劉朝斌，李書影，葉 妞，唐 燕，曹永新，馬惠玲

（1.西北農(nóng)林科技大學林學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100）

核桃是我國經(jīng)濟林重點支柱產(chǎn)業(yè)之一，近年來得到迅猛發(fā)展，在鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略中發(fā)揮了重要作用。目前我國核桃年產(chǎn)量基本達到480萬 t（2021年國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)），占世界總產(chǎn)量的1/2，成為世界核桃生產(chǎn)第一大國。為了擴大銷量，業(yè)內(nèi)都將目光投向新產(chǎn)品開發(fā)方面，以拉動消費、提高效益[1]。核桃堅果富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有健腦、預防心血管病、抑制癌細胞生長[2-3]等保健功效。鮮食核桃相對于干核桃，更具有口感香甜[4]，營養(yǎng)全面的特色[5]，成為核桃消費的又一主流形式。提前去殼的鮮核桃仁外形精美、食用方便、衛(wèi)生，是符合現(xiàn)代人美食觀念的原生態(tài)產(chǎn)品，具有很大的市場潛力。然而，鮮核桃仁含水量高，酶活力強，20 ℃以上室溫下貯藏2～3 d內(nèi)便會因氧化褐變和滋生微生物等發(fā)生變色變質(zhì)，造成營養(yǎng)品質(zhì)下降[6]，因此，其貨架壽命極短，至今尚未成功實現(xiàn)商品化。韓強等[7]采用40?mg/L ClO2處理加真空包裝可保持新疆主栽品種‘溫185’鮮核桃仁30 d不霉爛，提出了鮮核桃仁保鮮的可行性，但其保鮮工藝仍需改進。

國內(nèi)外大量研究顯示，多種抗氧化劑或物理處理可抑制生鮮植物食材褐變?？箟难幔╝scorbic acid，AsA）作為一種多羥基化合物，可有效抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力，研究表明AsA能夠抑制番石榴、鮮切蘋果和板栗褐變[8-10]；同理，沒食子酸丙酯（propyl?gallate，PG）是含有3 個羥基的酚類物質(zhì)，可競爭性結(jié)合在PPO活力位點，抑制PPO活力。研究發(fā)現(xiàn)PG浸泡成功抑制了龍眼、高新梨的采后褐變[11-12]；加熱處理通過抑制生鮮植物產(chǎn)品PPO和過氧化物酶（peroxidase，POD）活力，有效控制了龍眼和大果山楂的酶促褐變[13-14]。葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白酶和木聚糖酶復合處理有效降低了新鮮小麥面團的褐變指數(shù)[15]。此外，關(guān)于生鮮植物食材脫色的技術(shù)也取得了實用性的進展。H2O2是食品加工過程中常用的一種漂白劑，具有反應產(chǎn)物無殘毒、環(huán)境污染小、制作成本低、處理簡便等特點，可使蘿卜[16]、杏仁[17]和小麥麩皮[18]脫色；AsA為偶合劑，可以將酶促褐變生成的醌雙鍵還原，使其不能再聚合成深色多聚物而對褐變蔗汁脫色[19]。依據(jù)上述國內(nèi)外研究成果，本研究采用不同褐變抑制劑處理新鮮核桃仁，不同脫色措施處理已褐變核桃仁，分別篩選出核桃仁褐變抑制、褐變核桃仁脫色方法，并結(jié)合無公害的短波紫外線（ultraviolet radiation C，UVC）殺菌處理和適宜自發(fā)氣調(diào)包裝，分析其對鮮核桃仁營養(yǎng)品質(zhì)及微生物滋生的影響，探究鮮核桃仁的無公害處理和保鮮方法，評價配套工藝對產(chǎn)品低溫貨架期的影響，為核桃仁成品生產(chǎn)與銷售提供理論與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用‘香玲’（Juglance regiacv.?Xiangling），2017年9月8日（約核桃雌花盛開后130～135 d）采于陜西省藍田縣核桃良種種植園。2018年9月7日采樣，用于補充實驗。采摘核桃為未開裂的青皮核桃，核桃大小適中，表皮無明顯病蟲斑和機械損傷，剪去果柄，2 h內(nèi)運回實驗室，室溫下放置12 h散去田間熱，再置于（5.0±0.5）℃冷庫保存。實驗前人工脫去青皮、小心夾除果殼，得到較為完整的核桃仁，用0.01%次氯酸鈉浸泡2?min消毒，再用無菌水沖洗，空干水分，備用。

L-AsA、七水合硫酸亞鐵（FeSO4g7H2O）、β-巰基乙醇、過氧化氫（H2O2）、次氯酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；細菌基礎培養(yǎng)基（luria-bertani，LB）北京陸橋技術(shù)有限責任公司；馬鈴薯瓊脂（potato dextrose?agar，PDA）培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、石油醚 成都市科隆化學品有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（tritonX-100） 天津市登峰化學試劑廠；交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（cross-linked polyvinylpyrrolidone，PVPP）、愈創(chuàng)木酚、木瓜蛋白酶、沒食子酸丙酯（propyl?gallate，PG） 北京索萊寶生物科技有限公司；鄰苯二酚 上海阿拉丁試劑有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene?diamine?tetraacetie?acid，EDTA） 成都市科龍化工試劑廠；L-苯丙氨酸 鄭州科邦生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

聚乙烯（polyethene，PE）30包裝袋（即厚度30?μm低密度PE袋） 天津國家保鮮工程中心；TMZ06E-Y20石英紫外線燈管 北京好特光紫外線科技有限公司；UVC-254型紫外線強度計 上海旭常工業(yè)設備有限公司；CR-400色差儀 日本柯尼卡美能達公司；UV-3100紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；TP-114萬分之一天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抑制褐變處理

以貯藏期在1 個月內(nèi)的新鮮核桃仁（L*值接近48）為試材，準備若干份，每份10 個，分別進行以下處理：1）取4 份核桃仁，分別采用質(zhì)量分數(shù)0.5%、1.0%、1.5%、2.0% AsA和0.05%檸檬酸（citric acid，CA）溶液浸泡處理5?min；2）取4 份核桃仁，分別采用質(zhì)量分數(shù)0.05%、0.10%、0.20%、0.30% PG浸泡處理5?min；3）取2 份核桃仁，分別于50 ℃加熱1?min和3?min；4）取4 份核桃仁，分別采用質(zhì)量分數(shù)為0.005%、0.010%、0.050%、0.100%的木瓜蛋白酶浸泡處理10?min，溫度40 ℃，pH 6.0。

1.3.2 脫色處理

將于（5.0±0.5）℃冷庫貯藏1 個月以上的散裝青皮核桃分批取出，室溫（25 ℃）下放置7～10 d，剝?nèi)『颂胰?，得到發(fā)生了一定程度褐變（L*值小于35）的核桃仁試材，準備若干份，每份10 個，分別進行以下處理：1）取3 份核桃仁，分別在不同溫度（20、30、40 ℃）下采用1.0% AsA浸泡1 h；2）取2 份核桃仁，分別采用0.5%、1.0% H2O2浸泡處理5?min。

以上抑制褐變和脫色處理，均以相同溫度下去離子水浸泡相同時間為對照組。處理完畢將核桃仁放置于室溫（20 ℃）下，并用PE30袋包裝但不封口，0、1、2、3、4 d時測定核桃仁的色差值。

1.3.3 保鮮效應觀測

1.3.3.1 抑制褐變效果觀測

從1.3.1節(jié)單因素試驗中選取最佳的抑制褐變處理，分別單獨和復合1 kJ/m2UVC殺菌，得到抑制褐變后殺菌和不殺菌兩個處理組，PE30袋密封包裝，模擬低溫貨架期，于（5.0±0.5）℃下存放。以去離子水浸泡、PE 30袋密封包裝為對照組。

1.3.3.2 脫色效果觀測

從1.3.2節(jié)單因素試驗中選取的最佳脫色處理，分別單獨和復合1 kJ/m2UVC殺菌，得到脫色后殺菌和不殺菌兩種處理組，PE30袋密封包裝，置于（5.0±0.5）℃存放。以去離子水浸泡、PE30袋密封包裝為對照組。

以上兩大組實驗中，各處理均分裝足夠袋數(shù)，PE30袋規(guī)格為15?cmh19?cm，每袋分裝10 個核桃仁。處理完畢后，統(tǒng)一置于（5.0±0.5）℃冷庫，模擬低溫貨架期貯存。在0、7、14、21、28、35 d和56 d時各隨機抽取3 袋，每袋每個核桃仁取1/2切為0.5 cmh0.5 cmh0.5 cm碎塊，混勻，液氮速凍，保存于－80 ℃，留待測定含油率、酸價、過氧化值（peroxide value，POV）、PPO、POD、PAL活力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除率、總抗氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）。0 d的初始樣品和各處理組21、35、56 d另取3 袋用于微生物檢測。

以上實驗所用到PE30包裝袋和1 kJ/m2UVC處理條件均為前期實驗[20]篩選所得。

1.3.4 測定指標與方法

1.3.4.1L*值測定

采用CR-400色差儀進行測定。每組樣品在分心木處掰開，對最平整的兩個內(nèi)面各測一次，讀取亮度（L*）。

1.3.4.2 微生物檢測

參考GB 4789.2ü2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[21]方法進行，稍有改動。每重復中隨機抽取5 個核桃仁樣品，稱質(zhì)量（約40?g），加入100?mL無菌水，充分振蕩后取出樣品，進行10、100 倍梯度稀釋。取每一梯度稀釋液1?mL涂布到LB平板培養(yǎng)基，（37±1）℃培養(yǎng)96 h，計錄細菌菌落數(shù)；另取每一梯度稀釋液1?mL涂布到PDA培養(yǎng)基上，在（28±1）℃培養(yǎng)7 d，記錄霉菌菌落數(shù)。各測定均重復6 個平板培養(yǎng)皿，每處理的細菌和霉菌數(shù)量均為6 次重復的平均值。微生物數(shù)量用以下公式計算。

1.3.4.3 核桃仁油脂品質(zhì)指標測定

含油率和酸價參考GB 5009.229ü2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》[22]方法測定；POV測定參考GB 5009.227ü2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》[23]方法。

1.3.4.4 PPO活力測定

參考Yan Shijie等[24]方法，略有改動。稱取0.5?g核桃仁，加0 ℃預冷的提取液（含0.1?mol/L pH 6.8磷酸緩沖液、質(zhì)量分數(shù)1% TritonX-100和4% PVPP），冰浴條件下研磨成勻漿，定容至9?mL，4 ℃ 10 000hg離心30?min。上清液即為酶提取液，5 ℃低溫保存?zhèn)溆茫ó斕焯崛‘斕焓褂茫?/p>

反應液中加入2?mL磷酸緩沖液、2?mL?50?mmol/L鄰苯二酚和0.5?mL酶提取液，410?nm波長處測定吸光度變化。以反應體系每分鐘吸光度變化0.1為1 個酶活力單位（U），結(jié)果以U/g（鮮質(zhì)量）表示。

1.3.4.5 POD活力測定

參考Fang?Wei等[25]方法，略有改動。酶提取液與上述PPO測定合用，反應體系中加入1?mL?0.1?mol/L pH 6.8磷酸緩沖液、3?mL?50?mmol/L愈創(chuàng)木酚，1?mL酶提取液和1?mL?0.2% H2O2，于470?nm波長處測定吸光度，以反應體系每分種吸光度變化0.01為1 個酶活力單位（U），結(jié)果以U/g（鮮質(zhì)量）表示。

1.3.4.6 PAL活力測定

參考Li Hua等[26]方法，略有改動。稱取0.3?g核桃仁，加預冷提取液（含0.1?mol/L pH 8.8硼酸緩沖液、質(zhì)量分數(shù)4%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、5?mmol/Lβ-巰基乙醇、2?mmol/L EDTA），冰浴條件下研磨成勻漿，4 ℃、10 000hg離心30?min。收集上清液備用。反應體系中加入2?mL?0.1?mol/L pH 8.8硼酸緩沖液、1?mL?20?mmol/LL-苯丙氨酸和1?mL酶提取液，37 ℃溫育1 h。于290?nm波長處測定吸光度，以反應體系每小時吸光度變化0.01為1 個酶活力單位（U），結(jié)果以U/g（鮮質(zhì)量）表示。

1.3.4.7 AsA抑制PPO動力學參數(shù)測定

同1.3.4.4節(jié)，分別提取鮮核桃種皮和核桃仁的PPO酶液，測定PPO活力。反應體系由2?mL磷酸緩沖提取液、2?mL鄰苯二酚底物液（濃度分別為0、0.02、0.04、0.05、0.067、0.08?mol/L和0.1?mol/L）、1?mL?AsA溶液（質(zhì)量分數(shù)0、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）和0.5?mL酶提取液組成，測定420?nm波長處不同濃度鄰苯二酚和不同濃度AsA組合反應液的吸光度，計算酶活力。以鄰苯二酚濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標，反應速率的倒數(shù)（1/V）為縱坐標，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，每條斜線與X軸的交點即為酶與底物的親合常數(shù)的倒數(shù)（1/Km），與Y軸的交點即為各組溶液酶促反應的最大速率倒數(shù)（1/Vmax），讀取兩交點值可計算各AsA濃度下PPO反應的Km和Vmax。

1.3.4.8 DPPH自由基清除活性測定

稱取0.3?g核桃仁，95%乙醇溶液中冰浴研磨成勻漿，定容至2?mL，4 ℃ 10 000hg離心30?min。收集上清液備用。反應體系中加入100 μL上清液，黑暗處靜置30?min，于517?nm波長處測定吸光度，參考閆家凱等[27]方法計算DPPH自由基清除率。

1.3.4.9 總抗氧化活性測定

總抗氧化活性（ferric?reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定參考郭長江等[28]的方法，略有改動。稱取0.3?g核桃仁，體積分數(shù)50%乙醇溶液中冰浴勻漿，定容至2?mL。4 ℃ 10 000hg離心30?min。反應體系中加入0.2?mL提取液和3?mL?FRAP工作液，混勻后于37 ℃溫育10?min，593?nm波長處測定吸光度。以0.1～1.6?mmol/L FeSO4取代提取液反應測定吸光度，制作標準曲線，根據(jù)提取液反應后吸光度所對應的FeSO4物質(zhì)的量計算樣品的FRAP，單位為mmol/g（鮮質(zhì)量）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)、作圖，采用SPSS 18.0軟件鄧肯氏（Duncan）多重比較進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抑制褐變處理對核桃仁色值的影響

對比了4種方法對鮮核桃仁褐變的抑制作用，如圖1A所示，處理后室溫下4 d的觀測期內(nèi)，不同質(zhì)量分數(shù)AsA（0.5%～2.0%）＋0.05% CA處理均減緩了種皮亮度（L*）的下降速率，L*值全程高于對照組，且第2天及以后各處理組的觀測值均與對照組差異顯著（P＜0.05）；4種質(zhì)量分數(shù)條件下，1.0% AsA＋0.05% CA處理在1～4 d均維持了最高水平的L*值，且與1.5% AsA＋0.05%CA處理差異不顯著?？梢姡撎幚碛行а泳徚撕颂胰暑伾募由钭兓?，保持了較高的亮度，表現(xiàn)出抑制褐變效應，處理適宜質(zhì)量分數(shù)為1.0%～1.5% AsA，與Goyeneche等[29]在AsA用于鮮切胡蘿卜褐變抑制中得到的最適用量范圍一致?？紤]到藥劑用量越少成本越低，選1.0%AsA＋0.05% CA處理為抑制褐變的最佳處理。

圖1B顯示，0.005%～0.050%的木瓜蛋白酶處理尚可延緩核桃仁亮度下降，在1～4 d期間L*值總體顯著大于對照組（P＜0.05），且0.050%木瓜蛋白酶處理效果最佳。質(zhì)量分數(shù)高至0.100%則效應消失。Yang Tianyi等[15]在面團脫色研究中得出木瓜蛋白酶抑制酚氧化的最佳質(zhì)量分數(shù)為0.01%，不同材料的木瓜蛋白酶最佳用量略有差異。

從圖1C可知，0.05%～0.30% PG處理較對照組均未能減少核桃仁L*值的下降速度，相反，PG處理均不同程度地促進了亮度的下降，0.10%和0.30% PG組在3、4 d時與對照組差異顯著（P＜0.05），0.05%和0.20% PG組則于1、2、3、4 d的4 個觀測點下均與對照組差異顯著（P＜0.05）。說明PG處理不但不能抑制核桃仁變色，反而加快褐變，與其他水果材料得到的結(jié)果[11-12]不一致。

由圖1D可見，50 ℃加熱1?min的L*值在2 d時顯著大于對照組（P＜0.05），在3、4 d時L*值顯著小于對照組（P＜0.05），說明50 ℃加熱1?min在短期內(nèi)可以抑制核桃仁變色，但隨著貯藏時間延長，抑制效應消失，并加速褐變。50 ℃加熱3?min處理的L*值在0～3 d時與對照組無顯著差異，在4 d時還顯著小于對照組（P＜0.05）。50 ℃短暫加熱只有2 d內(nèi)起到較弱的延緩褐變的作用，2 d后褐變加劇。50 ℃加熱3?min便失去抑制褐變作用，由于加熱時間再長會造成核桃仁熟化和變味，因此，實驗中沒有觀測更長時間的加熱效應?？梢?，50 ℃熱水處理易造成鮮核桃仁熱傷害而總體加速褐變。

圖1 不同濃度抗壞血酸（A）、木瓜蛋白酶（B）、PG（C）和加熱處理（D）對核桃仁亮度（L*）的影響Fig. 1 Effect of different concentrations of ascorbic acid (A), propyl gallate (B) and papain (C) or heating (D) on brightness (L*) of walnut kernels

2.2 不同脫色處理對核桃仁色值的影響

采用已發(fā)生明顯褐變，L*值低至33.8左右的核桃仁，經(jīng)不同溫度下1.0% AsA溶液浸泡處理，由圖2可見，處理后當時的核桃仁褐變便得到不同程度脫除，表現(xiàn)為L*值均顯著增大（P＜0.05），并在室溫貨架期保持至4 d。20 ℃和40 ℃處理較30 ℃的脫色效果更顯著，并且40 ℃處理的L*值在貨架期持續(xù)保持最大（P＜0.05）；20 ℃處理于貨架1 d后降為30 ℃同等水平。兩種濃度H2O2處理均降低了核桃仁的L*值（P＜0.05），在之后0～1 d內(nèi)逐漸恢復到對照組水平，3 d時0.5% H2O2處理組顯著低于對照組（P＜0.05）。說明H2O2處理暫時增加了核桃仁褐變程度，并以0.5%較1.0% H2O2促進褐變作用更強?？傮w上，依據(jù)L*值的提升和保持能力看出40 ℃ 1.0% AsA處理的脫色和抑制褐變能力最強，可是，在之后4 d貨架期中該組核桃仁出現(xiàn)霉變，表明40 ℃下核桃仁受到損傷，自身抗菌能力下降，降低了貨架期保鮮能力，因而選擇脫色效果僅次于它的20 ℃下1.0% AsA溶液為最佳處理條件。

圖2 不同脫色處理的核桃仁色值Fig. 2 Effect of different decolorization treatments on brightness (L*)value of walnut kernels

2.3 抑制褐變及脫色處理對核桃仁低溫貨架期褐變相關(guān)酶活力影響

2.3.1 對鮮核桃仁PPO、POD、PAL活力的影響

如圖3A所示，抑制褐變組的各處理核桃仁于低溫（5 ℃）貨架存放過程中，PPO活力整體呈上升趨勢。抑制褐變劑（1.00% AsA＋0.05% CA）單獨處理和與UVC的復合處理均對PPO活力升高具一定抑制作用，28 d前單獨處理均顯著低于對照組（P＜0.05），35 d后復合處理的抑制作用更強，顯著低于單獨處理，且PPO活力只有對照組的1/2，復合處理表現(xiàn)出較單獨處理對PPO活力更持久性抑制效果。

如圖3B所示，脫色處理組中，PPO活力整體也呈現(xiàn)上升趨勢，7 d后復合處理的PPO活力持續(xù)低于對照組（P＜0.05），單獨處理在28 d前作用不穩(wěn)定，并在前期出現(xiàn)暫時促進褐變的現(xiàn)象；因此，脫色處理組亦為復合處理較單獨處理的作用更強。

POD也是參與多酚氧化，加促褐變的酶之一，但它需要H2O2作為氧供體，雖然它因消耗H2O2，可以減少活性氧對細胞質(zhì)膜的破壞[6]。如圖3C、D所示，低溫貨架期，抑制褐變和脫色處理核桃仁的POD活力均呈現(xiàn)起伏式上升趨勢，抑制褐變組中脫色單獨和復合兩處理在28 d前均顯著抑制了該酶活力的升高（P＜0.05），末期56 d時，單獨處理抑制效果又超過復合處理（圖3C）；脫色組中僅單獨處理在35 d后對POD活力表現(xiàn)出持續(xù)抑制作用，之前兩處理的作用均不穩(wěn)定（圖3D）。結(jié)果表明，就抑制POD活力而言，無論抑制褐變還是脫色處理效果，均為所選濃度的AsA單獨處理作用更強。

由圖3E、F可看出，抑制褐變和脫色兩組處理中，PAL活力均隨貨架期的延長而增大。抑制褐變組的單獨處理和復合處理在14～21 d其PAL活力均顯著高于對照組（P＜0.05）；在脫色組中，單獨處理的PAL活力在14～21 d和35 d均顯著大于對照組（P＜0.05），復合處理在21 d和35 d顯著高于AsA，表明AsA＋CA處理穩(wěn)定增強了鮮核桃仁貨架期PAL活力，UVC有一定的增效作用。

圖3 抑制褐變和脫色處理分別對核桃仁低溫（5 ℃）貨架期PPO（A、B）、POD（C、D）和PAL（E、F）活力的影響Fig. 3 Influence of browning inhibition and decolorization treatments on polyphenol oxidase (A, B), peroxidase (C, D) and phenylalanine ammonia lyase activity (E, F) in walnut kernels during low-temperature (5 ℃) storage

2.3.2 AsA抑制PPO酶動力學分析

如圖4所示，種皮和核桃仁的PPO對各濃度底物的氧化反應速率的倒數(shù)（1/V）均隨AsA濃度的增大而增大，表明V隨AsA濃度的增大而遞減。各條線相交于第二象限，與X軸的交點隨著AsA濃度增大而絕對值減小，意味著1/Km的絕對值減小，Km增大，即PPO對底物的親合力隨AsA濃度增大而減少，同時，各條線與Y軸的交點隨AsA濃度增大有微弱增加，AsA在反應液中的出現(xiàn)主要影響PPO對底物的親和力，對反應最大速率（Vmax）影響較弱，即AsA抑制核桃仁種皮和核桃仁PPO活力的作用類型主要屬于競爭性抑制。

圖4 不同質(zhì)量分數(shù)抗壞血酸抑制核桃仁種皮（A）和核桃仁（B）PPO活力的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig. 4 Lineweaver-Burk double reciprocal plots for inhibition of various concentrations of ascorbic acid on PPO activity from walnut seed coat (A) and peeled kernel (B)

2.3.3 對鮮核桃仁DPPH自由基清除率、總抗氧化能力的影響

DPPH自由基清除能力的強弱可以反映果實的抗氧化能力，清除率越大果實的抗氧化能力越強。由圖5A、B可見，抑制褐變組和脫色組核桃仁在低溫貨架期對DPPH自由基清除率均呈波動性變化。抑制褐變實驗中，僅單獨處理的DPPH自由基清除率于28、56 d顯著低于對照組（P＜0.05），復合處理也于14、28 d均顯著低于對照組（P＜0.05），其他觀測點兩處理與對照組沒有顯差異（P＞0.05）；脫色處理中，復合處理較AsA＋CA單獨處理表現(xiàn)出一定的增強DPPH自由基清除能力的作用，在21 d前和35 d保持DPPH自由基清除率最高，且35 d與對照組和單獨處理的差異顯著（P＜0.05）。圖5C、D顯示，進入貨架期，對照組核桃仁FRAP均表現(xiàn)為前7 d增大之后下降。抑制褐變實驗中，AsA＋CA處理降低了FRAP。復合處理對FRAP部分時間會促進FRAP升高，21 d時高于對照組；脫色實驗中，復合處理組在貨架中期21～35 d其FRAP顯著大于對照組（P＜0.05），AsA＋CA單獨處理組于14 d時顯著低于對照組（P＜0.05）?？梢姡珹sA單獨處理對核桃仁總抗氧化能力整體起負作用，復合處理具有局部促進作用，UVC在促進核桃仁抗氧化方面的作用強于AsA。

圖5 抑制褐變和脫色處理分別對核桃仁低溫（5 ℃）貨架期DPPH自由基清除率（A、B）、FPAP值（C、D）的影響Fig. 5 Influence of browning inhibition and decolorization treatments on DPPH scavenging capacity (A and B) and FRAP values (C and D) of walnut kernels during low-temperature (5 ℃) storage

2.3.4 抑制褐變和脫色處理對鮮核桃仁品質(zhì)變化和微生物生長的影響

表1列出不同處理的核桃仁5 ℃（低溫）貨架期各品質(zhì)指標取值和微生物數(shù)量的變化，對照組核桃仁的亮度（L*值）隨貨架期的延長下降明顯，抑制褐變組兩處理在前21 d幾乎沒有下降，21～56 d降幅也只有對照組的1/3以下，使處理核桃仁在56 d時仍呈淺黃色，對照組已成為深褐色（圖6）；脫色處理組，在處理完畢時L*值提高7.4%，且在貨架21 d內(nèi)繼續(xù)有所增大，21～56 d內(nèi)小幅下降，終期56 d時處理核桃仁的L*值遠遠大于對照組，呈淺黃色，對照組已成為褐黃色（圖7）。兩組實驗中，與對照組相比，UVC復合處理組均減少了56 d時樣品酸價的上升幅度，其他時間差異不顯著（P＞0.05）；抑制褐變實驗中單獨處理對酸價的影響與復合處理一致，脫色實驗組中單獨處理影響不顯著（P＞0.05）。表明UVC較AsA在抑制核仁酸敗中發(fā)揮了更重要的作用。抑制褐變實驗中，單獨和復合處理總體有促進POV上升的趨勢，雖然21 d時處理組與對照組差異均不顯著（P＞0.05），35 d時單獨與復合處理均顯著高于對照組（P＜0.05），56 d時復合處理POV進一步增大，與對照組差異顯著（P＜0.05）；脫色實驗組的復合處理在56 d時POV顯著高于對照組（P＜0.05）。

兩組實驗中，處理組和對照組核桃仁低溫貨架56 d均未發(fā)生肉眼可見霉變（圖6、7）。經(jīng)微生物檢測可知，新剝?nèi)〉暮颂胰首詭Ъ毦?。無論抑制褐變處理還是脫色處理，兩種處理后細菌數(shù)均大幅減少或檢測不出，說明浸泡處理對核桃仁有清潔作用。貨架中期（21 d），兩組實驗中的處理核桃仁仍然保持著細菌數(shù)量顯著低于對照組的狀態(tài)；但貯存至35 d和56 d，AsA＋CA單獨處理都較對照組促進了霉菌的滋生，UVC復合處理抵消了這一效應，使處理核桃仁在35 d時霉菌數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05），56 d時差異不顯著。60～70 d間對照組和處理組陸續(xù)出現(xiàn)可見霉變，不可再存。低溫貨架21 d時，各組核桃仁風味正?？墒常?6 d時兩組實驗中對照組具有輕微的酸苦味，兩個處理組仍正?？墒?。

表1 不同處理的核桃仁低溫貨架期品質(zhì)變化的影響Table 1 Effects of different treatments on quality attributes of walnut kernels stored at low temperatures

圖6 抑制褐變處理核桃仁低溫貨架前后狀態(tài)Fig. 6 Appearance of walnut kernels subjected to browning inhibition before and after low-temperature storage

圖7 脫色處理核桃仁低溫貨架前后狀態(tài)Fig. 7 Appearance of decolorized walnut kernels before and after lowtemperature storage

3 討 論

3.1 核桃仁抑制褐變（護色）和脫色方法相似的原因分析

核桃仁種皮的L*值在貨架期間逐漸變小，核桃仁色澤逐漸變深，這與徐賽等[30]發(fā)現(xiàn)的常溫下貯藏荔枝L*值隨著貯藏時間的延長而減小，荔枝的亮度逐漸降低的現(xiàn)象一致，屬于典型的酶促褐變現(xiàn)象。PG富含酚羥基，食品上推薦用于油脂類產(chǎn)品抗氧化。本研究中0.05%～0.3% PG反而促進了核桃仁顏色的加深，與前人在龍眼[11]和高新梨[12]上取得結(jié)果不一致。由于0.01% PG自身產(chǎn)生顏色效應，且GB 2760ü2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》規(guī)定其用量不得超過0.1?g/kg[31]，因此推測，供試濃度PG自身的著色效應大于其抑制PPO而產(chǎn)生的減色效應，不適合用于核桃仁此類非呈色產(chǎn)品，更高濃度PG處理將超越國家標準要求，也不必進一步實驗；熱處理在其他果實上取得抑制褐變的明顯效果[13]，本實驗取得了類似結(jié)果，只是產(chǎn)生了風味和質(zhì)地的改變，表明核桃仁對熱敏感，遇熱易于軟化和熟化等，不宜采用。蛋白酶可以使催化酶促褐變的酶系失活，其中木瓜蛋白酶是一種使用較普遍的褐變抑制劑[15]。但本研究中其效果不及AsA，可能與該酶最適作用溫度為55～65 ℃[32]，而本研究卻在20 ℃下應用有關(guān)。此外，木瓜蛋白酶處理后的核桃仁因蛋白質(zhì)受損、仁衣易于碎化、產(chǎn)品外觀整齊度降低而效果不理想（資料未顯示），表明該酶更適合用于液體或面食等非有形食材的脫色。AsA是一種常見的褐變抑制劑，許彬[33]和連文綺[34]等研究發(fā)現(xiàn)其在抑制馬鈴薯、板栗和鮮切蘋果褐變都具有較好的效果；本研究結(jié)果表明，0.5%～2.0% AsA附加其強化劑CA處理5?min均可抑制核桃仁褐變，與馬鈴薯等材料上取得的結(jié)果一致。0.5% AsA＋0.05% CA在56 d低溫貨架期維持了最高水平的L*值，在所有處理中效果最佳。本研究發(fā)現(xiàn)，AsA作為PPO的競爭性抑制劑能夠降低PPO對多酚氧化反應的活力，故而在抑制褐變實驗中，使未發(fā)生褐變或輕微褐變的核桃仁的L*值下降延緩。

H2O2作為一種氧化型漂白劑在食品中應用廣泛，其作用原理是利用H2O2與生色基團或色素反應，破壞色素基團[18]。H2O2通過氧化破壞木質(zhì)素，可使纖維素及其產(chǎn)品成功脫色[17-18]。本研究在脫色方法的篩選中，0.5%和1.0% H2O2處理未能使褐變的核桃仁脫色，相反增加了核桃仁L*值，即褐變程度加重，這與H2O2破壞細胞分區(qū)隔室，促進酚類氧化反應有關(guān)[35]。這一結(jié)果也間接說明核桃仁種皮褐色物積累不含有木質(zhì)素形成因素。AsA作為強還原劑，供給氫質(zhì)子，使初級褐變產(chǎn)物醌還原為酚而褪色。甘伯中等[36]曾報道0.005% AsA可使枸杞汁脫色，本實驗采用1.0% AsA浸泡1 h發(fā)現(xiàn)核桃仁L*值顯著增大，證實了AsA對固態(tài)植物組織也具脫色效應，其后續(xù)56 d低溫貨架期L*值一直顯著低于對照組，表明該作用具有持續(xù)性。處理溫度升高至40 ℃增進了脫色效果，顯示AsA將醌還原為酚的反應受加熱促進，但又會使核桃仁出現(xiàn)輕微破損而削弱對微生物的抗性，故1.0% AsA于20 ℃下浸泡1 h是核桃仁脫色處理的最佳選擇。因此，AsA既被選為最佳的抑制褐變劑，也是有效的脫色劑，是可應用于生產(chǎn)的一種實用處理方法。

3.2 AsA抑制核桃仁氧化酶和促進抗氧化活性作用的差異性

本研究測定發(fā)現(xiàn)，核桃仁在低溫貨架期，其PPO、POD活力持續(xù)上升，抑制褐變或脫色處理下該兩酶活力全程或部分被抑制，與范靈姣等[37]在柿果實、侯曉婉等[38]在菠蘿上得到的結(jié)果一致。附加UVC的復合處理對上述兩種酶活力抑制作用有加強趨勢，表明附加適宜劑量UVC處理也強化了對核桃仁氧化酶的抑制作用，許斌等[39]對黃蘑菇的研究得出，UVC照射增強了植物材料對逆境的適應性，減少活性氧產(chǎn)生，而降低氧化酶活力。其他對植物的研究大多得出AsA含量升高或外源AsA處理促進植物抗氧化活性的結(jié)果[40-41]，本研究發(fā)現(xiàn)，AsA單獨處理或與UVC復合處理均僅在局部階段提高了DPPH自由基清除率和增強了總抗氧化能力（FRAP），這兩種處理在脫色組增強抗氧化能力的作用強于抑制褐變組。由于抑制褐變材料僅輕微褐變（L*值為43.04），自身DPPH自由基清除率高（約80%）；脫色組材料褐變重（L*值為38.72），DPPH自由基清除率有所降低（約65%），可以推斷，未褐變或輕微褐變的新鮮核桃仁其抗氧化物質(zhì)含量接近飽和，外源AsA處理難以再產(chǎn)生增效；貯存后發(fā)生了一定程度褐變的核桃仁則可能因自身還原物質(zhì)的虧缺，對外源AsA響應較為靈敏。且褐變的核桃仁經(jīng)處理后，除了AsA促進其醌類氧化產(chǎn)物還原為無色化合物外[18]，其抗氧化活性也有所增強，有利于持續(xù)抑制氧化反應，從而表現(xiàn)出脫色效應的持久性。

3.3 抑制褐變處理與核桃仁品質(zhì)保持及微生物控制的關(guān)系

PAL對植物的抗病性具有重要作用[6]。AsA處理也顯著增強了貨架中前期（14～21 d）PAL活力，與Song?Mubo等[42]在菱角上得到的結(jié)果一致?？墒?，依據(jù)AsA處理促進霉菌滋生的結(jié)果，雖然該處理促進了苯丙氨酸途徑的合成作用，可能導致總酚含量升高，卻不足以達到在抵抗微生物侵染方面的顯著作用。因此，在以AsA為主劑的抑褐或脫色處理中，附加無公害的UVC或其他殺/抑菌處理是必要的。

油脂含量是評價核桃仁品質(zhì)的重要指標，核桃仁中富含人體不能合成的亞麻酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，是其營養(yǎng)與保健功效的重要成分[4]。結(jié)果表明，既使在低溫貯藏條件下，核桃仁油脂也在發(fā)生著大幅度的降解，56 d最大降幅為20%（抑制褐變組的對照組），這與Ma?Yanping等[43]在脫青皮濕鮮核桃氣調(diào)貯藏中取得的結(jié)果接近，他們測得‘西扶1號’核桃低溫（0 ℃）貯藏60 d，油脂含量下降25%。綜上，鮮食核桃貯藏期油脂作為呼吸基質(zhì)消耗較快。本研究中抑制褐變的兩種處理和脫色實驗的復合處理均減少了油脂酸價的升高量。推測AsA除抑制氧化酶活力外，還作為活性氧清除劑和UVC殺菌作用相疊加，共同發(fā)揮了減少活性氧積累的作用，有利于油脂分解和游離脂肪酸降解均衡進行，較對照組的酸敗產(chǎn)物積累少。但在貨架時間達35 d后，復合處理顯著促進了POV的升高，POV表征脂肪酸被氧化后積累的氫過氧化物含量[44]，這種UVC處理促進油脂過氧化物產(chǎn)生，卻抑制酸價的正、負效應共存的現(xiàn)象鮮見報道，值得進一步研究。然而，GB 2716ü2018《食品安全國家標準 植物油》中規(guī)定，含油食品中油脂的酸價和POV分別不得超過4?mg/g、0.25?g/100?g[45]，本研究中各組樣品的酸價和過氧化值均遠遠低于超標臨界值，均不構(gòu)成對品質(zhì)影響的風險。

4 結(jié) 論

本研究進行了新鮮核桃仁抑制褐變方法和褐變核桃仁脫色方法兩大組實驗，篩選出1.0% AsA＋0.05% CA浸泡5?min為最佳抑褐處理條件；1.0% AsA 20 ℃浸泡1 h為最佳脫色處理條件。兩種最佳處理條件單獨、或與1 kJ/m2UVC復合，可在5 ℃低溫下將核桃仁保持在淺黃色56 d以上，且脫色組（褐變核桃仁為原料）效果接近抑制褐變組（未褐變）核桃仁的色澤（L*值）。

抑制褐變、脫色單獨和復合處理部分抑制了貨架期核桃仁的PPO、POD活力，減緩核桃仁褐變，抑制酸價上升，增強總抗氧化能力，抑制細菌的生長。復合處理延遲了霉菌滋生，使鮮核桃仁在56 d時仍風味正常，對照組已經(jīng)不可食用。本研究確定了長達56 d的鮮核桃仁保質(zhì)方法，同時也為褐變失鮮核桃仁的復鮮生產(chǎn)提供了理論與技術(shù)支撐，可用于延長鮮核桃仁貨架期。