制P38磷酸化以及模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)的表達[58]。用LTA缺乏的嗜酸乳桿菌進行灌胃治療可使先天和適應(yīng)性致病免疫反應(yīng)小鼠正?;?,并導致結(jié)腸息肉消退,同時產(chǎn)生IL-10抗炎因子抑制微生物群和Tregs誘導的炎癥。而腸道免疫反應(yīng),無論是刺激的還是抑制的,都是由活化的DC決定的,樹突狀細胞首先與微生物及其代謝產(chǎn)物相互作用,然后引發(fā)T細胞和B細胞反應(yīng)。LTA與先天免疫細胞(包括樹突狀細胞)相互作用使其分化,同時激活抗炎CD4+T細胞。這項研究揭示了LTA刺激產(chǎn)生炎癥的作用和LTA缺乏的嗜酸乳桿菌在結(jié)腸息肉病小鼠模型中有調(diào)節(jié)炎癥和保護結(jié)腸的能力[59]。
益生菌磷壁酸免疫反應(yīng)通路的研究為后續(xù)益生菌磷壁酸缺失突變體治療腸炎以及免疫疾病的研究奠定了一定的基礎(chǔ),因此研究磷壁酸產(chǎn)生的免疫反應(yīng)通路是至關(guān)重要的。但在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)磷壁酸既能引起炎癥反應(yīng)也會引起抗炎反應(yīng),如植物乳桿菌LTA可產(chǎn)生IL-8以及IL-12細胞因子,也可激活TLR2依賴的ERK通路,從而保證IL-10/IL-12產(chǎn)生的平衡。目前,對于益生菌磷壁酸免疫調(diào)控作用還存在爭議,因此需要更加深入的研究。而益生菌磷壁酸突變菌株在治療腸炎以及相關(guān)免疫疾病的研究相對較少,在不同的益生菌中使用了不同的磷壁酸缺失突變體,完全缺失LTA、缺失D-Ala支鏈以及缺失WTA都會產(chǎn)生不同治療炎癥的效果,益生菌磷壁酸到底引起什么樣的炎癥反應(yīng)還需深入了解。研究發(fā)現(xiàn),益生菌磷壁酸會引起機體炎癥反應(yīng)并且磷壁酸基因缺失突變體在治療和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)疾病方面也具有較大的作用,但也有相關(guān)文獻報道益生菌磷壁酸有一定的抗炎作用可作為免疫佐劑,這與前面的論述相悖。因此需要逐步深入了解益生菌的作用模式,重點研究其細胞表面性質(zhì)的特異性,探討益生菌磷壁酸的免疫反應(yīng)作用機制以及在分子和細胞學領(lǐng)域運用體內(nèi)和體外實驗相結(jié)合進行更深入的探索。