梅佳林，李婷婷，張星暉，勵(lì)建榮,*，孟玉瓊，馬 睿，楊 旭

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600；3.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016；4.民澤龍羊峽生態(tài)水殖有限公司，青海 海南 811800）

高通量測(cè)序（high-throughput?sequencing，HTS）能直接從樣品中提取DNA，并同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)基因樣本進(jìn)行測(cè)序分析，有效地避免了傳統(tǒng)微生物分離、培養(yǎng)的繁瑣過(guò)程和可能造成的污染[1]。HTS在檢測(cè)不可培養(yǎng)微生物和低豐度微生物方面有其獨(dú)到之處，為全面描述細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)、分析微生物代謝途徑與腐敗菌之間的相關(guān)性提供了可靠的方法[2]。與傳統(tǒng)的Sanger法測(cè)序相比，HTS耗時(shí)更短、精準(zhǔn)度更高、且成本更為低廉[3]。目前，HTS已應(yīng)用于食品領(lǐng)域的許多研究中，如傳統(tǒng)發(fā)酵鲅魚(yú)[4]、雞肉[5]、豬肉[6]等。Cai Luyun等[7]利用微波或遠(yuǎn)紅外解凍紅鯛魚(yú)片并研究解凍技術(shù)對(duì)微生物多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)解凍方式對(duì)微生物優(yōu)勢(shì)菌群影響較小，貯藏前期假單胞菌屬是其主要菌屬，貯藏24 h以后，芽孢桿菌的比例顯著增加，也成為紅鯛魚(yú)片的優(yōu)勢(shì)菌群。

芳樟醇是一些芳香植物精油，如薰衣草精油、芳樟精油的主要成分之一[8]，常被作為芳香劑和調(diào)味劑添加到洗滌劑和食品中，每年全球總消費(fèi)量超過(guò)1 000 t[9]。芳樟醇還被美國(guó)食品和藥品管理局歸類(lèi)為“公認(rèn)安全”（generally?recognized?as?safe，GRAS）物質(zhì)，聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)確定了芳樟醇的每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）為0～0.5?mg/kgmb[10]。芳樟醇除了簡(jiǎn)單的調(diào)香調(diào)味功能之外，還具有抗菌[11]、抗炎癥、抗腫瘤[12]、抗高血壓[13]、預(yù)防神經(jīng)退行性疾?。ò柎暮Ｄ〉龋14-15]等功效。

莓實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi）廣泛存在于各種冷藏食品中，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道莓實(shí)假單胞菌是肉品、海產(chǎn)品和乳制品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，極易導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，且隨著時(shí)間的推移，莓實(shí)假單胞菌在食品菌相體系中的優(yōu)勢(shì)地位更加明顯[16-17]。鑒于前人對(duì)莓實(shí)假單胞菌的研究較少，且相關(guān)研究大多集中于畜禽肉類(lèi)，水產(chǎn)品尤其是三文魚(yú)中莓實(shí)假單胞菌的相關(guān)報(bào)道較少見(jiàn)，且鮮有探究芳樟醇對(duì)三文魚(yú)源莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性及機(jī)理的研究，因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HTS分析不同貯藏期三文魚(yú)的菌相變化，再以提取自三文魚(yú)中的莓實(shí)假單胞菌MS 02為靶細(xì)菌，研究芳樟醇對(duì)其抑菌性能及作用機(jī)制。本研究利用細(xì)菌生長(zhǎng)曲線表征芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌效果，通過(guò)掃描電子顯微鏡（scanning?electron?microscope，SEM）觀察菌體的微觀形態(tài)變化，通過(guò)測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性、完整性、菌體內(nèi)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和鈉鉀ATP酶活力來(lái)分析芳樟醇的抗菌機(jī)制，為芳樟醇作為天然抑菌劑對(duì)三文魚(yú)保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三文魚(yú)購(gòu)自遼寧省大連市麥德龍水產(chǎn)市場(chǎng)，原產(chǎn)地法羅群島。

芳樟醇（純度大于98%） 上海源葉生物科技有限公司；TaqPCR Master Mix試劑盒 上海生工生物工程有限公司；AKP測(cè)試盒、超微量ATP酶（Na＋K＋-ATP酶）測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所；二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate?count?agar，PCA）培養(yǎng)基、LB肉湯 青島海博生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2、1×）、戊二醛 北京索萊寶生物科技有限公司；氨芐青霉素國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇 天津福晨化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；Victor X3酶標(biāo)儀 美國(guó)Perkin?Elmer公司；Legend?Micro21R微量冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；MS-105DU電子分析天平、LE703電導(dǎo)率儀 瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；cs?150?gx3超速離心機(jī)、F7000熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；MLS-3030CH立式高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩箱太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SCIENTA-IID超聲波細(xì)胞粉碎器寧波新芝生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 三文魚(yú)樣品的預(yù)處理和高通量測(cè)序

三文魚(yú)捕撈后立即宰殺放血去內(nèi)臟，經(jīng)液氮速凍后空運(yùn)至遼寧，取三文魚(yú)腹部魚(yú)肉，干冰冷凍保藏運(yùn)輸至本實(shí)驗(yàn)室。將三文魚(yú)分割成若干個(gè)質(zhì)量為10?g的魚(yú)塊（2?cmh2?cmh2?cm），放入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用3 層保鮮膜密封，置于冰箱內(nèi)于4 ℃下保存，分別于第0、3、6、9、12天取樣，樣品取出后立刻放入－80 ℃冰箱中保存，取樣結(jié)束后將樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行HTS分析，樣品在干冰環(huán)境中貯運(yùn)。樣品經(jīng)過(guò)DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase?chain?reaction，PCR）擴(kuò)增及純化、系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及測(cè)序后，得到原始數(shù)據(jù)，處理后得到有效數(shù)據(jù)，基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行可操作單元（operational?taxonomic?units，OTUs）聚類(lèi)和物種分類(lèi)分析。

1.3.2 三文魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離、純化及鑒定

選取4 ℃貯藏12 d的腐敗三文魚(yú)塊進(jìn)行微生物菌群結(jié)構(gòu)鑒定。將10?g魚(yú)肉倒入無(wú)菌蒸煮袋中，加入90?mL無(wú)菌生理鹽水，勻速拍打2?min制成菌懸液，10 倍梯度稀釋后取1?mL稀釋液涂布于PCA培養(yǎng)基表面，每個(gè)稀釋梯度設(shè)置3 個(gè)平行。選取菌落總數(shù)為30～300的平板，觀察菌落特征后，挑取平板上大小、形態(tài)、隆起程度、光澤度及顏色等不同的菌落接種于LB肉湯中，28 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，然后在PCA培養(yǎng)基上劃線，于28 ℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)2～3 次，再挑取單菌落接種于LB肉湯中，28 ℃培養(yǎng)12 h，以10%（體積分?jǐn)?shù)）接種量傳代培養(yǎng)12 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最后將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液與等體積的50%（體積分?jǐn)?shù)）甘油水溶液混勻，置于－80 ℃冰箱中凍存保藏菌種。

將－80 ℃下保藏的菌種按照10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量加入LB肉湯中，28 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化，傳代培養(yǎng)兩次后，取1?mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液（107CFU/mL）到1.5?mL離心管中，在室溫下6 000 r/min離心5?min，收集菌體，用100 μL無(wú)菌水重懸，再使用PCR儀提取細(xì)菌DNA（94 ℃、40?min），隨后在室溫下以6 000 r/min離心5?min，收集上清液在－20 ℃下保存。參考文獻(xiàn)[18]制備PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增細(xì)菌DNA，50 μL體系組分為：1?μL?DNA樣品；2?μL上、下游引物（10?μmol/L）；25?μLTaqPCR Master Mix（2×）和20 μL無(wú)菌水。PCR程序：94 ℃、5?min；94 ℃、40 s，54 ℃、40 s，72 ℃、1?min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃、5?min；4 ℃至反應(yīng)完成。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司檢測(cè)基因序列。將測(cè)序得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已知微生物基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，采用MEGA 5分析16S rRNA結(jié)果，采用Neighor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌性測(cè)定

1.3.3.1 芳樟醇最小抑菌濃度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19]采用96 孔板稀釋法測(cè)定芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimal?inhibitory?concentration，MIC）。將適量芳樟醇溶解于50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇溶液，配制質(zhì)量濃度為8.00?μg/mL的芳樟醇母液，采用二倍梯度稀釋法用50%甲醇溶液稀釋制得質(zhì)量濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50?μg/mL的芳樟醇溶液備用。按照100?μL/孔向96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入活化兩次后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液（107CFU/mL），再分別按照100?μL/孔加入不同質(zhì)量濃度的芳樟醇溶液（終質(zhì)量濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50、0.25?μg/mL），分別以等體積的50?μg/mL氨芐青霉素、50%甲醇溶液作為陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，每組3 個(gè)平行。將96 孔板置于28 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，再用酶標(biāo)儀于595?nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值OD595?nm，選擇OD595nm低于陽(yáng)性對(duì)照組的最低質(zhì)量濃度作為芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的MIC。

1.3.3.2 莓實(shí)假單胞菌MS 02生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

采用抑菌曲線法評(píng)價(jià)芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02的抑菌效果。?。?0 ℃下保藏的莓實(shí)假單胞菌MS 02菌種，參考1.3.2節(jié)方法進(jìn)行活化，傳代培養(yǎng)兩次后吸取500?μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液（107CFU/mL）加入到25?mL?LB肉湯當(dāng)中，充分振蕩均勻后再分別按照終質(zhì)量濃度MIC、2 MIC加入芳樟醇溶液，以等體積50%甲醇溶液作空白對(duì)照，在28 ℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，使用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液595?nm處的光密度值OD595?nm。

1.3.3.3 莓實(shí)假單胞菌MS 02形態(tài)觀察

參考文獻(xiàn)[20]采用SEM觀察莓實(shí)假單胞菌MS 02細(xì)胞形態(tài)變化。?。?0 ℃下保藏的莓實(shí)假單胞菌MS 02菌種，參考1.3.2節(jié)方法進(jìn)行活化，傳代培養(yǎng)兩次后向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的菌懸液（107CFU/mL）中加入芳樟醇，使菌懸液中芳樟醇的終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC，以等體積50%甲醇溶液為空白對(duì)照。在28 ℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)6 h后，6 000 r/min、4 ℃離心10?min收集菌體。以5?mmh5?mm的鋁片作承載物，將菌體置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液中固定4 h，再用無(wú)菌PBS洗滌3 次，隨后依次以體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%乙醇溶液和無(wú)水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，每級(jí)靜置15?min，將試樣室溫放置12 h使其完全干燥后噴金觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3.4 電導(dǎo)率的測(cè)定

取活化兩次培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的莓實(shí)假單胞菌液，8 000 r/min離心10?min，收集菌體，用PBS洗滌3 次后制得重懸菌液（107CFU/mL），分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇溶液，以等體積50%甲醇為空白對(duì)照。于搖床中培養(yǎng)6 h，每小時(shí)取樣測(cè)電導(dǎo)率。

1.3.3.5 細(xì)胞膜通透性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[21]通過(guò)FDA染色實(shí)驗(yàn)研究芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02細(xì)胞膜通透性的影響。將活化兩次培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液6 000 r/min、4 ℃離心15?min，收集菌體并重懸于PBS中，調(diào)整菌懸液濃度為107CFU/mL，再分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對(duì)照。搖床培養(yǎng)12 h，取各組菌懸液于6 000 r/min、4 ℃離心10?min收集菌體，用PBS洗滌2 次后收集菌體，加入250?μL?FDA-丙酮溶液（2?mg/mL）。常溫下放置20?min后用PBS洗滌3 次，8 000 r/min、4 ℃離心10?min，收集菌體并重懸于PBS中，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)為297?nm、發(fā)射波長(zhǎng)為527?nm條件下測(cè)定樣品的FDA熒光強(qiáng)度，以表征細(xì)胞膜通透性。

1.3.3.6 細(xì)胞膜完整性測(cè)定

按1.3.3.5節(jié)的方法制備重懸液（107CFU/mL）并分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對(duì)照，分別在28 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)6 h，每3 h取1?mL的菌懸液，以6 000 r/min，4 ℃離心10?min，上清液過(guò)0.22?μm濾膜過(guò)濾。取200?μL濾液于96 孔板中，使用酶標(biāo)儀于260?nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值OD260?nm，每次實(shí)驗(yàn)3 個(gè)平行。

1.3.3.7 胞內(nèi)酶活力測(cè)定

將活化兩次培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液以6 000 r/min、4 ℃離心15?min，收集菌體并重懸于PBS中，調(diào)整菌懸液濃度為107CFU/mL，再分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對(duì)照。搖床中培養(yǎng)6 h，離心收集菌體，加入PBS重懸，冰水浴超聲破碎菌體，每次超聲時(shí)間為5 s，間隔10 s，重復(fù)4 次。參照AKP試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，測(cè)定AKP活力。參照超微量ATP酶試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定鈉鉀ATP酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin?8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析結(jié)果

對(duì)單樣本的α多樣性分析可以反映樣本內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性。由表1可知，5 個(gè)樣品的微生物覆蓋率（Coverage）均為1.000，說(shuō)明該測(cè)序結(jié)果鑒定了三文魚(yú)片中絕大多數(shù)細(xì)菌的系統(tǒng)類(lèi)別。檢測(cè)結(jié)果表明，從0～12 d的樣品觀察到的細(xì)菌OTUs數(shù)量分別為121、104、125、135、128。以Shannon、Simpson、Chao1及Ace指數(shù)對(duì)樣品的菌群豐富度和多樣性進(jìn)行初步評(píng)估。Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)用于估算樣品中微生物的多樣性，Shannon越大，群落多樣性越高，Simpson指數(shù)則相反；而Chao1指數(shù)及Ace指數(shù)常用于估算樣品的菌群豐度，是OTUs豐度的其他估計(jì)量[22]。表中數(shù)據(jù)顯示Shannon指數(shù)逐日增加，而Simpson指數(shù)則相反，說(shuō)明樣品的微生物多樣性逐漸增多；而Chao1及ACE指數(shù)均高于每個(gè)相應(yīng)樣本的OTUs觀察數(shù)則表明在所有樣品中可能還存在一些額外的微生物門(mén)類(lèi)。

表1 不同貯藏時(shí)間三文魚(yú)微生物群落的α多樣性指數(shù)Table 1 α-diversity index of bacterial community in salmon at different storage periods

基于OTUs分析制作三文魚(yú)樣品的Venn圖，不同的橢圓代表不同組樣品，重疊部分的數(shù)字代表樣本間共有的OTUs個(gè)數(shù)，單獨(dú)的數(shù)字代表樣本特有OTUs個(gè)數(shù)[23]。由圖1可知，整個(gè)貯藏期間三文魚(yú)OTUs總數(shù)為210 個(gè)，其中5 組樣品共有的有56 個(gè)，占總數(shù)的26.67%；第0天（S0d）OTUs數(shù)量為121 個(gè)，占總數(shù)的57.62%；第3天（S3d）OTUs數(shù)量為104 個(gè)，占總數(shù)的49.52%；第6天（S6d）OTUs數(shù)量為125 個(gè)，占總數(shù)的59.52%；第9天（S9d）OTUs數(shù)量為135 個(gè)，占總數(shù)的64.29%；第12天（S9d）OTUs數(shù)量為128 個(gè)，占總數(shù)的60.95%。第0天特有的OTUs數(shù)量為10 個(gè)，占總數(shù)的4.76%；第3天特有的OTUs數(shù)量為4 個(gè)，占總數(shù)的1.90%；第6天特有的OTUs數(shù)量為10 個(gè)，占4.76%；第9天特有的OTUs數(shù)量為11 個(gè)，占總數(shù)的5.24%；第12天特有的OTUs數(shù)量為12 個(gè)，占總數(shù)的5.71%。圖中各橢圓均與其他組橢圓有重疊的部分，表明各組樣品的細(xì)菌物種之間互有交叉，圖1證明了在貯藏期間的三文魚(yú)細(xì)菌群落是動(dòng)態(tài)變化的。

圖1 三文魚(yú)樣品細(xì)菌群落Venn圖Fig. 1 Venn diagram of bacterial community in salmon sample

2.2 細(xì)菌相對(duì)豐度分析結(jié)果

分別從門(mén)、綱、目、科、屬、種6 個(gè)水平對(duì)三文魚(yú)4 ℃貯藏期間的細(xì)菌群落相對(duì)豐度進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。貯藏期間三文魚(yú)的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacteria）；優(yōu)勢(shì)菌綱為γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）；優(yōu)勢(shì)菌目為弧菌目（Vibrionales）和假單胞菌目（Pseudomonadales）。在科水平的優(yōu)勢(shì)菌為弧菌科（Vibrionaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和莫拉菌科（Moraxellaceae）。

三文魚(yú)4 ℃貯藏期間屬水平的優(yōu)勢(shì)菌為發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、青枯菌屬（Ralstonia）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），相對(duì)豐度為97%，其中貯藏前期發(fā)光桿菌屬的細(xì)菌在整個(gè)菌相系統(tǒng)中處于優(yōu)勢(shì)地位，相對(duì)豐度為84.89%；而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，假單胞菌屬、青枯菌屬、不動(dòng)桿菌屬的細(xì)菌相對(duì)豐度均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其中假單胞菌屬的細(xì)菌相對(duì)豐度上升趨勢(shì)最為明顯，在貯藏初期相對(duì)豐度為3.98%，到第12天時(shí)相對(duì)豐度高達(dá)31.46%，并且仍有上升的趨勢(shì)。此外菌相系統(tǒng)中還存在一些如紫色桿菌屬（Janthinobacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）等細(xì)菌。而在整個(gè)貯藏期間Pseudomonas fragi增長(zhǎng)速度最快，在第0、3、6、9、12天相對(duì)豐度分別為3.01%、4.89%、11.20%、21.99%、24.82%。

圖2 三文魚(yú)細(xì)菌群落不同分類(lèi)水平的相對(duì)豐度Fig. 2 Relative abundance of bacterial community in salmon at different taxonomic levels

2.3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定結(jié)果

將1.3.2節(jié)分離、純化后得到菌株進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的微生物基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，選擇與已知的微生物基因序列同源性最高且活性最強(qiáng)（活化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)菌體濃度最高）的菌株，將其命名為MS 02。如圖3所示，16S rRNA分析結(jié)果證明MS 02為莓實(shí)假單胞菌。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以莓實(shí)假單胞菌MS 02為靶細(xì)菌。

圖3 菌株MS 02與其他假單胞菌之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree between MS 02 and other Pseudomonas

2.4 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性

芳樟醇對(duì)水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌——莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性如表2所示。當(dāng)芳樟醇質(zhì)量濃度為1.00?μg/mL時(shí)，莓實(shí)假單胞菌的OD595?nm為0.268±0.014，與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但略高于陽(yáng)性對(duì)照組，因此芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的MIC為2.00?μg/mL。圖4顯示了芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02生長(zhǎng)的影響，在細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中，菌懸液中的細(xì)菌濃度與OD595?nm呈正相關(guān)，因此能夠通過(guò)莓實(shí)假單胞菌OD595?nm表征細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。由圖4可知，空白對(duì)照組莓實(shí)假單胞菌呈指數(shù)型增長(zhǎng)，說(shuō)明溶劑中的甲醇對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。加入MIC和2 MIC的芳樟醇后，細(xì)菌生長(zhǎng)明顯受到抑制，MIC組的OD595?nm僅在培養(yǎng)后期有略微增長(zhǎng)，可能是因?yàn)榉颊链紕┝枯^低，且培養(yǎng)時(shí)其易揮發(fā)導(dǎo)致的。

表2 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of linalool against P. fragi

圖4 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)的影響Fig. 4 Effect of linalool on the growth curve of P. fragi

2.5 莓實(shí)假單胞菌的微觀形貌觀察結(jié)果

采用芳樟醇處理后的莓實(shí)假單胞菌的微觀形貌如圖5所示，未添加芳樟醇的莓實(shí)假單胞菌（圖5A）的菌體形態(tài)呈完整且表面光滑的桿狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)添加芳樟醇后，菌體表面隨著芳樟醇添加量的增大出現(xiàn)不同程度的破裂，MIC和2 MIC芳樟醇處理的莓實(shí)假單胞菌如圖5B、C所示，圖5B中菌體表面變得粗糙且不完整，細(xì)胞膜產(chǎn)生明顯的凹陷褶皺，圖5C中的菌體形態(tài)被嚴(yán)重破壞，細(xì)胞膜幾乎完全破裂，內(nèi)容物溶出。上述結(jié)果表明芳樟醇能破壞莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄，從而抑制菌的生長(zhǎng)。植物精油因具有疏水性更易作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，破壞胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[24]。

圖5 芳樟醇處理后的莓實(shí)假單胞菌SEM圖Fig. 5 SEM images of P. fragi treated with linalool

2.6 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌電導(dǎo)率的影響

圖6反映了芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02電導(dǎo)率的影響，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜被抑菌劑損害時(shí)，細(xì)胞膜的半透性喪失，胞內(nèi)電解質(zhì)大量流出，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[25]。空白對(duì)照組菌液電導(dǎo)率變化不明顯，這表明體系中的甲醇不會(huì)破壞細(xì)胞膜的通透性；加入MIC和2 MIC芳樟醇的菌液電導(dǎo)率迅速上升，表明芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞膜有明顯破壞作用，細(xì)胞膜破損、電解質(zhì)流出導(dǎo)致菌液電導(dǎo)率的上升。

圖6 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌電導(dǎo)率的影響Fig. 6 Effect of linalool on electrical conductivity of P. fragi

2.7 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜通透性的影響

FDA是一種自身無(wú)熒光且不帶電荷的脂質(zhì)性分子，在胞內(nèi)可被酶水解為熒光素發(fā)出熒光，當(dāng)細(xì)胞膜受到破壞，熒光素流失從而導(dǎo)致FDA熒光強(qiáng)度降低。因此，細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性可通過(guò)FDA熒光強(qiáng)度來(lái)反映[26]。圖7中顯示的是相同處理時(shí)間不同處理?xiàng)l件的FDA熒光強(qiáng)度，50%甲醇處理的熒光強(qiáng)度為1 920 AU，MIC和2 MIC組的熒光強(qiáng)度分別為530、211 AU，可以看出添加芳樟醇的處理組其熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，這表明50%甲醇不能改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。但隨著芳樟醇質(zhì)量濃度增加，細(xì)菌細(xì)胞膜被破壞程度逐漸明顯，2 MIC處理組的熒光強(qiáng)度最低，這表明2 MIC芳樟醇處理能明顯破壞莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞膜，這與圖5中2 MIC組菌體形態(tài)被嚴(yán)重破壞，細(xì)胞膜幾乎完全破裂的結(jié)論一致。舒慧珍等[26]在探究檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜通透性的影響時(shí)也得到了類(lèi)似的結(jié)論。

圖7 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌FDA熒光強(qiáng)度的影響Fig. 7 Effect of linalool on fluorescence intensity of P. fragi

2.7 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜完整性的影響

細(xì)胞膜的完整性是菌體正常生長(zhǎng)代謝的重要影響因素，其受到破壞會(huì)導(dǎo)致膜內(nèi)的DNA和RNA等物質(zhì)泄漏，DNA和RNA在260?nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)吸收作用，故可用菌懸液在OD260?nm的變化反映細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性[27]。如圖8所示，在反應(yīng)3 h后，含芳樟醇組菌懸液中的OD260?nm迅速升高，而空白對(duì)照組變化不明顯，這與上文的結(jié)論相一致，說(shuō)明PCL不會(huì)引起細(xì)菌細(xì)胞膜的破裂。MIC和2 MIC的芳樟醇會(huì)使莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜在短時(shí)間內(nèi)破裂，內(nèi)容物迅速流失，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有較明顯的破壞作用。張赟彬等[27]發(fā)現(xiàn)肉桂醛會(huì)使大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜完整性被破壞，內(nèi)容物迅速釋放導(dǎo)致菌液在260?nm波長(zhǎng)處的光密度值增大，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。

圖8 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig. 8 Effect of linalool on cell membrane integrity of P. fragi

2.8 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌胞內(nèi)酶的影響

鈉鉀ATP酶是一種蛋白酶，存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器膜上，能維持跨膜離子濃度梯度，測(cè)定胞內(nèi)鈉鉀ATP酶的活力變化可以分析抑菌劑對(duì)細(xì)菌細(xì)胞能量代謝的影響[28]。由圖9可知，在培養(yǎng)6 h后，空白對(duì)照組的鈉鉀ATP酶活力最大，而MIC和2 MIC芳樟醇組的鈉鉀ATP酶活力都相對(duì)較小，且明顯可以看出芳樟醇添加量與胞內(nèi)鈉鉀ATP酶活力有直接聯(lián)系。這表明芳樟醇能有效抑制莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞內(nèi)鈉鉀ATP酶的活力，影響細(xì)胞的正常能量代謝。胡文杰等[29]研究表明油樟葉精油的幾種餾分單體也能使尖孢鐮刀菌內(nèi)ATP酶活力下降。

圖9 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌胞內(nèi)酶活力的影響Fig. 9 Effect of linalool on intracellular enzyme activities of P. fragi

AKP存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，一般難以在胞外被檢測(cè)到，但當(dāng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞后，AKP會(huì)泄漏至細(xì)胞外。因此，可通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌胞外的AKP活力變化來(lái)觀察其對(duì)細(xì)胞壁的破壞情況[30]。由圖9可知，在培養(yǎng)6 h后，空白對(duì)照組AKP活力最高，說(shuō)明50%甲醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)無(wú)影響。但添加MIC和2 MIC芳樟醇后，莓實(shí)假單胞菌AKP活力降低，這表明芳樟醇的加入會(huì)使莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞壁被破壞，導(dǎo)致菌體電解質(zhì)外泄，最終抑制菌體生長(zhǎng)，且隨著芳樟醇添加量的增加，AKP活力降低越明顯。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用HTS分析4 ℃貯藏期間三文魚(yú)的菌相結(jié)構(gòu)，并分離提取出1 株三文魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌——莓實(shí)假單胞菌MS 02，再深入探究芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02的抑菌機(jī)理。4 ℃貯藏三文魚(yú)的微生物群落多樣性與演替規(guī)律會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而變化。三文魚(yú)的優(yōu)勢(shì)菌屬為發(fā)光桿菌屬、假單胞菌屬、青枯菌屬和不動(dòng)桿菌屬。貯藏期間三文魚(yú)菌相發(fā)生極大地變化，各菌群之間相互競(jìng)爭(zhēng)，假單胞菌屬的相對(duì)豐度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，莓實(shí)假單胞菌是樣品在貯藏期間的增長(zhǎng)速率最快的菌種。芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02具有良好的抑菌效果，SEM結(jié)果表明芳樟醇能使細(xì)菌細(xì)胞膜產(chǎn)生凹陷褶皺，而電導(dǎo)率、OD260?nm、FDA熒光強(qiáng)度和AKP、鈉鉀ATP酶活力結(jié)果則證明了芳樟醇能破壞莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性和完整性，影響細(xì)菌細(xì)胞正常能量代謝，導(dǎo)致菌體死亡。