梅佳林，李婷婷，張星暉，勵建榮,*，孟玉瓊，馬 睿，楊 旭

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；2.大連民族大學生命科學學院，遼寧 大連 116600；3.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，青海 西寧 810016；4.民澤龍羊峽生態(tài)水殖有限公司，青海 海南 811800）

高通量測序（high-throughput?sequencing，HTS）能直接從樣品中提取DNA，并同時對數(shù)百萬個基因樣本進行測序分析，有效地避免了傳統(tǒng)微生物分離、培養(yǎng)的繁瑣過程和可能造成的污染[1]。HTS在檢測不可培養(yǎng)微生物和低豐度微生物方面有其獨到之處，為全面描述細菌群落動態(tài)、分析微生物代謝途徑與腐敗菌之間的相關性提供了可靠的方法[2]。與傳統(tǒng)的Sanger法測序相比，HTS耗時更短、精準度更高、且成本更為低廉[3]。目前，HTS已應用于食品領域的許多研究中，如傳統(tǒng)發(fā)酵鲅魚[4]、雞肉[5]、豬肉[6]等。Cai Luyun等[7]利用微波或遠紅外解凍紅鯛魚片并研究解凍技術(shù)對微生物多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)解凍方式對微生物優(yōu)勢菌群影響較小，貯藏前期假單胞菌屬是其主要菌屬，貯藏24 h以后，芽孢桿菌的比例顯著增加，也成為紅鯛魚片的優(yōu)勢菌群。

芳樟醇是一些芳香植物精油，如薰衣草精油、芳樟精油的主要成分之一[8]，常被作為芳香劑和調(diào)味劑添加到洗滌劑和食品中，每年全球總消費量超過1 000 t[9]。芳樟醇還被美國食品和藥品管理局歸類為“公認安全”（generally?recognized?as?safe，GRAS）物質(zhì)，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會確定了芳樟醇的每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）為0～0.5?mg/kgmb[10]。芳樟醇除了簡單的調(diào)香調(diào)味功能之外，還具有抗菌[11]、抗炎癥、抗腫瘤[12]、抗高血壓[13]、預防神經(jīng)退行性疾?。ò柎暮Ｄ〉龋14-15]等功效。

莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）廣泛存在于各種冷藏食品中，已有大量文獻報道莓實假單胞菌是肉品、海產(chǎn)品和乳制品中的優(yōu)勢腐敗菌，極易導致食品腐敗變質(zhì)，且隨著時間的推移，莓實假單胞菌在食品菌相體系中的優(yōu)勢地位更加明顯[16-17]。鑒于前人對莓實假單胞菌的研究較少，且相關研究大多集中于畜禽肉類，水產(chǎn)品尤其是三文魚中莓實假單胞菌的相關報道較少見，且鮮有探究芳樟醇對三文魚源莓實假單胞菌的抑菌活性及機理的研究，因此，本實驗應用HTS分析不同貯藏期三文魚的菌相變化，再以提取自三文魚中的莓實假單胞菌MS 02為靶細菌，研究芳樟醇對其抑菌性能及作用機制。本研究利用細菌生長曲線表征芳樟醇對莓實假單胞菌的抑菌效果，通過掃描電子顯微鏡（scanning?electron?microscope，SEM）觀察菌體的微觀形態(tài)變化，通過測定細菌細胞膜的通透性、完整性、菌體內(nèi)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和鈉鉀ATP酶活力來分析芳樟醇的抗菌機制，為芳樟醇作為天然抑菌劑對三文魚保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三文魚購自遼寧省大連市麥德龍水產(chǎn)市場，原產(chǎn)地法羅群島。

芳樟醇（純度大于98%） 上海源葉生物科技有限公司；TaqPCR Master Mix試劑盒 上海生工生物工程有限公司；AKP測試盒、超微量ATP酶（Na＋K＋-ATP酶）測試盒 南京建成生物工程研究所；二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；平板計數(shù)瓊脂（plate?count?agar，PCA）培養(yǎng)基、LB肉湯 青島海博生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2、1×）、戊二醛 北京索萊寶生物科技有限公司；氨芐青霉素國藥集團化學試劑有限公司；甲醇 天津福晨化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；Victor X3酶標儀 美國Perkin?Elmer公司；Legend?Micro21R微量冷凍離心機 美國賽默飛世爾科技公司；MS-105DU電子分析天平、LE703電導率儀 瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；cs?150?gx3超速離心機、F7000熒光分光光度計 日本日立公司；MLS-3030CH立式高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司；THZ-D臺式恒溫振蕩箱太倉市實驗設備廠；SCIENTA-IID超聲波細胞粉碎器寧波新芝生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 三文魚樣品的預處理和高通量測序

三文魚捕撈后立即宰殺放血去內(nèi)臟，經(jīng)液氮速凍后空運至遼寧，取三文魚腹部魚肉，干冰冷凍保藏運輸至本實驗室。將三文魚分割成若干個質(zhì)量為10?g的魚塊（2?cmh2?cmh2?cm），放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用3 層保鮮膜密封，置于冰箱內(nèi)于4 ℃下保存，分別于第0、3、6、9、12天取樣，樣品取出后立刻放入－80 ℃冰箱中保存，取樣結(jié)束后將樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進行HTS分析，樣品在干冰環(huán)境中貯運。樣品經(jīng)過DNA提取、聚合酶鏈式反應（polymerase?chain?reaction，PCR）擴增及純化、系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫的建立及測序后，得到原始數(shù)據(jù)，處理后得到有效數(shù)據(jù)，基于有效數(shù)據(jù)進行可操作單元（operational?taxonomic?units，OTUs）聚類和物種分類分析。

1.3.2 三文魚優(yōu)勢腐敗菌的分離、純化及鑒定

選取4 ℃貯藏12 d的腐敗三文魚塊進行微生物菌群結(jié)構(gòu)鑒定。將10?g魚肉倒入無菌蒸煮袋中，加入90?mL無菌生理鹽水，勻速拍打2?min制成菌懸液，10 倍梯度稀釋后取1?mL稀釋液涂布于PCA培養(yǎng)基表面，每個稀釋梯度設置3 個平行。選取菌落總數(shù)為30～300的平板，觀察菌落特征后，挑取平板上大小、形態(tài)、隆起程度、光澤度及顏色等不同的菌落接種于LB肉湯中，28 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，然后在PCA培養(yǎng)基上劃線，于28 ℃培養(yǎng)24 h，重復2～3 次，再挑取單菌落接種于LB肉湯中，28 ℃培養(yǎng)12 h，以10%（體積分數(shù)）接種量傳代培養(yǎng)12 h至對數(shù)生長期，最后將對數(shù)生長期菌液與等體積的50%（體積分數(shù)）甘油水溶液混勻，置于－80 ℃冰箱中凍存保藏菌種。

將－80 ℃下保藏的菌種按照10%（體積分數(shù)）的接種量加入LB肉湯中，28 ℃培養(yǎng)24 h進行活化，傳代培養(yǎng)兩次后，取1?mL對數(shù)生長期菌液（107CFU/mL）到1.5?mL離心管中，在室溫下6 000 r/min離心5?min，收集菌體，用100 μL無菌水重懸，再使用PCR儀提取細菌DNA（94 ℃、40?min），隨后在室溫下以6 000 r/min離心5?min，收集上清液在－20 ℃下保存。參考文獻[18]制備PCR擴增體系擴增細菌DNA，50 μL體系組分為：1?μL?DNA樣品；2?μL上、下游引物（10?μmol/L）；25?μLTaqPCR Master Mix（2×）和20 μL無菌水。PCR程序：94 ℃、5?min；94 ℃、40 s，54 ℃、40 s，72 ℃、1?min，30 個循環(huán)；72 ℃、5?min；4 ℃至反應完成。

將PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司檢測基因序列。將測序得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已知微生物基因序列進行BLAST比對分析，采用MEGA 5分析16S rRNA結(jié)果，采用Neighor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 芳樟醇對莓實假單胞菌的抑菌性測定

1.3.3.1 芳樟醇最小抑菌濃度的測定

參考文獻[19]采用96 孔板稀釋法測定芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimal?inhibitory?concentration，MIC）。將適量芳樟醇溶解于50%（體積分數(shù)，下同）甲醇溶液，配制質(zhì)量濃度為8.00?μg/mL的芳樟醇母液，采用二倍梯度稀釋法用50%甲醇溶液稀釋制得質(zhì)量濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50?μg/mL的芳樟醇溶液備用。按照100?μL/孔向96 孔細胞培養(yǎng)板中加入活化兩次后處于對數(shù)生長期的菌液（107CFU/mL），再分別按照100?μL/孔加入不同質(zhì)量濃度的芳樟醇溶液（終質(zhì)量濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50、0.25?μg/mL），分別以等體積的50?μg/mL氨芐青霉素、50%甲醇溶液作為陽性對照和空白對照，每組3 個平行。將96 孔板置于28 ℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，再用酶標儀于595?nm波長處測定光密度值OD595?nm，選擇OD595nm低于陽性對照組的最低質(zhì)量濃度作為芳樟醇對莓實假單胞菌的MIC。

1.3.3.2 莓實假單胞菌MS 02生長曲線的測定

采用抑菌曲線法評價芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02的抑菌效果。?。?0 ℃下保藏的莓實假單胞菌MS 02菌種，參考1.3.2節(jié)方法進行活化，傳代培養(yǎng)兩次后吸取500?μL對數(shù)生長期的菌懸液（107CFU/mL）加入到25?mL?LB肉湯當中，充分振蕩均勻后再分別按照終質(zhì)量濃度MIC、2 MIC加入芳樟醇溶液，以等體積50%甲醇溶液作空白對照，在28 ℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，使用酶標儀測定菌液595?nm處的光密度值OD595?nm。

1.3.3.3 莓實假單胞菌MS 02形態(tài)觀察

參考文獻[20]采用SEM觀察莓實假單胞菌MS 02細胞形態(tài)變化。?。?0 ℃下保藏的莓實假單胞菌MS 02菌種，參考1.3.2節(jié)方法進行活化，傳代培養(yǎng)兩次后向?qū)?shù)生長期的菌懸液（107CFU/mL）中加入芳樟醇，使菌懸液中芳樟醇的終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC，以等體積50%甲醇溶液為空白對照。在28 ℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)6 h后，6 000 r/min、4 ℃離心10?min收集菌體。以5?mmh5?mm的鋁片作承載物，將菌體置于質(zhì)量分數(shù)2.5%的戊二醛溶液中固定4 h，再用無菌PBS洗滌3 次，隨后依次以體積分數(shù)30%、50%、70%、90%乙醇溶液和無水乙醇進行梯度洗脫，每級靜置15?min，將試樣室溫放置12 h使其完全干燥后噴金觀察細胞形態(tài)。

1.3.3.4 電導率的測定

取活化兩次培養(yǎng)至對數(shù)生長期的莓實假單胞菌液，8 000 r/min離心10?min，收集菌體，用PBS洗滌3 次后制得重懸菌液（107CFU/mL），分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇溶液，以等體積50%甲醇為空白對照。于搖床中培養(yǎng)6 h，每小時取樣測電導率。

1.3.3.5 細胞膜通透性測定

參考文獻[21]通過FDA染色實驗研究芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02細胞膜通透性的影響。將活化兩次培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液6 000 r/min、4 ℃離心15?min，收集菌體并重懸于PBS中，調(diào)整菌懸液濃度為107CFU/mL，再分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對照。搖床培養(yǎng)12 h，取各組菌懸液于6 000 r/min、4 ℃離心10?min收集菌體，用PBS洗滌2 次后收集菌體，加入250?μL?FDA-丙酮溶液（2?mg/mL）。常溫下放置20?min后用PBS洗滌3 次，8 000 r/min、4 ℃離心10?min，收集菌體并重懸于PBS中，用熒光分光光度計在激發(fā)波長為297?nm、發(fā)射波長為527?nm條件下測定樣品的FDA熒光強度，以表征細胞膜通透性。

1.3.3.6 細胞膜完整性測定

按1.3.3.5節(jié)的方法制備重懸液（107CFU/mL）并分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對照，分別在28 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)6 h，每3 h取1?mL的菌懸液，以6 000 r/min，4 ℃離心10?min，上清液過0.22?μm濾膜過濾。取200?μL濾液于96 孔板中，使用酶標儀于260?nm波長處測定其光密度值OD260?nm，每次實驗3 個平行。

1.3.3.7 胞內(nèi)酶活力測定

將活化兩次培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液以6 000 r/min、4 ℃離心15?min，收集菌體并重懸于PBS中，調(diào)整菌懸液濃度為107CFU/mL，再分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對照。搖床中培養(yǎng)6 h，離心收集菌體，加入PBS重懸，冰水浴超聲破碎菌體，每次超聲時間為5 s，間隔10 s，重復4 次。參照AKP試劑盒說明書方法，測定AKP活力。參照超微量ATP酶試劑盒說明書測定鈉鉀ATP酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗設置3 個平行，實驗結(jié)果用平均值±標準差表示。采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，采用Tukey檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin?8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析結(jié)果

對單樣本的α多樣性分析可以反映樣本內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性。由表1可知，5 個樣品的微生物覆蓋率（Coverage）均為1.000，說明該測序結(jié)果鑒定了三文魚片中絕大多數(shù)細菌的系統(tǒng)類別。檢測結(jié)果表明，從0～12 d的樣品觀察到的細菌OTUs數(shù)量分別為121、104、125、135、128。以Shannon、Simpson、Chao1及Ace指數(shù)對樣品的菌群豐富度和多樣性進行初步評估。Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)用于估算樣品中微生物的多樣性，Shannon越大，群落多樣性越高，Simpson指數(shù)則相反；而Chao1指數(shù)及Ace指數(shù)常用于估算樣品的菌群豐度，是OTUs豐度的其他估計量[22]。表中數(shù)據(jù)顯示Shannon指數(shù)逐日增加，而Simpson指數(shù)則相反，說明樣品的微生物多樣性逐漸增多；而Chao1及ACE指數(shù)均高于每個相應樣本的OTUs觀察數(shù)則表明在所有樣品中可能還存在一些額外的微生物門類。

表1 不同貯藏時間三文魚微生物群落的α多樣性指數(shù)Table 1 α-diversity index of bacterial community in salmon at different storage periods

基于OTUs分析制作三文魚樣品的Venn圖，不同的橢圓代表不同組樣品，重疊部分的數(shù)字代表樣本間共有的OTUs個數(shù)，單獨的數(shù)字代表樣本特有OTUs個數(shù)[23]。由圖1可知，整個貯藏期間三文魚OTUs總數(shù)為210 個，其中5 組樣品共有的有56 個，占總數(shù)的26.67%；第0天（S0d）OTUs數(shù)量為121 個，占總數(shù)的57.62%；第3天（S3d）OTUs數(shù)量為104 個，占總數(shù)的49.52%；第6天（S6d）OTUs數(shù)量為125 個，占總數(shù)的59.52%；第9天（S9d）OTUs數(shù)量為135 個，占總數(shù)的64.29%；第12天（S9d）OTUs數(shù)量為128 個，占總數(shù)的60.95%。第0天特有的OTUs數(shù)量為10 個，占總數(shù)的4.76%；第3天特有的OTUs數(shù)量為4 個，占總數(shù)的1.90%；第6天特有的OTUs數(shù)量為10 個，占4.76%；第9天特有的OTUs數(shù)量為11 個，占總數(shù)的5.24%；第12天特有的OTUs數(shù)量為12 個，占總數(shù)的5.71%。圖中各橢圓均與其他組橢圓有重疊的部分，表明各組樣品的細菌物種之間互有交叉，圖1證明了在貯藏期間的三文魚細菌群落是動態(tài)變化的。

圖1 三文魚樣品細菌群落Venn圖Fig. 1 Venn diagram of bacterial community in salmon sample

2.2 細菌相對豐度分析結(jié)果

分別從門、綱、目、科、屬、種6 個水平對三文魚4 ℃貯藏期間的細菌群落相對豐度進行分析，結(jié)果如圖2所示。貯藏期間三文魚的細菌優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）；優(yōu)勢菌綱為γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）；優(yōu)勢菌目為弧菌目（Vibrionales）和假單胞菌目（Pseudomonadales）。在科水平的優(yōu)勢菌為弧菌科（Vibrionaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和莫拉菌科（Moraxellaceae）。

三文魚4 ℃貯藏期間屬水平的優(yōu)勢菌為發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、青枯菌屬（Ralstonia）和不動桿菌屬（Acinetobacter），相對豐度為97%，其中貯藏前期發(fā)光桿菌屬的細菌在整個菌相系統(tǒng)中處于優(yōu)勢地位，相對豐度為84.89%；而隨著時間的延長，假單胞菌屬、青枯菌屬、不動桿菌屬的細菌相對豐度均呈現(xiàn)上升的趨勢，其中假單胞菌屬的細菌相對豐度上升趨勢最為明顯，在貯藏初期相對豐度為3.98%，到第12天時相對豐度高達31.46%，并且仍有上升的趨勢。此外菌相系統(tǒng)中還存在一些如紫色桿菌屬（Janthinobacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）等細菌。而在整個貯藏期間Pseudomonas fragi增長速度最快，在第0、3、6、9、12天相對豐度分別為3.01%、4.89%、11.20%、21.99%、24.82%。

圖2 三文魚細菌群落不同分類水平的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of bacterial community in salmon at different taxonomic levels

2.3 優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定結(jié)果

將1.3.2節(jié)分離、純化后得到菌株進行DNA提取和PCR擴增，測定擴增產(chǎn)物的基因序列并與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的微生物基因序列進行BLAST比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇與已知的微生物基因序列同源性最高且活性最強（活化培養(yǎng)至對數(shù)生長期時菌體濃度最高）的菌株，將其命名為MS 02。如圖3所示，16S rRNA分析結(jié)果證明MS 02為莓實假單胞菌。后續(xù)實驗均以莓實假單胞菌MS 02為靶細菌。

圖3 菌株MS 02與其他假單胞菌之間的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree between MS 02 and other Pseudomonas

2.4 芳樟醇對莓實假單胞菌的抑菌活性

芳樟醇對水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌——莓實假單胞菌的抑菌活性如表2所示。當芳樟醇質(zhì)量濃度為1.00?μg/mL時，莓實假單胞菌的OD595?nm為0.268±0.014，與陽性對照組無顯著性差異（P＞0.05），但略高于陽性對照組，因此芳樟醇對莓實假單胞菌的MIC為2.00?μg/mL。圖4顯示了芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02生長的影響，在細菌生長過程中，菌懸液中的細菌濃度與OD595?nm呈正相關，因此能夠通過莓實假單胞菌OD595?nm表征細菌的生長狀況。由圖4可知，空白對照組莓實假單胞菌呈指數(shù)型增長，說明溶劑中的甲醇對細菌生長無明顯影響。加入MIC和2 MIC的芳樟醇后，細菌生長明顯受到抑制，MIC組的OD595?nm僅在培養(yǎng)后期有略微增長，可能是因為芳樟醇劑量較低，且培養(yǎng)時其易揮發(fā)導致的。

表2 芳樟醇對莓實假單胞菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of linalool against P. fragi

圖4 芳樟醇對莓實假單胞菌生長的影響Fig. 4 Effect of linalool on the growth curve of P. fragi

2.5 莓實假單胞菌的微觀形貌觀察結(jié)果

采用芳樟醇處理后的莓實假單胞菌的微觀形貌如圖5所示，未添加芳樟醇的莓實假單胞菌（圖5A）的菌體形態(tài)呈完整且表面光滑的桿狀結(jié)構(gòu)，當添加芳樟醇后，菌體表面隨著芳樟醇添加量的增大出現(xiàn)不同程度的破裂，MIC和2 MIC芳樟醇處理的莓實假單胞菌如圖5B、C所示，圖5B中菌體表面變得粗糙且不完整，細胞膜產(chǎn)生明顯的凹陷褶皺，圖5C中的菌體形態(tài)被嚴重破壞，細胞膜幾乎完全破裂，內(nèi)容物溶出。上述結(jié)果表明芳樟醇能破壞莓實假單胞菌的細胞結(jié)構(gòu)，導致細胞內(nèi)容物外泄，從而抑制菌的生長。植物精油因具有疏水性更易作用于細菌細胞膜，破壞胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，從而抑制細菌生長[24]。

圖5 芳樟醇處理后的莓實假單胞菌SEM圖Fig. 5 SEM images of P. fragi treated with linalool

2.6 芳樟醇對莓實假單胞菌電導率的影響

圖6反映了芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02電導率的影響，當細菌細胞膜被抑菌劑損害時，細胞膜的半透性喪失，胞內(nèi)電解質(zhì)大量流出，抑制細菌生長[25]?？瞻讓φ战M菌液電導率變化不明顯，這表明體系中的甲醇不會破壞細胞膜的通透性；加入MIC和2 MIC芳樟醇的菌液電導率迅速上升，表明芳樟醇對莓實假單胞菌的細胞膜有明顯破壞作用，細胞膜破損、電解質(zhì)流出導致菌液電導率的上升。

圖6 芳樟醇對莓實假單胞菌電導率的影響Fig. 6 Effect of linalool on electrical conductivity of P. fragi

2.7 芳樟醇對莓實假單胞菌細胞膜通透性的影響

FDA是一種自身無熒光且不帶電荷的脂質(zhì)性分子，在胞內(nèi)可被酶水解為熒光素發(fā)出熒光，當細胞膜受到破壞，熒光素流失從而導致FDA熒光強度降低。因此，細菌細胞膜的通透性可通過FDA熒光強度來反映[26]。圖7中顯示的是相同處理時間不同處理條件的FDA熒光強度，50%甲醇處理的熒光強度為1 920 AU，MIC和2 MIC組的熒光強度分別為530、211 AU，可以看出添加芳樟醇的處理組其熒光強度明顯低于對照組，這表明50%甲醇不能改變細菌細胞膜的通透性。但隨著芳樟醇質(zhì)量濃度增加，細菌細胞膜被破壞程度逐漸明顯，2 MIC處理組的熒光強度最低，這表明2 MIC芳樟醇處理能明顯破壞莓實假單胞菌的細胞膜，這與圖5中2 MIC組菌體形態(tài)被嚴重破壞，細胞膜幾乎完全破裂的結(jié)論一致。舒慧珍等[26]在探究檸檬烯對熒光假單胞菌細胞膜通透性的影響時也得到了類似的結(jié)論。

圖7 芳樟醇對莓實假單胞菌FDA熒光強度的影響Fig. 7 Effect of linalool on fluorescence intensity of P. fragi

2.7 芳樟醇對莓實假單胞菌細胞膜完整性的影響

細胞膜的完整性是菌體正常生長代謝的重要影響因素，其受到破壞會導致膜內(nèi)的DNA和RNA等物質(zhì)泄漏，DNA和RNA在260?nm波長處具有強吸收作用，故可用菌懸液在OD260?nm的變化反映細菌細胞膜的完整性[27]。如圖8所示，在反應3 h后，含芳樟醇組菌懸液中的OD260?nm迅速升高，而空白對照組變化不明顯，這與上文的結(jié)論相一致，說明PCL不會引起細菌細胞膜的破裂。MIC和2 MIC的芳樟醇會使莓實假單胞菌細胞膜在短時間內(nèi)破裂，內(nèi)容物迅速流失，對細菌細胞有較明顯的破壞作用。張赟彬等[27]發(fā)現(xiàn)肉桂醛會使大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細胞膜完整性被破壞，內(nèi)容物迅速釋放導致菌液在260?nm波長處的光密度值增大，本實驗結(jié)果與其一致。

圖8 芳樟醇對莓實假單胞菌細胞膜完整性的影響Fig. 8 Effect of linalool on cell membrane integrity of P. fragi

2.8 芳樟醇對莓實假單胞菌胞內(nèi)酶的影響

鈉鉀ATP酶是一種蛋白酶，存在于組織細胞及細胞器膜上，能維持跨膜離子濃度梯度，測定胞內(nèi)鈉鉀ATP酶的活力變化可以分析抑菌劑對細菌細胞能量代謝的影響[28]。由圖9可知，在培養(yǎng)6 h后，空白對照組的鈉鉀ATP酶活力最大，而MIC和2 MIC芳樟醇組的鈉鉀ATP酶活力都相對較小，且明顯可以看出芳樟醇添加量與胞內(nèi)鈉鉀ATP酶活力有直接聯(lián)系。這表明芳樟醇能有效抑制莓實假單胞菌細胞內(nèi)鈉鉀ATP酶的活力，影響細胞的正常能量代謝。胡文杰等[29]研究表明油樟葉精油的幾種餾分單體也能使尖孢鐮刀菌內(nèi)ATP酶活力下降。

圖9 芳樟醇對莓實假單胞菌胞內(nèi)酶活力的影響Fig. 9 Effect of linalool on intracellular enzyme activities of P. fragi

AKP存在于細胞壁和細胞膜之間，一般難以在胞外被檢測到，但當細胞結(jié)構(gòu)被破壞后，AKP會泄漏至細胞外。因此，可通過檢測細菌胞外的AKP活力變化來觀察其對細胞壁的破壞情況[30]。由圖9可知，在培養(yǎng)6 h后，空白對照組AKP活力最高，說明50%甲醇對莓實假單胞菌的細胞壁結(jié)構(gòu)無影響。但添加MIC和2 MIC芳樟醇后，莓實假單胞菌AKP活力降低，這表明芳樟醇的加入會使莓實假單胞菌的細胞壁被破壞，導致菌體電解質(zhì)外泄，最終抑制菌體生長，且隨著芳樟醇添加量的增加，AKP活力降低越明顯。

3 結(jié) 論

本實驗采用HTS分析4 ℃貯藏期間三文魚的菌相結(jié)構(gòu)，并分離提取出1 株三文魚優(yōu)勢腐敗菌——莓實假單胞菌MS 02，再深入探究芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02的抑菌機理。4 ℃貯藏三文魚的微生物群落多樣性與演替規(guī)律會隨著時間延長而變化。三文魚的優(yōu)勢菌屬為發(fā)光桿菌屬、假單胞菌屬、青枯菌屬和不動桿菌屬。貯藏期間三文魚菌相發(fā)生極大地變化，各菌群之間相互競爭，假單胞菌屬的相對豐度隨著時間的延長逐漸增大，莓實假單胞菌是樣品在貯藏期間的增長速率最快的菌種。芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02具有良好的抑菌效果，SEM結(jié)果表明芳樟醇能使細菌細胞膜產(chǎn)生凹陷褶皺，而電導率、OD260?nm、FDA熒光強度和AKP、鈉鉀ATP酶活力結(jié)果則證明了芳樟醇能破壞莓實假單胞菌的細胞膜和細胞壁的通透性和完整性，影響細菌細胞正常能量代謝，導致菌體死亡。