呂艷杭，吳姍姍，王振常*，溫智稀，段桂姣，符燕青，蘇曉文，農(nóng)小欣

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍巖市中醫(yī)院，福建 龍巖 364200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧 530222；3.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院脾胃肝病科，南寧 530201）

肝纖維化是慢性肝病的共同病理階段。適當(dāng)?shù)闹委煷胧┛赡孓D(zhuǎn)肝纖維化或早期肝硬化的病理狀態(tài)，控制肝纖維化的發(fā)展，對于肝硬化甚至肝癌的防治起著至關(guān)重要的作用[1-3]。前期研究[4-6]證實柔肝化纖顆粒能從多途徑、多方位、多靶點抗肝纖維化作，具有健脾補腎柔肝、兼顧解毒活血、化痰軟堅散結(jié)功效，具有抗肝纖維化作用，但該復(fù)方抗肝纖維化效果及機制尚不清晰。本研究采用經(jīng)典的 CCl4復(fù)合因素建立肝纖維化大鼠模型為研究對象，探討柔肝化纖顆粒預(yù)防大鼠肝纖維化作用機制，以期為中藥新藥的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

柔肝化纖顆粒由黃芪、牡蠣、黃精、枸杞、薏苡仁、橘紅、澤蘭、雞內(nèi)金、鱉甲、虎杖、牡丹皮、黑棗組成，具有抗氧化、抗炎及抗纖維化等多種藥理和生物學(xué)作用[7-9]。黃芪健脾益氣、利尿排毒，佐黃精加強補宜氣血、健脾化濕功效；枸杞子滋養(yǎng)肝腎、益精明目，佐黑棗滋養(yǎng)陰血，二者共奏滋養(yǎng)陰血，補腎柔肝之效，肝體得養(yǎng)、陰血得充，恢復(fù)肝臟得功能，佐雞內(nèi)金加強益精之效；牡蠣軟堅散結(jié)、平肝潛陽，合鱉甲加強軟堅散結(jié)、活血化瘀、破血消癥之效，橘紅燥濕化痰、通利三焦；澤蘭芳香悅脾以扶氣、行水腫，疏利悅肝以行血，具有活血化瘀而不傷正氣，行血消腫而溫中功效，橘紅、澤蘭、鱉甲、生牡蠣四者合用共奏“活血祛瘀、化痰散結(jié)”，主要通過“活血化痰”調(diào)整氣血關(guān)系、達到“血和則經(jīng)脈流行”；加虎杖化痰散瘀，清熱解毒以除濕熱瘀邪。本實驗通過觀察柔肝化纖顆粒對肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1及Numb 表達的影響，進一步闡明柔肝化纖顆粒預(yù)防大鼠肝纖維化的作用機制，為傳統(tǒng)中藥新藥的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計 采用隨機抽取動物對照實驗。

1.2 時間與實驗地點 本實驗于2018 年2 月－2019年10 月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心、廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實驗室、中醫(yī)內(nèi)科實驗室完成。

1.3 材料

1.3.1 實驗動物 成齡SPF 級Wistar 大鼠72 只，體質(zhì)量在120～160 g，均購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究所[動物實驗合格證：SCXK（桂）2018-0001]。

1.3.2 藥物 柔肝化纖顆粒方藥組成：生黃芪45 g，黃精 20 g，生牡蠣 30 g，鱉甲 30 g，薏苡仁 45 g，枸杞子 20 g，橘紅 12 g，澤蘭 30 g，雞內(nèi)金 15 g，虎杖 20 g，黑棗 15 g。藥物免煎顆粒劑由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，嚴(yán)格按照說明書上的克數(shù)進行換算。秋水仙堿（北京盛世康普化工技術(shù)研究所，生產(chǎn)批號：170821）。

1.3.3 主要儀器設(shè)備與試劑 儀器設(shè)備與試劑均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)及廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院提供。5417R 低溫高速離心機，德國Eppendoff公司；IX71-22FL/PH 顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；SHANDON 石蠟切片機，全自動生化分析儀（ES-480），南京頤蘭貝生物科技有限公司。ROS，南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20 160629；MDA 試劑盒，南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20 170810；4-HNE 試劑盒，南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：32102；四氯化碳（CCl4）分析純，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；花生油，山東煙臺萊陽魯花濃香花生油有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 采用成齡SPF 級Wistar 大鼠72 只，雌雄各半，適應(yīng)飼養(yǎng)1 周，隨機分為6 組，取10 只大鼠作為正常對照組（不做任何處理，正常飼養(yǎng)），剩余62 只大鼠采用CCl4復(fù)合因素行肝纖維化造模，隨機抽取2 只證實肝纖維化造模成功，取造模成功后的60 只大鼠隨機分為肝纖維化模型組、秋水仙堿組、柔肝化纖顆粒低劑量組（2 mg/kg）、柔肝化纖顆粒中劑量組（4 mg/kg）、柔肝化纖顆粒高劑量組（8 mg/kg），每組12 只。

1.4.2 實驗處理 本實驗采用CCl4聯(lián)合植物油混懸液復(fù)合因素誘導(dǎo)[10]，進行肝纖維化造模，此法參照韓德五法進行改進，采用皮下注射40% CCl4（第1 次使用5 mL/kg 體質(zhì)量，以后每隔3 天以每3 mL/kg 體質(zhì)量，每周2 次，共8 周）皮下注射，聯(lián)合高脂低蛋白食物（以玉米面為飼料，實驗第1 周、第2 周加用0.5%膽固醇、20%豬油），為了防止肝纖維化自然修復(fù)對實驗結(jié)果造成的影響，除正常對照組外，其余各組仍每周腹腔注射1 次40% CCl4油劑，每次3 mL/kg 體質(zhì)量；正常對照組正常飼養(yǎng)，同時采用同體積花生油皮下注射8 周后灌胃予同體積的生理鹽水，肝纖維化模型組造模成功8 周后予灌胃秋水仙堿，以0.01 mg/100 g 體質(zhì)量給予，每周5 次，共8 周；柔肝化纖顆粒低劑量、中劑量、高劑量組造模8 周后分別灌胃柔肝化纖顆粒溶液（2、4、8 mg/kg），每周3 次，共8 周。

1.4.3 標(biāo)本采集與處理 各組分別于用藥8 周后，禁食12 h，經(jīng)1%戊巴比妥麻醉，股靜脈采血后處死，開腹剖取肝臟，每只均取肝臟右葉相同部位的組織置入10%的甲醛，另一部分于-80℃液氮速凍中保存待檢。凍存的肝臟組織置于冰水浴中勻漿 10 min，制成 10%的組織勻漿，繼以 3 000 r/min，離心半徑為30 cm，離心 10～ 15 min，吸取上清液，測定ROS、MDA 及4-HNE 值。

1.5 實驗室指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 常規(guī)肝臟組織的病理學(xué)檢測 取肝臟組織，使用4%多聚甲醛固定，梯度經(jīng)久脫水，石蠟包埋，經(jīng)組織切片后進行HE 染色及Masson 染色，封片后使用顯微鏡拍照，分析肝臟病理及纖維化情況。

1.5.2 各組肝功能指標(biāo)檢測 采用AU 5400 型全自動生化儀（美國Beckman Coulter 公司）檢測大鼠血清AST、ALT、ALB、TBIL。

1.5.3 ROS、MDA 及4-HNE 檢測 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.4 qRCR 檢測 RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄PCR：將30 mg肝臟組織置于1 000 μL Trizol 裂解液（Solarbio，R1100）中，充分裂解混勻后，加入500 μL 氯仿，4℃，12 000 g 離心15 min 后400 μL 上層水相，加入400 μL異丙醇后，4℃，12 000 g 離心10 min 獲得RNA 沉淀，經(jīng)70%酒精洗滌后，晾干，使用無RNA 酶水進行溶解，使用超微量核酸檢測儀（Suizhen，F(xiàn)C-1100）進行RNA 濃度及純度檢測，后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Monad，RN05004M）說明書進行逆轉(zhuǎn)錄操作，所得cDNA 置于-20℃保存待用。引物序列與產(chǎn)物長度，見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度

qPCR 反應(yīng)體系為：SYBR Green Premix Taq（Monad，RN04006M）:5 uL，cDNA：1 uL，Primer Forward（10 uM）：0.3ul，Primer Reverse（10 uM）：0.3 uL，H2O：3.4 uL，反應(yīng)程序：預(yù)處理95℃：30 s；PCR 循環(huán)（40 循環(huán)）：95 ℃：5 s，60 ℃：30 s，72 ℃：15 s；溶解曲線：標(biāo)準(zhǔn)溶解曲線程序。實驗儀器為ABI 7500 定量PCR 儀（ABI 7500）。經(jīng)實驗獲得的數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件進行整理及分析，采用2-ΔΔCT法進行分析。

1.5.5 Western Blot 檢測 組織蛋白提?。喝?0 mg 組織塊置于離心管中，加入400 uL RIPA-PMSF 裂解液（Solarbio，R0010），勻漿后于4℃，12 000 rpm 離心5 min，取上清采用BCA 法測定蛋白含量。4×蛋白上樣buffer（Solarbio，P1016）100 ℃變性5～10 min。蛋白電泳：80 V 恒壓電泳約20 min，待樣品進入分離膠層后，換用100 V 恒壓電泳1～1.5 h；轉(zhuǎn)膜：200 mA恒流轉(zhuǎn)膜60～90 min?？贵w孵育：用TBST（Solarbio，T1081）配制體積分?jǐn)?shù)為8%的脫脂奶粉（Solarbio，D8340）作為封閉液，將膜放入封閉液中封閉3 h。按抗體說明書上的推薦比例使用封閉液將一抗[Anti-TGF-β1抗 體（Abcam，ab9628），Anti-Numb 抗 體（Abcam，ab84865）]；Anti-β-actin 抗 體（Abcam，ab8227）；抗進行稀釋，將膜放入稀釋后的一抗中4℃孵育12 h。一抗孵育完成后，使用TBST 洗膜3 次，每次15 min。將膜放入按1:3000 比例稀釋的二抗（goat anti-rabbit：Abcam，ab6721）中37 ℃ 孵育1 h，使用TBST（Solarbio，T1081）洗膜3 次，每次15 min 使用ECL 顯色劑（Solarbio，PE0010）對膜進行顯色，于凝膠成像儀（Tanon，5200）中進行曝光成像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件處理實驗數(shù)據(jù)，均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柔肝化纖顆?？擅黠@改善肝纖維化情況 經(jīng)HE染色及Masson 染色，與模型組相比，秋水仙堿、柔肝化纖顆粒干預(yù)后，大鼠肝纖維化程度均有不同程度降低，秋水仙堿組、柔肝化纖顆粒高劑量組顯著，見圖1。

圖1 肝組織石蠟切片HE 染色及Masson 染色觀察肝纖維程度

2.2 大鼠血清中肝功能指標(biāo)變化比較 見表2。

表2 大鼠血清中肝功能指標(biāo)變化比較（）

表2 大鼠血清中肝功能指標(biāo)變化比較（）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與秋水仙堿組比較，▲▲P ＜0.01

2.3 各組大鼠肝組織中ROS、MDA、4-HNE 指標(biāo)變化比較 見表3。

表3 各組大鼠肝組織中ROS、MDA、4-HNE 指標(biāo)變化比較（）

表3 各組大鼠肝組織中ROS、MDA、4-HNE 指標(biāo)變化比較（）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與秋水仙堿組比較，▲▲P ＜0.01

2.4 各組大鼠肝組織 TGF-β1及Numb 含量指標(biāo)變化比較 見表4。

表4 各組大鼠肝組織 TGF-β1 及Numb 含量指標(biāo)變化比較（，n =10） %

表4 各組大鼠肝組織 TGF-β1 及Numb 含量指標(biāo)變化比較（，n =10） %

注：與正常組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與秋水仙堿組比較，▲▲P ＜0.01

2.5 各組大鼠肝組織 TGF-β1及Numb 蛋白表達變化比較 見表5。

表5 各組大鼠肝組織 TGF-β1 及Numb 蛋白表達變化比較（）

表5 各組大鼠肝組織 TGF-β1 及Numb 蛋白表達變化比較（）

注：與正常組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與秋水仙堿組比較，▲▲P ＜0.01

3 討論

肝纖維化是由各種損肝因素導(dǎo)致的肝臟內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理過程，具有肝細胞外基質(zhì)（膠原蛋白、層黏連蛋白）的彌漫性沉積與異常分布及肝竇毛細血管化等病理特征，是各種慢性肝病向肝硬化甚至肝癌發(fā)展過程中的必經(jīng)階段，是影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)。研究[11]證實，參與肝纖維化的細胞有肝星狀細胞（HSC）、肝巨噬細胞（Kuffer）、肝竇內(nèi)皮細胞等，而肝星狀細胞（HSC）的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。正常情況下，肝星狀細胞處于靜息狀態(tài)，當(dāng)肝臟受到各種損肝因素刺激時，處于靜息狀態(tài)的HSC發(fā)生表型改變，即發(fā)生上皮-間質(zhì)（EMT）轉(zhuǎn)化。肝細胞受到刺激后受損凋亡可激活kuffer 細胞、竇內(nèi)皮細胞，促使其分泌ROS、TGF-β1、TNF-α 等細胞因子，活性氧（ROS）可進一步激活HSC 而增加ECM 沉積，HSC 活化可啟動脂質(zhì)過氧化，形成大量的脂質(zhì)過氧化物，如丙二醛（MDA）和4-羥基壬烯酸（4-HNE），可與蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基結(jié)合，形成加合物產(chǎn)生細胞免疫反應(yīng)釋放TGF-β1而激活HSC，王玲[12]研究證實HSC 培養(yǎng)中加入4-HNE 和MDA 培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)可大幅度蛋白產(chǎn)物及膠原蛋白的表達，表明4-HNE 增加HSC 膠原生成的能力強于MDA。熊章鄂[13]研究發(fā)現(xiàn)ROS 可打破氧化-還原平衡，肝炎患者合并長期酗酒者其4-HNE、MDA 免疫球蛋白顯著增加。于晨輝等[14]體內(nèi)外實驗研究表明，外源性4-HNE 與慢性酒精攝入在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中均起著至關(guān)重要的作用，4-HNE 可抑制TNF-α 介導(dǎo)的NF-κB 抗HSC 凋亡而誘導(dǎo)肝纖維化的形成。

肝纖維化發(fā)生時TGF-β1明顯增多，TGF-β1可促進多條信號通路（Smad、Wnt、Notch）以及上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB、Snail、Twist），以上信號通路及轉(zhuǎn)錄因子均可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs、金屬蛋白組織抑制因子TIMP 及血漿纖溶酶原活化抑制因子PAI使ECM 成分增多，刺激I 型及III 型膠原的產(chǎn)生或抑制DNA 合成及HSC 的凋亡[15]。楊博等[16]發(fā)現(xiàn)抑制TGF-β1表達可阻止肝纖維化的進展，甚至逆轉(zhuǎn)。安禎祥等[17]研究顯示TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)SiRNA 可顯著降低肝纖維化大鼠中α-SMA 及膠原蛋白的表達，證實TGF-β1在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。研究[18-19]表明抑制TGF-β1及與其相關(guān)的信號通路可有效減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。本研究證實，給予不同劑量的柔肝化纖顆粒抑制TGF-β1表達較肝纖維化模型組明顯，進一步說明柔肝化纖顆?？擅黠@抑制TGF-β1表達而發(fā)揮肝纖維化的作用。

近年來，Numb 作為一種決定細胞命運的決定因子與Wnt、Notch、Hedgehog 等信號在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中受到廣泛關(guān)注，但是Numb 在肝纖維化發(fā)生中的作用尚未深入探討。張旭等[20]研究發(fā)現(xiàn)膽汁淤積性肝纖維化的肝組織Numb 顯著下降，Notch 信號通路異?；罨ｑ阄牡萚21]文獻報道了Numb 是Wnt 信號通路直接靶標(biāo)，可抑制Notch 和Hedgehog 信號通路，在Notch-Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起到“開關(guān)”作用，因此Numb 基因缺失可能通過阻斷Notch-Wnt 信號通路傳導(dǎo)而進一步誘導(dǎo)肝纖維化的進程。萬贊燕等[22]發(fā)現(xiàn)Wnt3a 可誘導(dǎo)Numb，而在肝纖維化中，Hedgehog 信號作為經(jīng)典Wnt 通路的調(diào)節(jié)，證實了在經(jīng)典Hedgehog 和Wnt信號通路中共同調(diào)節(jié)了HSC 活化。雖然在肝纖維化中與Numb 聯(lián)系尚未明確，但在肺、腎組織纖維化疾病中已證實。章智慧[23]研究發(fā)現(xiàn),過表達的Numb 參與肺纖維化的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進展。劉偉等[24]研究結(jié)果顯示，Numb 過表達在近端小管中會引起細胞周期停滯在G2/M，從而加重腎小管間質(zhì)纖維化，進而加重腎纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化大鼠的肝臟中的Numb 在纖維間隔、肝細胞中大量表達，給予不同劑量的柔肝化纖顆粒干預(yù)，Numb表達較病理模型組減少。故抑制Numb 表達可能是柔肝化纖顆粒預(yù)防肝纖維化作用機制之一。

綜上所述，本研究證實柔肝化纖顆粒能夠顯著減少脂質(zhì)過氧化物、TGF-β1、Numb 的表達而發(fā)揮預(yù)防肝纖維化的作用，為柔肝化纖顆粒發(fā)揮抗肝纖維化的臨床運用奠定基礎(chǔ)，但其具體的作用機制需要我們進一步深入研究。