吳麗娜，劉昀閣，張一敏,2，毛衍偉，梁榮蓉，楊嘯吟，羅 欣,2,3，董鵬程,*，朱立賢,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.國家牛肉加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，山東 泰安 271018；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

大腸桿菌O157:H7作為一種食源性致病菌可引起人類感染性腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征等疾病，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[1]。大腸桿菌O157:H7對食品的污染是導(dǎo)致與上述疾病爆發(fā)的主要原因，肉、乳制品以及其他食品等都可以作為大腸桿菌O157:H7的載體[2-3]。大腸桿菌O157:H7之所以在食品工業(yè)中難以清除，主要?dú)w因于其具有生物膜形成能力，可在加工器械表面附著[4]。生物膜是指微生物為了適應(yīng)環(huán)境，通過分泌大量的多糖、蛋白質(zhì)和核酸等胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS），將菌體自身包裹在立體結(jié)構(gòu)中而形成的菌體聚集膜樣物。生物膜是菌體在自然界中一種常見的生存狀態(tài)，直接影響著食品安全和人體健康等各個(gè)方面[5]。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌生物膜可以在各種材料的表面形成，例如陶瓷、玻璃、木材、不銹鋼和塑料[2,6]。如果沒有經(jīng)過適當(dāng)?shù)那鍧嵦幚恚⑸锟梢栽谑澄锝佑|表面上定植并持續(xù)存活。生物膜被認(rèn)為是食品加工中交叉污染的主要風(fēng)險(xiǎn)因素之一，且相比于浮游菌，生物膜的形成使大腸桿菌O157:H7對外界不良環(huán)境具有更強(qiáng)的耐受性[4]。這一特性使對大腸桿菌O157:H7生物膜的有效控制成為了食品加工安全防控的一大難題。

有機(jī)酸作為一種天然的有機(jī)化合物對食源性病原體具有顯著的抑制作用。其中，乳酸（lactic acid, LA）被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food Drug Administration，F(xiàn)DA）指定為一種被公認(rèn)安全（generally recognized as safe，GRAS）的消毒劑，已在肉牛屠宰加工中應(yīng)用[7]。而過氧乙酸（peroxyacetic acid，PAA）作為一種環(huán)境友好型的消毒劑，可以被分解為過氧化氫和乙酸，也常被用于微生物的控制[8]?，F(xiàn)有研究表明，有機(jī)酸主要通過破壞細(xì)菌的蛋白質(zhì)、酶和其他代謝產(chǎn)物，以及破壞細(xì)胞通透性來發(fā)揮抑菌作用[9-10]。然而，目前關(guān)于LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制作用研究較少，且LA和PAA對于大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制機(jī)理尚不完全明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)肉牛屠宰工廠來源的大腸桿菌O157:H7具有生物膜形成能力[11]，本研究在此基礎(chǔ)上選取一株成膜能力較強(qiáng)的大腸桿菌O157:H7野生菌株為研究對象，探究LA和PAA對其生物膜的抑制作用。并從代謝活性、EPS含量、微觀結(jié)構(gòu)和基因相對表達(dá)等方面探究LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制機(jī)理，從而為食品實(shí)際生產(chǎn)加工過程中大腸桿菌O157:H7的有效控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所使用的菌株為分離自我國肉牛屠宰企業(yè)中的大腸桿菌O157:H7野生菌株，攜帶毒力基因stx2、eaeA、hlyA[12]，現(xiàn)保藏于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院畜產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室。

苯酚、氯化鈉、無水葡萄糖、無水乙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；PAA 北京西亞公司；細(xì)胞培養(yǎng)板美國康寧公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2、0.01 mol/L） 北京索萊寶科技有限公司；LA上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LIVE/DEAD染料美國賽默飛世爾科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、SYBR?Premix ExTaqTM（Tli RNaseH Plus） 大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1300 SERIES A2生物安全柜 美國賽默飛世爾科技有限公司；DHP系列智能型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PTC-200實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（配CFX 96檢測系統(tǒng)）美國Bio-Rad公司；SpectraMax M5微孔板檢測系統(tǒng)美國Molecular Devices公司；GeneQuant 100微量核酸蛋白測定儀 英國Biochrom公司；5804R離心機(jī)德國Eppendorf公司；SU8020場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本HITACHI公司；LSM880激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

菌種凍存（－80 ℃）于25%（體積分?jǐn)?shù)）甘油中，實(shí)驗(yàn)前取20 μL接種于20 mL新鮮的TSB培養(yǎng)液中進(jìn)行活化，37 ℃培養(yǎng)18 h進(jìn)行活化，經(jīng)2 次活化后的菌液備用。

1.3.2 大腸桿菌O157:H7生物膜中活菌數(shù)的測定

在96 孔板中分別加入180 μL TSB培養(yǎng)基并接種20 μL活化后的菌液，菌體終濃度為1h106CFU/mL，于37 ℃培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用0.85%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）NaCl溶液沖洗3 次，以除去孔內(nèi)未黏附的浮游菌。用無菌刮刀將附著在96 孔板的生物膜刮下，重懸于200 μL 0.85% NaCl溶液中，用移液槍反復(fù)吸打混勻，取100 μL重懸后的菌液梯度稀釋，采用胰蛋白胨大豆瓊脂平板法測定生物膜中活菌數(shù)[13]，以評估大腸桿菌O157:H7生物膜形成能力。

1.3.3 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7最小抑菌劑量的測定

配制含體積分?jǐn)?shù)8% LA或0.32% PAA的TSB培養(yǎng)基，后在96 孔板中進(jìn)行連續(xù)2 倍稀釋，使LA的終體積分?jǐn)?shù)分別為4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.062 5%、0.031 25%，PAA的終體積分?jǐn)?shù)分別為0.16%、0.08%、0.04%、0.02%、0.01%、0.005%、0.002 5%、0.001 25%。在96 孔板中分別加入180 μL含不同劑量的LA或PAA的TSB培養(yǎng)基，接種20 μL活化后的菌液，菌體終濃度為1h106CFU/mL。其中，不同劑量的LA或PAA培養(yǎng)基制備方法如下：同時(shí)以只含有200 μL TSB培養(yǎng)基作為空白對照。96 孔板在37 ℃下孵育24 h后，用酶標(biāo)儀測定OD600nm。與空白對照組OD600nm無顯著差異的最小劑量確定為LA或PAA對大腸桿菌O157:H7的最小抑菌劑量（minimum inhibitory concentrations，MIC）[2]。

1.3.4 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜抑制作用的分析

在96 孔板中分別加入20 μL活化后的菌液，然后加入180 μL含不同劑量LA或PAA的TSB培養(yǎng)基，菌體終濃度為1h106CFU/mL，LA或PAA終劑量分別為0（對照組）、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC，于37 ℃下培養(yǎng)4 d，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用0.85% NaCl溶液沖洗3 次，以除去孔內(nèi)未黏附的浮游菌。用無菌刮刀將附著在96 孔板的生物膜刮下，重新懸浮于200 μL 0.85% NaCl溶液中，然后參考1.3.2節(jié)方法進(jìn)行梯度稀釋，采用胰蛋白胨大豆瓊脂平板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)測定生物膜中活菌數(shù)，評估LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制作用[13]。

1.3.5 大腸桿菌O157:H7生物膜中細(xì)胞代謝活性的測定

96 孔板中每孔加入180 μL含不同劑量LA或PAA的TSB培養(yǎng)基，接種20 μL活化的菌液（菌體終濃度為1h106CFU/mL），培養(yǎng)基中LA或PAA的終劑量分別為0（對照組）、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC，于37 ℃下培養(yǎng)4 d，取出96 孔板，將孔中的浮游菌吸出，用無菌PBS沖洗3 次，每孔加入100 μL PBS和10 μL CCK-8試劑，37 ℃避光培養(yǎng)4 h，在450 nm波長處測其吸光度A，按下式計(jì)算抑制率[14]。

1.3.6 大腸桿菌O157:H7生物膜胞外聚合物質(zhì)量濃度的測定

24 孔板中每孔加入1 800 μL含不同劑量LA或PAA的TSB培養(yǎng)基并接種200 μL活化后的菌液（菌體終濃度為1h106CFU/mL），培養(yǎng)基中LA或PAA終劑量為MIC，以等體積不含LA和PAA的TSB培養(yǎng)基為對照組，37 ℃下培養(yǎng)至4 d，取出24 孔板，將孔中的浮游菌吸出，用無菌PBS沖洗3 次，重新懸浮于1 mL無菌PBS中，用移液槍反復(fù)吸打混勻后取1 mL生物膜樣品加入0.4 mL 1 mol/L NaOH，150 r/min、4 ℃振蕩3 h，加入0.6 mL 0.85% NaCl溶液，6 000hg、4 ℃離心20 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾待測。用苯酚-硫酸法測定胞外多糖質(zhì)量濃度[14-15]，參考BCA蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白質(zhì)量濃度[15]。

1.3.7 大腸桿菌O157:H7生物膜相關(guān)基因表達(dá)的測定

24 孔板中每孔加入1 800 μL含不同劑量LA或PAA的TSB培養(yǎng)基并接種200 μL活化后的菌液（菌體終濃度為1h106CFU/mL），培養(yǎng)基中LA或PAA終劑量為MIC，以等體積不含LA和PAA的TSB培養(yǎng)基為對照組，37 ℃下在細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至4 d，使用RNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行生物膜和浮游菌的RNA的提取。然后分別用離心管收集每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中的浮游細(xì)菌。細(xì)胞培養(yǎng)皿用無菌PBS洗滌3 次。使用RNAiso Plus試劑盒從生物膜和浮游細(xì)菌中分離總RNA，然后將每個(gè)RNA樣品用重組DNase I處理。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒對DNase處理的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。稀釋cDNA后，將2 μL cDNA用作實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板，參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix ExTaq?（Tli RNaseH Plus）說明書進(jìn)行測定，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基因和引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因及引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.3.8 大腸桿菌O157:H7生物膜微觀結(jié)構(gòu)觀察

SEM觀察：將菌液接種于48 孔板中，在TSB培養(yǎng)基和BE中分別加入不同含量的LA和PAA，使得LA和PAA終劑量為0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，37 ℃下將無菌聚苯乙烯圓片放進(jìn)孔中培養(yǎng)至4 d，PBS洗滌后將圓片用2.5%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛溶液固定，在4 ℃固定12 h后晾干，使用1%（體積分?jǐn)?shù)）的鋨酸溶液固定90 min，然后依次用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、80%、90%、100%的乙醇梯度脫水，每次10 min，最后使用100%叔丁醇洗滌。將處理后的圓片噴金用于SEM觀察，放大倍數(shù)為5 000[6]。

CLSM觀察：將活化的菌懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，在TSB培養(yǎng)基中分別加入不同含量的LA和PAA，使得LA和PAA終劑量分別為0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，37 ℃培養(yǎng)4 d后，將浮游菌去除后用PBS沖洗掉多余的浮游菌，風(fēng)干后使用LIVE/DEAD染料對生物膜進(jìn)行染色，試劑盒中含有的探針SYTO-9與碘化丙啶能分別使活、死細(xì)胞在CLSM下呈現(xiàn)綠色、紅色熒光，使用染色液時(shí)按照1 mL PBS溶液中分別加入試劑盒中兩種染液各3 μL的比例配制，染液現(xiàn)配現(xiàn)用并避光保存。在風(fēng)干的細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入的500 μL熒光染料，避光染色30 min，吸除染液后使用PBS溶液洗去多余探針，風(fēng)干在細(xì)胞培養(yǎng)板表面滴加無菌水，加蓋玻片，于－20 ℃避光保存。生物膜樣品使用CLSM（配63×油浸物鏡與488 nm氬激光器成像），在480～500 nm發(fā)射波長范圍收集SYTO-9熒光和490～635 nm發(fā)射波長范圍收集碘化丙啶熒光。3D投影使用ZEN Blue Lite 2_3軟件的z-stacks簡易3D功能重建[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)置3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SAS 9.0軟件的混合模型對LA和PAA生物膜抑制作用以及生物膜代謝活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS軟件對生物膜活菌數(shù)、生物膜多糖蛋白含量以及基因相對表達(dá)量進(jìn)行單因素分析，通過t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Bio-Rad CFX Manager軟件對熒光定量基因表達(dá)部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行相對定量處理及分析，采用2?ΔΔCt法評估目標(biāo)基因的相對表達(dá)量變化。采用Sigma Plot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間大腸桿菌O157:H7生物膜中的活菌數(shù)

使用平板計(jì)數(shù)法對大腸桿菌O157:H7在聚苯乙烯表面的生物膜形成能力進(jìn)行了分析，由圖1可知，隨著時(shí)間的延長，生物膜呈現(xiàn)出一種逐漸增高而后穩(wěn)定的趨勢，大腸桿菌O157:H7在培養(yǎng)4 d后生物膜中活菌數(shù)變化不顯著（P＞0.05），說明此時(shí)大腸桿菌O157:H7達(dá)到成熟狀態(tài)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)LA和PAA處理大腸桿菌O157:H7生物膜的時(shí)間為4 d。

圖1 大腸桿菌O157:H7生物膜中活菌數(shù)Fig. 1 Viable cell count in E. coli O157:H7 biofilm as a function of culture time

2.2 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制作用

比較不同劑量LA和PAA處理組與空白對照組的OD600nm可知，LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生長的MIC分別為0.25%和0.002 5%。根據(jù)MIC設(shè)置亞MIC，分析LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制作用。由表2可知，隨著劑量的增加，LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制效果顯著增強(qiáng)。在2 MIC時(shí)，LA和PAA處理下均未檢出生物膜中大腸桿菌O157:H7。在MIC時(shí)，相對于對照組，LA和PAA均顯著抑制了大腸桿菌O157:H7生物膜形成（P＜0.05）。

表2 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜形成的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of LA and PAA on E. coli O157:H7 biofilm formation

2.3 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性的影響

本研究使用CCK-8試劑盒對大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性進(jìn)行測定，CCK-8溶液在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原成具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，其顏色的深度與細(xì)胞的活力成正比。由圖2可知，隨著LA和PAA劑量的增加，大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性的抑制率也隨之增強(qiáng)。2 MIC的LA及PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性的抑制率超過90%，且LA及PAA對代謝活性的抑制率之間無顯著差異（P＞0.05）。LA和PAA劑量為MIC時(shí)，大腸桿菌O157:H7生物膜的代謝活性分別降低了84.25%和43.49%，其中LA抑制作用顯著優(yōu)于PAA（P＜0.05）。

圖2 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性的抑制率Fig. 2 Percentage inhibition of LA and PAA on the metabolic activity of E. coli O157:H7 biofilm

2.4 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜胞外聚合物的影響

圖3 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜EPS質(zhì)量濃度的影響Fig. 3 Effects of LA and PAA on the contents of extracellular polymeric substances in E. coli O157:H7 biofilm

培養(yǎng)至第4天，大腸桿菌O157:H7生物膜EPS中胞外多糖和蛋白質(zhì)量濃度的測定結(jié)果如圖3所示。對照組大腸桿菌O157:H7生物膜中多糖質(zhì)量濃度為9.86 μg/mL，蛋白質(zhì)量濃度為87.78 μg/mL，各組生物膜中胞外蛋白質(zhì)量濃度明顯高于胞外多糖的質(zhì)量濃度。MIC的LA和PAA處理使大腸桿菌O157:H7的胞外多糖和胞外蛋白形成均顯著降低（P＜0.05）。在生物膜形成過程中，細(xì)菌會產(chǎn)生EPS，以減小抗生素、消毒劑等不利環(huán)境的影響，且胞外多糖和胞外蛋白是EPS的主要組成成分[5]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，MIC LA使大腸桿菌O157:H7生物膜的胞外蛋白質(zhì)量濃度減少了88.34%，抑制效果顯著優(yōu)于PAA（P＜0.05）。

2.5 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜微觀結(jié)構(gòu)的影響

對照組和不同劑量LA和PAA處理下大腸桿菌O157:H7生物膜的SEM和CLSM圖像結(jié)果如圖4所示。由SEM結(jié)果可知，未添加有機(jī)酸的對照組中細(xì)菌數(shù)量較多、菌體排列緊密且菌體結(jié)構(gòu)完整。而用MIC、1/2 MIC、1/4 MIC的LA和PAA處理后，大腸桿菌O157:H7生物膜中細(xì)菌排列分散、數(shù)量明顯減少。且LA和PAA的劑量越高對生物膜中細(xì)菌數(shù)量的抑制作用越明顯，即MIC的LA和PAA抑制效果最好，并且可以觀察到在該劑量下兩種有機(jī)酸對大腸桿菌O157:H7的細(xì)菌形態(tài)存在破壞作用。該結(jié)果與生物膜中活菌數(shù)的測定結(jié)果相一致，在MIC下，LA和PAA均能有效的抑制大腸桿菌O157:H7生物膜的形成。相似的，有學(xué)者研究了大腸桿菌O157:H7在LA處理下的生物膜形成，孵育5 d后，對照組形成了成熟的生物膜結(jié)構(gòu)且細(xì)菌細(xì)胞大量積累，而處理組中生物膜數(shù)量少，且較為分散[6]。

由CLSM圖像可以看出，在對照組中細(xì)菌數(shù)量較多并形成了聚集的立體結(jié)構(gòu)，且主要呈現(xiàn)綠色熒光，即生物膜中活菌居多。與SEM結(jié)果類似，加入抑制劑處理后，大腸桿菌O157:H7生物膜中的細(xì)菌生長較為分散，且呈現(xiàn)不同程度的紅色熒光，死菌數(shù)量變多。觀察經(jīng)1/4 MIC、1/2 MIC、MIC的LA和PAA處理后的CLSM圖像，發(fā)現(xiàn)隨著LA和PAA劑量的增加，大腸桿菌O157:H7生物膜中的活菌數(shù)逐漸減少，其中MIC的LA和PAA抑制效果最佳。有學(xué)者用CLSM觀察大腸桿菌O157:H7生物膜的3D結(jié)構(gòu)，同樣發(fā)現(xiàn)在對照組中大腸桿菌O157:H7呈現(xiàn)一個(gè)聚集的空間結(jié)構(gòu)。而用蘋果酸處理后，大多數(shù)細(xì)菌以單個(gè)細(xì)胞的形式存在[17]。綜合SEM和CLSM對大腸桿菌O157:H7生物膜微觀結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果，可知MIC的LA和PAA可有效抑制大腸桿菌O157:H7生物膜形成。

圖4 大腸桿菌O157:H7生物膜對照組及抑制組的SEM和CLSM圖Fig. 4 Scanning electron microscope and confocal laser scanning microscope images of E. coli O157:H7 biofilm in the control and inhibition groups

2.6 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜相關(guān)基因表達(dá)的影響

LA和PAA在MIC下對大腸桿菌O157:H7生物膜基因相對表達(dá)量的影響結(jié)果如圖5所示。LA和PAA均可顯著抑制大腸桿菌O157:H7生物膜中的群體感應(yīng)基因luxS和sdiA、黏附基因csgA和flhC、胞外多糖合成基因csrA、adrB和adrA、應(yīng)激因子rpoS以及PhoP/PhoQ和EnvZ/OmpR雙組分調(diào)控系統(tǒng)中phoQ、phoP、envZ、ompR的表達(dá)（P＜0.05）。但LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜基因相對表達(dá)量的影響也存在差異。LA顯著抑制了全局調(diào)控基因csgD的表達(dá)，而PAA對csgD的表達(dá)沒有顯著作用。PAA顯著抑制了應(yīng)激因子iraM的表達(dá)，而LA則未見抑制作用。

圖5 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜基因表達(dá)的影響Fig. 5 Effects of LA and PAA on gene expression in E. coli O157:H7 biofilm

3 討 論

有機(jī)酸通常被認(rèn)為是一種安全、穩(wěn)定的化合物。未解離的有機(jī)酸具有親脂性，可以通過自由擴(kuò)散穿過細(xì)菌細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，有機(jī)酸在細(xì)胞內(nèi)解離，降低胞內(nèi)pH值，改變細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，從而影響細(xì)菌的正常生命活動，從而起到抑菌作用[18-19]?？紤]到大多數(shù)有機(jī)酸的弱酸性質(zhì)，pH值環(huán)境是有機(jī)酸抑菌效果的主要影響因素，因?yàn)閜H值會影響弱酸的電離平衡，從而決定未離解酸的濃度[20]。PAA由過氧化氫與乙酸反應(yīng)形成，是一種過氧化物類消毒劑，具有使用范圍廣、效率高、毒性小等特點(diǎn)，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛[21-22]。PAA具有強(qiáng)氧化性，可以氧化細(xì)菌生命活動所需的關(guān)鍵酶、氨基酸和核酸等，并使DNA雙鏈被打開并發(fā)生裂解，從而達(dá)到抑菌的效果。LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的有顯著的抑制作用，但不同濃度LA和PAA對其抑制效果不一致。有研究評估了乙酸、檸檬酸和LA處理對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制效果，其中2%（體積分?jǐn)?shù)）LA的生物膜抑制率為39.13%，與檸檬酸相比，LA和乙酸對大腸桿菌生物膜形成的抑制作用更強(qiáng)[23]。在生物膜形成過程中，微生物會產(chǎn)生EPS，EPS限制了消毒劑向生物膜中的擴(kuò)散，消毒劑和生物膜成分之間可能存在相互作用[24]。因此，生物膜中微生物緩慢生長的狀態(tài)增加了其對消毒劑的抗性。本研究發(fā)現(xiàn)LA和PAA可以通過抑制大腸桿菌O157:H7 EPS的形成抑制生物膜產(chǎn)生，且LA對胞外蛋白的抑制效果優(yōu)于PAA。相似的，Amrutha等[23]評估了乙酸、檸檬酸和LA處理對大腸桿菌O157:H7生物膜形成能力的影響，結(jié)果表明LA處理使大腸桿菌O157:H7生物膜中EPS含量減少了13.42%，而檸檬酸和乙酸處理分別僅減少了6.25%和10.89%，LA抑制EPS產(chǎn)生的效果要優(yōu)于檸檬酸和乙酸。與本研究中SEM和CLSM結(jié)果一致，MIC的LA及PAA處理后，大腸桿菌O157:H7生物膜中細(xì)菌數(shù)量明顯減少，且大多呈現(xiàn)黃色甚至是紅色熒光，生物膜結(jié)構(gòu)遭到破壞。綜上所述，LA和PAA抑制了大腸桿菌O157:H7生物膜中的多糖和蛋白的產(chǎn)生，使得EPS對細(xì)菌的保護(hù)作用減弱，LA及PAA更容易進(jìn)入到生物膜內(nèi)部，從而導(dǎo)致生物膜中菌體數(shù)量減少。

生物膜的形成受到很多因素的影響，形成過程是菌體多種特性共同作用的結(jié)果，其形成的相互作用機(jī)制一直都是研究的重點(diǎn)，尤其是基因水平的影響。本實(shí)驗(yàn)從可能影響大腸桿菌O157:H7生物膜的特性入手，通過對群體感應(yīng)基因（luxS、sdiA）、黏附基因（csgA、flhC）、全局調(diào)控基因（csgD）、應(yīng)激響應(yīng)因子（rpoS、iraM）、多糖合成相關(guān)基因（csrA、adrB、adrA）、PhoP/PhoQ和EnvZ/OmpR雙組分調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因（phoQ、phoP、envZ、ompR）的分析，研究LA和PAA對這些調(diào)控基因在大腸桿菌O157:H7生物膜形成中的抑制規(guī)律，為進(jìn)一步闡明其抑制機(jī)制提供參考。本研究發(fā)現(xiàn)，LA和PAA處理后黏附相關(guān)基因受到顯著抑制，進(jìn)而抑制生物膜形成。在Hidalgo等[25]的研究中，蔓越莓提取物的加入能夠有效減小Escherichia coliCFT073的泳動能力，并且根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果顯示鞭毛蛋白合成基因表達(dá)量下降，判定蔓越莓提取物可以通過抑制鞭毛的合成從而達(dá)到降低細(xì)菌泳動能力的作用進(jìn)而抑制生物膜形成。Cong Yanguang等[26]的研究中也曾提到鞭毛合成相關(guān)基因的缺失能夠降低Citrobacter freundii細(xì)菌群體泳動能力，阻礙細(xì)菌在物體表面的移動。因此，抑菌劑對細(xì)菌附著過程成中黏附相關(guān)基因的抑制是其抑制生物膜形成的關(guān)鍵。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，LA和PAA均顯著的抑制了群體感應(yīng)基因（luxS、sdiA）的表達(dá)。有報(bào)道表明群體感應(yīng)效應(yīng)與細(xì)菌生物膜的形成、毒力侵襲特性和應(yīng)激響應(yīng)等生理特性密切相關(guān)[27]。因此，LA和PAA在MIC下抑制大腸桿菌O157:H7的群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)同樣是其有效抑制生物膜形成的關(guān)鍵原因。除上述機(jī)制外，LA和PAA均顯著抑制了多糖合成相關(guān)基因csrA、adrB和adrA的表達(dá)，這一結(jié)果解釋了圖3中MIC下LA和PAA對大腸桿菌O157:H7胞外多糖的顯著抑制作用。胞外多糖和蛋白是生物膜EPS的重要組成部分[24]，因此LA和PAA可通過抑制大腸桿菌O157:H7胞外多糖和蛋白的產(chǎn)生來抑制其生物膜形成。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在禽致病性大腸桿菌中，phoP在禽致病性大腸桿菌生物膜形成中起著重要的調(diào)節(jié)作用，phoP的缺失減少了生物膜的形成[28]。本研究結(jié)果表明，LA和PAA均顯著抑制了PhoP/PhoQ雙組分調(diào)控的表達(dá)，但LA及PAA對phoP、phoQ基因表達(dá)無顯著差異。RpoS應(yīng)激蛋白通過轉(zhuǎn)錄因子CsgD控制生物膜的形成和對環(huán)境脅迫的響應(yīng)，研究表明缺乏rpoS的大腸桿菌細(xì)胞無法形成正常的生物膜[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，LA及PAA均可以抑制rpoS的相對表達(dá)量。不同抑菌劑對細(xì)菌的抑制機(jī)制存在差異[30-31]，在本研究中，部分基因（csgD、iraM）在LA或PAA的作用下表達(dá)量沒有顯著降低，這表明LA和PAA處理對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制機(jī)制存在一定差異，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

LA及PAA在MIC下均可以通過抑制大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性和胞外蛋白和多糖的合成有效抑制大腸桿菌O157:H7生物膜的形成。且通過分析成膜關(guān)鍵基因表達(dá)量進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，LA和PAA在MIC下均有效抑制了大腸桿菌O157:H7的黏附相關(guān)基因、群體感應(yīng)相關(guān)基因、多糖合成相關(guān)基因以及雙組分調(diào)控系統(tǒng)。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制機(jī)制尚存在一定差異。因此，應(yīng)進(jìn)一步探究LA和PAA對基因作用的靶點(diǎn)，從而尋找特異性干預(yù)或檢測靶點(diǎn)以減少大腸桿菌O157:H7生物膜產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。在大腸桿菌O157:H7生物膜生長過程中，菌株所處的環(huán)境以及生長狀態(tài)也會影響大腸桿菌O157:H7生物膜的形成機(jī)制。生物膜的形成和黏附在不同環(huán)境中可能是通過不同的機(jī)制完成的。這些菌株可能利用不同的策略，并根據(jù)可利用的培養(yǎng)條件不同使抑制劑針對生物膜形成的不同路徑起作用，而這些內(nèi)容還有待于進(jìn)一步研究。