劉書紅

（邯鄲市中心醫(yī)院藥學部，河北 邯鄲 056000）

急性心肌梗死是臨床較為常見的急危重癥。藥物溶栓或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療使血流再通是臨床上搶救急性心肌梗死患者的關鍵[1]。血流再灌注過程常導致心肌的二次損傷，即心肌缺血再灌注損傷，病理生理學研究發(fā)現(xiàn)氧化應激、炎癥反應與心肌缺血再灌注損傷密切相關。山楂葉總黃酮（hawthorn leaves flavonoids，HLF）是從山楂樹葉子中提取的黃酮類化合物，具有良好的抗氧化、抗炎活性[2-3]，研究[4-5]發(fā)現(xiàn)HLF 能夠通過抑制氧化應激損傷和炎癥反應對肺組織、腦組織缺血再灌注損傷起到一定保護作用。蛋白激酶B/核因子E2相關因子2（protein kinase B/Nuclear factor E2 related factor 2，Akt/Nrf2）通路在機體氧化應激和炎癥反應中發(fā)揮著重要調控作用[6]。本實驗通過夾閉左冠狀動脈前降支30 min 復制心肌缺血再灌注大鼠模型，以臨床治療心肌缺血再灌注一線用藥維拉帕米（Verapami，Ver）作為陽性對照藥物，探究HLF 對心肌缺血再灌注后心肌組織病理學改變的影響以及Akt/Nrf2 通路在其中發(fā)揮的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠192 只，7 周齡，210 g～240 g，購自河北省實驗動物中心[SCXK（冀）2018-004]；實驗前適應性飼養(yǎng)1 周，環(huán)境設置：室溫（25±1）℃，相對濕度（60±5）%，明暗12 h交替，實驗前12 h禁食不禁水。本研究經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會審核批準[批件號：HDZXLL（K）字2020-036]。

1.2 藥物與試劑 HLF 購自山西晉城中晉藥業(yè)有限公司，總黃酮含量≥95%，批號：20 190527；Ver 購自哈藥集團三精制藥股份有限公司，規(guī)格：2 mL，5 mg，批號：190412；硝基藍四氮唑（nitro blue tetrazolium，NBT）購自上海前進試劑廠，批號：190105；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫（enzymelinked immunoassay，ELISA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號：20190413、20190127、20190506、20190411、20190317、20 190125；Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）抗體購自英國Abcam 公司，批號：ab179463、ab38449；Nrf 2、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗體購自北京博奧森生物科技有限公司，批號：20190131、20 190427；β-actin 抗體購自美國CST 公司，批號：3700S；山羊抗兔IgG 二抗購自美國Bioworld 公司，批號：BS13278。

1.3 動物分組、給藥與模型制備 按照隨機數(shù)表法，將192 只實驗用SD 大鼠分為假手術組、模型組、HLF（25、50、100 mg/kg）組和Ver 1 mg/k 組[7-9]，各32 只；造模前10 min 腹腔注射給藥，假手術組和模型組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液。除假手術組外的其他組大鼠均參照文獻[10]報道的夾閉左冠狀動脈前降支30 min 的方法復制心肌缺血再灌注大鼠模型，夾閉左冠狀動脈前降支后心電圖ST 段弓背抬高、T 波高聳，30 min 后恢復血流再灌注后ST 段抬高降低、T 波降低，即可判定為造模成功；假手術組行手術通路但不夾閉冠狀動脈前降支。再灌注2 h 后檢測各指標。

1.4 觀察指標

1.4.1 心肌梗死體積檢測 各組隨機取8 只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，開胸后取左冠狀動脈前降支血流供應區(qū)的左心室組織，2 mm 厚度切片，置濃度2%的NBT溶液、恒溫37 ℃避光孵育1 h（正常區(qū)呈紫黑色），通過圖像分析系統(tǒng)計算心肌梗死體積。

1.4.2 心肌組織病理學檢查及損傷評分 各組隨機取8只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，開胸后取左冠狀動脈前降支血流供應區(qū)的左心室組織，置濃度4%多聚甲醛溶液常溫固定72 h后，行石蠟浸泡包埋、5 μm 厚度切片、脫蠟水化、HE 染色（蘇木素溶液染色10 min、伊紅水溶液染色3 min）、梯度乙醇脫水和二甲苯透明后采用中性樹膠封片，通過顯微鏡觀察。損傷評分：根據(jù)心肌組織病變面積分別從出血、間質水腫、中性粒細胞浸潤、變性壞死4個方面進行評分：未見病變計0分，病變視野比例≤1/4 計1 分、＞1/4 計2 分、≥1/2 計3 分，4 個方面之和即為損傷評分。

1.4.3 心肌細胞超微結構觀察 各組隨機取8只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，開胸后取左冠狀動脈前降支血流供應區(qū)的左心室組織，切割成5 mm3組織塊置于4℃、4%戊二醛固定24 h，4 ℃、1%鋨酸固定3 h，然后依次進行脫水、氧化丙烯置換、環(huán)氧樹脂包埋處理后，70 nm 厚度超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重電子染色后通過透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構。

1.4.4 心肌組織生化指標檢測 取各組剩余的8 只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，開胸后取左冠狀動脈前降支血流供應區(qū)的左心室組織，剪碎、研磨勻漿后加入4 ℃裂解液，冰上靜置30 min 充分裂解，4 ℃、3 500 rpm 離心15 min 取上清液，采用硫代巴比妥酸法檢測心肌MDA 含量，黃嘌呤氧化法、鉬酸銨法檢測SOD、CAT 活力，ELISA 法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.4.5 心肌組織蛋白表達檢測 取1.4.4 制備的心肌組織勻漿液，4 ℃、12 000 rpm 離心30 min 取上清液，BCA 法測定總蛋白量、沸水浴5 min 行蛋白高溫變性，取30 μg總蛋白行SDS-PAGE膠電泳分離、轉PVDF膜、5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h、滴加目標蛋白、β-actin一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后滴加IgG 二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加DAB 顯色劑，以β-actin 為內參，通過條帶灰度值半定量目的蛋白相對表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 17.0 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，多樣本間比較行單因素方差分析，樣本間兩兩比較行LSD-t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HLF 對心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死體積的影響 與假手術組比較，模型組心肌梗死體積百分比顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，HLF 50、100 mg/kg 組和Ver 1 mg/kg 組心肌梗死體積百分比顯著降低（P＜0.01）；與Ver 1 mg/kg 組比較，HLF 100 mg/kg組心肌梗死體積百分比顯著降低（P＜0.01）。見表1。

2.2 HLF 對心肌缺血再灌注大鼠心肌組織病理學改變及損傷評分的影響 假手術組大鼠左心室心肌纖維排列整齊有序、心肌細胞形態(tài)結構正常，未見異常；模型組呈現(xiàn)心肌纖維紊亂無序，可見部分心肌纖維斷裂，心肌細胞數(shù)量減少，胞核固縮、深染、偏移，可見炎性細胞浸潤；較模型組，HLF 各劑量和Ver 1 mg/kg組左心室心肌組織病理學改變呈不同程度減輕；其中HLF 100 mg/kg 組未見心肌纖維斷裂和胞核偏移，炎性細胞浸潤較少。損傷評分：較假手術組，模型組左心室心肌損傷評分顯著升高（P＜0.01）；較模型組，HLF 50、100 mg/kg 組和Ver 1 mg/kg 組損傷評分顯著降低（P＜0.01）；較Ver 1 mg/kg 組，HLF 100 mg/kg組損傷評分顯著降低（P＜0.05）。見表1，圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學改變的影響（×200 倍，n =8）

表1 各組大鼠心肌梗死體積和損傷評分比較（，n =8）

表1 各組大鼠心肌梗死體積和損傷評分比較（，n =8）

注：與假手術組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與Ver 組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

2.3 HLF 對心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞超微結構改變的影響 假手術組左心室心肌細胞膜、胞核、細胞器、染色質等超微結構均未見異常；模型組可見胞膜破裂，肌絲溶解斷裂，線粒體數(shù)量減少、膜破裂、嵴斷裂溶解，核仁邊界不清，染色質固縮等超微結構病變；較模型組，HLF 各劑量和Ver 1 mg/kg 組心肌細胞超微結構病變呈不同程度減輕，其中HLF 100 mg/kg組線粒體數(shù)量較多、結構完整，核較為清晰，染色質分布均勻。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌細胞超微結構改變的影響（×10 000 倍，n=8）

2.4 各組大鼠心肌組織MDA 含量和SOD、CAT 活力的影響 見表2。

表2 各組大鼠心肌組織MDA 含量和SOD、CAT 活力的影響（，n =8）

表2 各組大鼠心肌組織MDA 含量和SOD、CAT 活力的影響（，n =8）

注：與假手術組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△ P ＜0.01；與Ver 組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

2.5 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響 見表3。

表3 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響（，n =8） pg/mg

表3 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響（，n =8） pg/mg

注：與假手術組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△ P ＜0.01；與Ver 組比較，▲P ＜0.05

2.6 HLF 對心肌缺血再灌注大鼠心肌Akt、p-Akt、Nrf2、NF-κB 蛋白表達及Akt 磷酸化的影響 與假手術組比較，模型組左心室心肌p-Akt、Nrf2 表達明顯下調而NF-κB 表達明顯上調、Akt 磷酸化（p-Akt/Akt）顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，HLF 50、100 mg/kg 組和Ver 1 mg/kg 組p-Akt、Nrf2 表達明顯上調且NF-κB 表達明顯下調（P＜0.01），Akt 磷酸化顯著升高（P＜0.01）；與Ver 1 mg/kg 組比較，HLF 100 mg/kg 組p-Akt、Nrf2 表達上調且NF-κB 表達下調（P＜0.05或P＜0.01），Akt磷酸化升高（P＜0.01）。見圖3，圖4。

圖3 各組大鼠心肌Akt、p-Akt、Nrf2、NF-κB 蛋白表達的影響（n =8）

圖4 各組大鼠心肌Akt、p-Akt、Nrf2、NF-κB 蛋白相對表達及Akt 磷酸化的影響

3 討論

近年來，急性心肌梗死發(fā)生率呈逐年上升趨勢，及時通過藥物或手術治療恢復血流能夠挽救部分急性心肌梗死患者生命。心肌缺血再灌注損傷嚴重影響著急性心肌梗死患者預后。

HLF 為山楂葉的主要有效成分，具有良好的抗炎、抗氧化等藥理學作用。山楂葉為常用中藥品種，《本草綱目》有記載山楂葉性平、味酸，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂之功效，多用于氣滯血瘀、胸痹心痛等癥的治療。本實驗結果顯示，HLF 治療能夠有效降低心肌缺血再灌注大鼠左心室心肌梗死體積，改善心肌纖維斷裂、紊亂及炎性細胞浸潤、心肌細胞壞死等病理性改變，降低心肌損傷評分，改善心肌細胞膜破裂、線粒體數(shù)量減少、嵴斷裂溶解、染色質固縮等超微結構病變，并且HLF 100 mg/kg 組效果優(yōu)于Ver 1 mg/kg 組，提示HLF 對心肌缺血再灌注大鼠心肌病理學改變和細胞超微結構病變具有保護作用。

氧化應激和炎癥反應在心肌缺血再灌注損傷疾病進展過程中發(fā)揮著重要作用。急性心肌梗死及血流再灌注過程，線粒體電子傳遞鏈遭破壞導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量生成、以ROS 為底物的SOD、CAT 等抗氧化酶被過度消耗，致使ROS不能被還原代謝而蓄積，攻擊核酸、蛋白質等大分子，破壞生物膜不飽和脂肪酸，生成具有生物毒性的MDA[11]。心肌缺血發(fā)生后將病理性刺激炎癥因子大量釋放，其中TNF-α、IL-1β、IL-6 做為炎性趨化因子，能夠激發(fā)炎癥反應而損傷心肌組織，并且TNF-α、IL-1β 能夠刺激機體免疫應激，進一步促進炎癥因子產(chǎn)生和釋放，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應[12]；IL-6 能夠激活炎癥細胞而加重炎癥反應，能夠刺激血管內皮細胞釋放ROS[13]。本實驗結果顯示，HLF 治療能夠有效降低心肌缺血再灌注大鼠左心室心肌MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6 含量，提高SOD、CAT 活力，并且HLF 100 mg/kg組效果優(yōu)于Ver 1 mg/kg 組，提示HLF 對心肌缺血再灌注大鼠心肌氧化應激和炎癥反應具有抑制作用。

Nrf2 是一種核轉錄因子，對細胞氧化應激反應具有重要的調控作用[14]，生理狀態(tài)下的Nrf2 與抑制劑Keap1 結合以無活性狀態(tài)存在。Akt 是一種原癌基因，被磷酸化（p-Akt）激活后，能夠誘導Nrf2 與Keap1 復合體解離，促進Nrf2 核轉位并上調表達[15]。Nrf2 能夠與激活抗氧化反應元件結合而誘導抗氧化酶（包括SOD、CAT）轉錄表達[16]；HO-1 為Nrf2 下游基因，研究[17]發(fā)現(xiàn)Nrf2/HO-1 通路是保護心血管系統(tǒng)氧化應激損傷的重要途徑，HO-1 能夠被Nrf2 誘導核轉位和上調表達，HO-1 能夠催化降解血紅素、CO 等，抑制氧化應激損傷。NF-κB 能夠誘導TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細胞因子大量釋放。任國強等[18]通過藥物抑制NF-κB 表達能夠顯著降低心肌缺血再灌注大鼠炎癥反應。研究[19]發(fā)現(xiàn)HO-1 能夠抑制NF-κB 啟動子IKKβ磷酸化進而抑制NF-κB 活化。本實驗結果顯示，HLF治療能夠明顯上調心肌缺血再灌注大鼠左心室心肌p-Akt、Nrf2 表達并提高Akt 磷酸化，下調NF-κB 表達，HLF 100 mg/kg 組對p-Akt、Nrf2、NF-κB 表達的調控作用優(yōu)于Ver 1 mg/kg 組，提示HLF 對心肌缺血再灌注大鼠心肌氧化應激和炎癥反應的抑制作用可能與激活Akt/Nrf2 通路有關。

綜上所述，HLF 對心肌缺血再灌注大鼠心肌病理學改變和細胞超微結構病變具有保護作用，作用機制可能與激活Akt/Nrf2 通路，抑制氧化應激和炎癥反應有關。