孟曉君 宋秀賢① 張 悅 宋維佳張培培 申慧慧 俞志明

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266237; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 4. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心山東青島 266071)

赤潮是一種全球性的海洋生態(tài)災(zāi)害, 近年來, 在世界各沿海國(guó)家頻繁暴發(fā), 嚴(yán)重制約海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展、威脅人類食品安全, 特別是有毒甲藻赤潮在世界范圍內(nèi)呈逐年增加的態(tài)勢(shì)(Andersonet al, 2012; 唐贏中等,2016)。其中, 亞歷山大藻(Alexandrium)是一種能夠產(chǎn)生麻痹性貝毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)的典型甲藻, 廣泛分布于我國(guó)沿海。2002～2017 年間, 該藻在我國(guó)近海形成了24 次赤潮(梁玉波等, 2019)。2016上半年智利近海暴發(fā)的鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium cantenella)和Pseudochattonella verruculosa赤潮, 造成智利的三文魚年產(chǎn)量損失了12% (Mascare?oet al,2018)。頻繁暴發(fā)的亞歷山大藻赤潮不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失, 還會(huì)對(duì)人的生命造成威脅。當(dāng)亞歷山大藻赤潮暴發(fā)時(shí), 貝類濾食藻細(xì)胞后可通過食物鏈將PSP 轉(zhuǎn)移到人體, 嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致人類中毒死亡(Briceljet al, 1998)。據(jù)統(tǒng)計(jì), 全球范圍內(nèi)每年約發(fā)生2 000起PSP 中毒事件, 人員死亡率高達(dá)15% (Andersonet al, 2012)。因此, 尋求一種高效、安全的有毒赤潮防控方法尤為重要。

改性粘土治理赤潮主要是依靠粘土顆粒和赤潮生物間的有效碰撞與結(jié)合, 形成粘土-細(xì)胞絮凝體沉降至水體底部, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)水體中赤潮生物的有效去除。該方法具有操作簡(jiǎn)便、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn), 是一種安全、高效的赤潮應(yīng)急處置技術(shù)(俞志明等,2019)。改性粘土對(duì)多種赤潮生物具有理想的去除效果, 0.2 g/L MC I 對(duì)密度為1×104cells/mL 的太平洋亞歷山大藻(Alexandriumpacificum) 3 h 去除率可達(dá)75%(Zhanget al, 2018)。Liu 等(2017)和Zhu 等(2018)研究發(fā)現(xiàn), 改性粘土還會(huì)對(duì)殘留赤潮藻細(xì)胞產(chǎn)生脅迫作用, 抑制赤潮再次暴發(fā)。另外, 以往研究表明, 適宜濃度的改性粘土在高效去除赤潮生物的同時(shí), 對(duì)太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)、仿刺參(Apostichopus japonicas Selenka)、蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)、硬殼蛤(Mercenaria mercenaria)、大西洋鮭(Salmo salar)等多種生物無不良影響(高詠卉等, 2007; 王志富等, 2014; 王梓瞳等, 2019; 張培培等, 2019)。

不同貝類對(duì)PSP 的累積和排出速率不同, 存在明顯的種間差異, 通常相較于牡蠣和蛤類, 扇貝對(duì)PSP的累積毒性高, 排出慢(邱江兵, 2014)。因此, 扇貝更易受到亞歷山大藻的影響, 造成PSP 在其體內(nèi)的累積。其中蝦夷扇貝隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、珍珠貝目(Pteriodia)、扇貝科(Pectinidae), 是我國(guó)北方重要的養(yǎng)殖貝類。蝦夷扇貝在遼寧沿海的養(yǎng)殖面積達(dá)70 余萬公頃, 年產(chǎn)量超20萬噸, 產(chǎn)值達(dá) 50 億元(全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,2018)。近年來蝦夷扇貝體內(nèi)PSP 的檢出率較高, 時(shí)文博等(2020)在抽查天津市市場(chǎng)銷售的9 種經(jīng)濟(jì)貝類中 PSP 含量時(shí)發(fā)現(xiàn), 蝦夷扇貝的檢出率最高, 達(dá)66.7%。改性粘土可高效防控亞歷山大藻赤潮, 但對(duì)蝦夷扇貝體內(nèi)PSP 的影響尚不清楚。本研究以蝦夷扇貝為受試生物, 考察了改性粘土絮凝亞歷山大藻后貝類體內(nèi)PSP 含量、組分的變化, 初步分析了帶來這些影響的原因, 以期為現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

改性粘土材料由廣西北海的高嶺土經(jīng)聚合氯化鋁(poly aluminum chloride, PAC)改性處理配制而成,本文稱之為 MC I, 制備方法詳見文獻(xiàn)(俞志明等,1994)。配制MC I 母液濃度為40 g/L。

蝦夷扇貝取自山東威海榮成尋山集團(tuán), 扇貝規(guī)格為殼長(zhǎng)(48.0±7.10) mm、殼高(47.55±5.55) mm, 實(shí)驗(yàn)前馴化7 d。海水取自青島匯泉灣近海, 馴化條件為pH值7.8～8.2, 溫度14～18 °C, 均勻充氣, 使溶解氧保持＞5 mg/L, 自然光照培養(yǎng)。每日投喂適量小新月菱形藻(Nitzschia closterim f.minutissima)。

太平洋亞歷山大藻(A.pacificum)取自中科院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。培養(yǎng)海水經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后, 121 °C 高溫滅菌30 min, 在光照65 μmol photon/(m2·s), 光暗比為L(zhǎng)∶D=12 h∶12 h, 溫度19～21 °C 下, 采用L1 培養(yǎng)液培養(yǎng)。選擇指數(shù)生長(zhǎng)期的藻進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 藻密度約為7×103cells/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PSP在蝦夷扇貝體內(nèi)的累積 實(shí)驗(yàn)使用體積為65 L (660×440×343 mm)的水箱, 各水箱放入45只蝦夷扇貝, 共設(shè)A、B、C三組, 每組設(shè)置3個(gè)平行。A組為空白組, 添加50 L海水; B組為對(duì)照組, 添加50 L稀釋后密度為2×103cells/mL的A.pacificum藻液;C組為實(shí)驗(yàn)組, 添加50 L稀釋后密度為2×103cells/mL的A.pacificum藻液后, 噴灑MC I母液使其終濃度為0.2 g/L。累積階段為4 d, 期間不換水, 不投餌。A組在0、2、4 d時(shí)取樣, B、C組在3 h、12 h、1 d、2 d、4 d時(shí)取樣, 進(jìn)行蝦夷扇貝體內(nèi)PSP含量、組分, 以及水體中藻密度的測(cè)定。其他培養(yǎng)條件同馴化條件。

1.2.2 PSP 在蝦夷扇貝體內(nèi)的排出 4 d 后, 將B、C 兩組中扇貝取出, 依次放入6 個(gè)盛有5 L 海水的燒杯中, 排出階段為6 d, 每日換水、投喂適量小新月菱形藻。B、C 組分別在6 d 時(shí)取樣, 進(jìn)行蝦夷扇貝體PSP 含量、組分的檢測(cè)。其他培養(yǎng)條件同馴化條件。

1.2.3 MCI 對(duì)蝦夷扇貝濾水率的影響 在20 L(440×298×243 mm)的水箱中各放入蝦夷扇貝35 只,一次性噴灑適量MC I 母液, 使各組MC I 濃度分別為0、0.05、0.26、0.52 g/L, 每組設(shè)置三個(gè)平行。噴灑后的第2 d 開始隔天換水一次, 不吸底, 換水量2/3,第2 d 換水后每日投喂適量小新月菱形藻。在9 d 時(shí)從各水箱隨機(jī)取 3 只蝦夷扇貝, 放置在密度為1×105cells/mL 的小新月菱形藻藻液中, 同時(shí)設(shè)置無生物的自然沉降組1 個(gè), 扣除由藻細(xì)胞自然沉降和生長(zhǎng)帶來的誤差, 2 h 后測(cè)定各組藻密度。濾水率的計(jì)算公式參見(Coughlan, 1969)。

1.3 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的測(cè)定

1.3.1 藻細(xì)胞密度的測(cè)定 將藻液混勻后取至離心管中, 加入魯哥氏液將其固定后, 用100 μL 浮游植物計(jì)數(shù)框在顯微鏡(NIKON ECLIPSE50i)下計(jì)數(shù)。

1.3.2 PSP 的提取 樣品前處理參考吳海燕等(2017), 從各組水箱中分別取出4 只蝦夷扇貝分離其消化腺組織和食用組織(除消化腺外的全部組織), 在底部平鋪吸水紙的50 目篩子上平鋪瀝水約10 min,分別置于組織勻漿機(jī)中勻漿。稱取5 g 食用組織勻漿于50 mL 離心管中, 加入5 mL 1%乙酸水溶液, 渦旋混合90 s, 將離心管密封置于沸水中煮沸5 min, 取出置于流水下冷卻至室溫, 4 500 r/min 離心10 min,量取提取液體積。稱取全部消化腺組織勻漿置于15 mL 離心管中, 加入與其重量相同體積的1%乙酸水溶液后重復(fù)上述提取步驟。

分別移取上述食用和消化腺組織提取液1 mL 于2 mL 離心管中, 加入5 μL 氨水, 渦旋混勻。依次用2 mL 乙腈、2 mL 20%乙腈水溶液(含1%乙酸)、2 mL 0.1%氨水溶液活化Supelco ENVI-Carb (250 mg/3 mL)固相萃取柱, 加入500 μL 提取液, 再用700 μL 超純水淋洗, 負(fù)壓擠干, 最后用 1 mL 75%乙腈水(含0.25%甲酸)洗脫混勻, 過0.22 μm 濾膜于進(jìn)樣小瓶中,-20 °C 下保存, 供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.3.3 PSP 的檢測(cè) PSP 通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定, 所用儀器為1290 Infinity II 型高效液相色譜儀和G6546 Q-TOF/MS(美國(guó)Agilent 公司)。

色譜條件: 采用 ZIC-HILIC 色譜柱(2.1 mm×150 mm, 3.5 μm)對(duì)PSP 毒素進(jìn)行分離。使用二元流動(dòng)相, 梯度洗脫。流動(dòng)相A: 水(含2 mmol/L 乙酸銨,0.03%甲酸), 流動(dòng)相B: 90%乙腈水溶液(含2 mmol/L乙酸銨, 0.03%甲酸); 梯度洗脫程序: 0～5 min,100%～30% B; 5～20 min, 30% B。停止時(shí)間: 20 min;平衡時(shí)間: 8 min; 流速: 0.2 mL/min; 進(jìn)樣體積為10 μL; 柱溫: (30±1) °C。

質(zhì)譜條件: 在全掃描負(fù)離子模式下對(duì)PSP 毒素進(jìn)行高分辨質(zhì)譜檢測(cè)。采用AJS-ESI 離子源; 干燥氣溫度: 300 °C; 干燥氣流速: 8 L/min; 霧化器壓力:20 psi; 鞘氣溫度: 320 °C; 鞘氣流速: 11 L/min; 毛細(xì)管電壓: 3 500 V; 掃描范圍 100～600m/z。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0 軟件, 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA), 比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間是否存在顯著差異(差異顯著性水平α=0.05), 運(yùn)用Origin 2019 和Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。PSP 不同組分毒性的歸一化處理: 將組分STX 的毒性設(shè)為1, 其他組分按照毒性因子(表1), 統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為STX 來表示, 計(jì)算方式參見(Turneret al, 2015)。

表1 麻痹性貝毒(PSP)毒性因子(Oshima, 1995)Tab.1 The toxicity factor of PSP (Oshima, 1995)

2 結(jié)果與分析

2.1 改性粘土對(duì)A. pacificum 的去除效果

為了明確改性粘土自身是否會(huì)對(duì)蝦夷扇貝的濾食行為產(chǎn)生影響, 首先考察了不同濃度MC I 處理下扇貝濾水率的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 添加MC I的實(shí)驗(yàn)組中扇貝濾水率與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05),說明該實(shí)驗(yàn)中所選用的MC I 用量下不會(huì)影響扇貝的濾食情況, 選擇0.2 g/L MC I 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于未添加MC I 的B 組, 在蝦夷扇貝的濾食作用下, 藻密度呈平緩下降的趨勢(shì), 3 h 時(shí)藻密度由2 000 cells/mL 降低至1 593 cells/mL, 在4 d 時(shí)藻密度降低至23 cells/mL。添加了0.2 g/L MC I 的C 組, 由于MC I 對(duì)藻細(xì)胞的快速絮凝沉降, 藻密度在3 h 內(nèi)由2 000 cells/mL 迅速降低至67 cells/mL, 在此后的各時(shí)間點(diǎn)均低于 100 cells/mL, 在 4 d 時(shí)降低至17 cells/mL(圖1)。在實(shí)驗(yàn)過程中, B 組藻密度均高于C 組。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組中A. pacificum 密度的變化Fig.1 Changes in algal density of A. pacificum in each experimental group

2.2 貝類組織中的毒素變化情況

2.2.1 PSP 毒素含量 首先需要確定實(shí)驗(yàn)所用蝦夷扇貝是否被PSP 毒素污染。分析結(jié)果顯示, 空白組蝦夷扇貝(A 組)的食用組織在0、2、4 d 三個(gè)取樣點(diǎn)均未檢測(cè)到 PSP, 但在其消化腺組織中檢測(cè)到少量PSP, 均為0.025 μmol/kg, 說明實(shí)驗(yàn)所用扇貝在原來的生長(zhǎng)環(huán)境中被產(chǎn)毒藻輕微污染, 但含量較低, 對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生干擾。

B 組和C 組扇貝食用和消化腺組織中PSP 含量的變化如圖2 所示。在前4 d 累積階段, B 組扇貝食用組織中PSP 含量不斷上升, 由實(shí)驗(yàn)前的未檢出到2 d 時(shí)升高至0.92 μmol/kg, 在4 d 時(shí)達(dá)到最高1.61 μmol/kg;C 組呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 在2 d 時(shí)就達(dá)到最高0.59 μmol/kg, 隨后呈下降趨勢(shì)。在累積階段B 組扇貝食用組織中PSP 含量始終高于C 組(圖2a)。同樣,B 組扇貝消化腺組織中 PSP 含量, 由實(shí)驗(yàn)前的0.025 μmol/kg逐漸升高, 在4 d時(shí)達(dá)到最高20.2 μmol/kg;C 組雖然也有所增加, 2 d 后達(dá)3.91 μmol/kg, 到4 d時(shí)又降至2.69 μmol/kg。總體而言, 添加了改性粘土的C 組扇貝消化腺組織中PSP 含量在不同的采樣時(shí)間點(diǎn)均低于B 組(圖2b)。

圖2 累積階段蝦夷扇貝不同組織中PSP 含量變化Fig.2 Changes in PSP concentration in different tissues of Mizuhopecten yessoensis in accumulation stage

經(jīng)過在海水和小新月菱形藻共培養(yǎng)體系中6 d 的排出階段后, 扇貝各組織中PSP 含量均明顯降低。其中, 在食用組織中, B 組和C 組PSP 含量分別由1.61和0.32 μmol/kg 降低至0.6 和0.09 μmol/kg。在消化腺組織中, B 組和C 組PSP 含量分別由20.2 和2.69 μmol/kg 降低至9.15 和1.61 μmol/kg (表2)。不論是食用組織還是消化腺組織, B 組PSP 含量均顯著高于C 組(P＜0.05)。

表2 排出階段蝦夷扇貝不同組織中PSP 含量(單位: μmol/kg)Tab.2 PSP concentration in different tissues of Mizuhopecten yessoensis in depuration stage (unit: μmol/kg)

2.2.2 PSP 毒素組分 如圖3 所示,A.pacificum藻細(xì)胞中PSP 組分主要包括C1、C2、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3。當(dāng)蝦夷扇貝濾食了A.pacificum藻細(xì)胞后, 其體內(nèi)PSP 組分與藻細(xì)胞相比存在明顯差異。濾食3 h 后, 原本在藻細(xì)胞中存在的GTX2、GTX3、GTX4、dcGTX2、dcGTX3在扇貝食用和消化腺組織中均未檢出。此外, 兩種扇貝組織中C1∶C2 比率與藻細(xì)胞相比有明顯降低, 在食用組織中, B、C 組C1∶C2 比率由藻細(xì)胞中的2.8分別降低至0.7 和0.5; 在消化腺組織中, 兩組比率均降低至0.6。另外, 在3 h 時(shí), 扇貝各組織中未檢出GTX4, 而對(duì)于GTX4 的差向異構(gòu)體GTX1, 在食用組織中, B、C 組扇貝GTX1 占比分別由藻細(xì)胞中的22%升高至41%和42%, 在消化腺組織中, GTX1 占比分別為26%和24%。在前4 d 的累積階段, B、C 組扇貝食用和消化腺組織中PSP 主要組分均為C1、C2、GTX1、GTX5, 組分占比在不同取樣時(shí)間點(diǎn)均較穩(wěn)定,且兩組間差異不大。

圖3 藻細(xì)胞內(nèi)及蝦夷扇貝不同組織中PSP 組成Fig.3 PSP composition in algae and different tissues of Mizuhopecten yessoensis

經(jīng)過6 d 的排出實(shí)驗(yàn)后, 扇貝食用和消化腺組織中PSP 主要組成仍為C1、C2、GTX1、GTX5, 但有些組分占比發(fā)生了明顯的變化。其中, 在食用組織中,C 組GTX1 占比明顯升高, 由35%升高至48%; 在消化腺組織中, B、C 組C1 占比均有不同程度的提升, B組中C1 占比由18%提高到34%, C 組中C1 占比由22%提升到62%。

2.2.3 PSP 毒素水平 PSP 由多種組分組成, 不同組分的毒性有很大差異(表1)。在貝類體內(nèi)可能存在含量高的組分毒性低, 含量低的組分毒性高的情況。為更清楚地了解改性粘土絮凝藻細(xì)胞過程中對(duì)扇貝不同組織中PSP 總毒性的影響, 本研究將PSP 不同組分的毒性進(jìn)行歸一化處理, 統(tǒng)一用STXeq 來表示。蝦夷扇貝食用和消化腺組織中PSP 毒素水平的變化如圖4、表3 所示。

表3 排出階段蝦夷扇貝不同組織中PSP 毒素水平(單位:μg STXeq/kg)Tab.3 PSP toxicity level in different tissues of Mizuhopecten yessoensis in depuration stage(unit: μg STXeq/kg)

在前4 d 累積階段, B 組食用組織的PSP 毒素水平不斷上升, 由實(shí)驗(yàn)前的未檢出提升至 4 d 時(shí)的258.67 μg STXeq/kg; 利用改性粘土絮凝去除A.pacificum的C 組中, 食用組織的PSP 毒素水平先上升, 在2 d 時(shí)達(dá)到最高值98.92 μg STXeq/kg, 隨后呈下降趨勢(shì)。在累積階段B 組扇貝食用組織中PSP 毒素水平始終高于C 組(圖4a)。同樣, B 組扇貝消化腺組織中的 PSP 毒素水平, 由實(shí)驗(yàn)前的 0.68 μg STXeq/kg逐漸升高至4 d 時(shí)的3 208.4 μg STXeq/kg; C組則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 2 d 后升高至574.54 μg STXeq/kg, 到4 d 時(shí)又降至384.99 μg STXeq/kg。總體而言, C 組扇貝消化腺組織中PSP 毒素水平在不同時(shí)間點(diǎn)均低于B 組(圖4b)。

圖4 累積階段蝦夷扇貝不同組織中PSP 毒素水平變化Fig.4 Changes in PSP toxicity level in different tissues of Mizuhopecten yessoensis in accumulation stage

經(jīng)過在海水和小新月菱形藻共培養(yǎng)體系中6 d 的排出階段后, 扇貝各組織中PSP 毒素水平均明顯降低。在食用組織中, B、C 組扇貝PSP 毒素水平分別由258.67、50.86 μg STXeq/kg 降低至70.17、18.22 μg STXeq/kg; 在消化腺組織中, B、C 組扇貝PSP 毒素水平分別由 3 208.4 和 384.99 μg STXeq/kg 降低至1 055.58 和95.85 μg STXeq/kg (表3)。B 組食用和消化腺組織PSP 毒素水平均顯著高于C 組(P＜0.05)。

3 討論

改性粘土技術(shù)通過對(duì)天然粘土礦物進(jìn)行改性處理, 使粘土表面電性由負(fù)電轉(zhuǎn)變?yōu)檎? 實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種赤潮生物去除效率的極大提升(曹西華等, 2006; 張雅琪等, 2013; 邱麗霞等, 2017; 俞志明等, 2019), 目前, 已成為我國(guó)近海赤潮治理的首選方法。現(xiàn)場(chǎng)及室內(nèi)研究均表明, 改性粘土在有效防控赤潮的用量下,對(duì)多種魚(Zhanget al, 2019; 張培培等, 2019)、蝦(孫曉霞等, 2000; 宋秀賢等, 2003)、貝(高詠卉等, 2007;王志富等, 2014; 王梓瞳等, 2019)等養(yǎng)殖生物無不良影響。本研究中0.2 g/L MC I 對(duì)A.pacificum藻細(xì)胞的去除率在3 h 時(shí)即達(dá)到了97%, 在隨后的幾天中藻密度始終維持在低水平, 沒有出現(xiàn)再次增殖。此外,低于0.52 g/L 的MC I 對(duì)蝦夷扇貝的濾水率也沒有造成顯著負(fù)面影響(P＞0.05), 這與以往改性粘土對(duì)濾食性貝類影響的研究結(jié)果一致。再一次體現(xiàn)了改性粘土在高效去除赤潮生物的同時(shí), 對(duì)典型養(yǎng)殖生物無不良影響。

本研究中所使用的MC I 對(duì)蝦夷扇貝的濾食行為沒有影響, PSP 在扇貝體內(nèi)的累積主要受到水體中藻細(xì)胞密度及藻細(xì)胞毒力的影響。宋維佳等(2021)研究發(fā)現(xiàn), MC I 主要是通過去除水體中的有毒藻細(xì)胞來降低水體中的總PSP 含量, 改性粘土是一種綠色環(huán)保的除藻材料, 適當(dāng)用量可以有效降低水體中藻細(xì)胞密度, 但不會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞大量破裂釋放或分泌毒素。因此, 本研究中前4 d 蝦夷扇貝體內(nèi)PSP 含量的變化主要受到水體中A.pacificum藻密度的影響, B、C 兩組扇貝組織中PSP 的變化與藻密度的變化具有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。例如, B 組扇貝食用和消化腺組織中PSP毒素水平與藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)出較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖5), 反映出扇貝各組織中PSP 毒素水平的變化主要源自藻細(xì)胞密度的變化。在實(shí)驗(yàn)的前4 d, 生長(zhǎng)在A.pacificum中的B 組扇貝不斷濾食藻細(xì)胞, 水中藻密度不斷降低, 導(dǎo)致扇貝食用和消化腺組織中PSP 毒素水平在累積階段不斷上升, 在第4 d 毒素水平達(dá)到最高。而在添加0.2 g/L MC I 的C 組中, 在3 h 時(shí)MC I即絮凝沉降了體系中97%的藻細(xì)胞, 此后藻密度始終維持在一個(gè)較低的水平, 這大大降低了扇貝攝入有毒藻的幾率, C 組扇貝食用和消化腺組織毒素水平在第2 d 達(dá)到高峰, 隨后呈下降趨勢(shì)。累積及排出階段中, B 組扇貝PSP 毒素水平均高于C 組。Li 等(2019)的研究表明, 在16 d 的A.pacificum與海灣扇貝共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中, 未添加MC I 的對(duì)照組中, 在3 h 內(nèi)扇貝即積累了初始藻液中 73.2%的 PSP, 而添加 0.1 和0.5 g/L MC I 后, 扇貝的毒素水平始終保持在一個(gè)較低的水平。前人和本研究結(jié)果均表明, MC I 能有效絮凝沉降水體中的A.pacificum, 從而能夠減少貝類對(duì)有毒藻的濾食, 大大地降低了PSP 在貝類體內(nèi)的積累,該研究結(jié)果為改性粘土技術(shù)在近海貝類養(yǎng)殖水體中的實(shí)際應(yīng)用提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

圖5 對(duì)照組(B 組)蝦夷扇貝不同組織中PSP 毒素水平與藻密度的關(guān)系Fig.5 Relationship between toxicity level of PSP in different tissues of Mizuhopecten yessoensis and algal density of A. pacificum in the control group

我國(guó)規(guī)定上市貝類中 PSP 的安全限量標(biāo)準(zhǔn)為800 μg STXeq/kg, 從安全限量標(biāo)準(zhǔn)來看, 在各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn), B 組扇貝的食用組織以及C 組扇貝的兩種組織毒素水平均低于安全限量標(biāo)準(zhǔn), 而生長(zhǎng)在較高密度A. pacificum的蝦夷扇貝(B 組), 其消化腺組織的毒素水平在2 d 后高于安全限量標(biāo)準(zhǔn)。另外, B、C組扇貝消化腺組織中毒素水平為食用組織的數(shù)倍甚至十多倍。消化腺是扇貝主要的毒素累積器官, 建議在食用時(shí)剔除消化腺以保證安全。已有學(xué)者研究過PSP 在貽貝、扇貝等體內(nèi)的累積和排出情況(Kwonget al, 2006; Liet al, 2017), 發(fā)現(xiàn)消化腺是PSP 主要的累積器官, 這與本文的研究結(jié)果一致。

多項(xiàng)研究表明, 亞歷山大藻和以其為食的貝類體內(nèi)PSP 的組分有所差異。如Kwong 等(2006)的研究發(fā)現(xiàn), 芬迪亞歷山大藻(Alexandriumfundyense)中PSP 組成中氨基甲酸酯類毒素(GTX1-4、STX、neoSTX)占比僅為 33.4%, 但濾食它的翡翠貽貝(Perna viridis)體內(nèi)此類毒素占比為53.0%。雙殼貝類中PSP 的轉(zhuǎn)化極為復(fù)雜多變, 可發(fā)生不同毒素種類間的轉(zhuǎn)化和差向異構(gòu)體間的轉(zhuǎn)化, 如PSP11 位C 原子上的R2、R3 基團(tuán)的空間異構(gòu)化, β 異構(gòu)體可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的α異構(gòu)體, 如 GTX3→GTX2, C2→C1, GTX4→GTX1 等(包振民等, 2021)。Asakawa 等(2005)的研究發(fā)現(xiàn), 濾食塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense) 2 d后, 相比藻細(xì)胞PSP 組成, 菲律賓蛤仔體內(nèi)GTX1∶GTX4 比率提高。在本文的研究中, 當(dāng)蝦夷扇貝濾食了A. pacificum藻細(xì)胞3 h 后, 與初始藻細(xì)胞中的PSP組成相比, 扇貝食用和消化腺組織中均未檢出藻細(xì)胞中所含有的GTX2、GTX3、GTX4、dcGTX2、dcGTX3(圖3)。其中, GTX2、GTX3、GTX4 可能在扇貝體內(nèi)轉(zhuǎn)化為其他組分, 也有可能在短時(shí)間內(nèi)被扇貝本身排出。dcGTX2、dcGTX3 本身在藻類中占比較低, 文獻(xiàn)中還未記載過這兩類毒素向其他PSP 組分的轉(zhuǎn)化路徑, 因此在3 h 內(nèi)有可能被扇貝本身排出體外。扇貝各組織中C1∶C2 比率降低, 這與貝類中常見的C2→C1 的轉(zhuǎn)化有所不同, 可能發(fā)生了和其他組分間復(fù)雜的轉(zhuǎn)化。3 h 后未在扇貝各組織中檢出GTX4, 但GTX1 占比相比藻細(xì)胞均有所提高, 有理由推斷GTX4 可能向GTX1 發(fā)生了快速轉(zhuǎn)化。在4 d 的PSP累積階段中, 不論是食用組織還是消化腺組織, B 組和C 組的PSP 組成差異不大, 說明改性粘土的添加不會(huì)影響扇貝對(duì)PSP 的生物轉(zhuǎn)化過程。經(jīng)過6 d 的排出階段后, C 組扇貝食用組織中GTX1、B 組和C 組扇貝消化腺組織中的C1 占比均有不同程度的提升, 說明GTX1、C1 的排出速率可能比其他毒素低或其他組分向其發(fā)生了轉(zhuǎn)化。

4 結(jié)論

(1) 0.2 g/L MC I 能有效絮凝去除水體中大部分的A.pacificum藻細(xì)胞, 并對(duì)蝦夷扇貝的濾食行為沒有影響。

(2) 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中, 無論是累積階段還是排出階段, MC I 處理后蝦夷扇貝食用組織和消化腺組織中PSP 毒素水平均低于未添加改性粘土的對(duì)照組。一定用量MC I 的添加可通過降低水體中A.pacificum藻細(xì)胞密度, 減少蝦夷扇貝對(duì)水體中有毒藻的攝入量, 從而降低扇貝食用組織和消化腺組織內(nèi)PSP 毒素的積累。

(3) 累積階段中, MC I 處理組蝦夷扇貝食用組織和消化腺組織中PSP 各組分相對(duì)含量與未添加改性粘土的對(duì)照組無明顯差異, 即本實(shí)驗(yàn)用量MC I 的添加未對(duì)蝦夷扇貝體內(nèi)的PSP 轉(zhuǎn)化造成明顯影響。