周紅，張海博，閆瑞娟，魏海梁，閆曙光，李京濤，常占杰

0 引言

環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）是一類共價封閉的內(nèi)源性非編碼RNA，無5′端帽子和3′端多聚A尾，具有組織特異性，廣泛存在于人類細(xì)胞中[1]。circRNA在腫瘤等多種疾病相關(guān)組織及細(xì)胞中存在表達(dá)差異，提示circRNA對腫瘤相關(guān)疾病具有調(diào)節(jié)作用[2]。世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示，原發(fā)性肝癌發(fā)病率居惡性腫瘤第6位，死亡率居第3位。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，約占肝癌總數(shù)的85%～90%[3-6]。目前，HCC的早期臨床篩查方法主要是甲胎蛋白（AFP）測定和肝臟超聲檢查，但AFP檢測的敏感度和特異性有限，而超聲檢查很大程度上依賴操作者的主觀判斷，且常規(guī)超聲難以準(zhǔn)確鑒別肝臟占位性病變性質(zhì)[7]。BCLC分期系統(tǒng)顯示，僅有少數(shù)患者在肝癌早期階段，可接受如局部消融、切除或肝移植等治療，預(yù)后較好；大多數(shù)患者就診時多屬于晚期，尚無有效治療方案選擇[8]。因此，亟需深入探究HCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新型生物標(biāo)志物以提高HCC的早期檢出率，這對HCC患者的早期診治、改善預(yù)后、提高生存率及生存質(zhì)量具有重要意義。近年來隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)許多與HCC相關(guān)的circRNA，該技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床診斷和基礎(chǔ)研究中，進(jìn)一步提示circRNA將成為HCC新型診斷標(biāo)志物和藥物開發(fā)靶點(diǎn)[9]。本文就近年來circRNA的生物學(xué)機(jī)制及在HCC中發(fā)揮的作用、診治研究進(jìn)展等進(jìn)行綜述。

1 circRNA的概述

1.1 circRNA的分類和特性

circRNAs是生物體內(nèi)存在的一類不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾、能通過共價鍵形成閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)的RNA分子。它廣泛存在于多種生物體中，在細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)超過10萬個circRNA。它具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、種類豐富、進(jìn)化保守等特性，表達(dá)水平具有組織、時序特異性等。circRNA的來源主要有三種形式：（1）套索驅(qū)動環(huán)化，由外顯子的3'剪接供體與5'剪接受體共價形成套索，套索進(jìn)行內(nèi)部拼接后剪除內(nèi)含子形成circRNA（exonic circRNA,ecircRNA）。ecircRNA可充當(dāng)競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）結(jié)合天然微小RNA（miRNA）并阻斷其對靶基因表達(dá)的抑制作用，作為miRNA的分子海綿發(fā)揮功能；（2）內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化，為兩個內(nèi)含子的堿基互補(bǔ)配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然后剪除內(nèi)含子變成circRNA（circularintronic RNA,ciRNA）；（3）同時包含外顯子和內(nèi)含子的circRNA（eIciRNA）[10]。

1.2 circRNA對腫瘤的生物調(diào)控機(jī)制

1.2.1 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄 circRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮作用。外顯子源性的ecircRNA大多在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，ciRNA及eIciRNA大多在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，主要有兩種途徑：（1）ciRNA在細(xì)胞核內(nèi)與RNA聚合酶Ⅱ（Pol-Ⅱ）結(jié)合促進(jìn)其親本基因表達(dá)；（2）eIciRNA在細(xì)胞核內(nèi)與U1小核糖核蛋白（U1 snRNP）結(jié)合形成復(fù)合物，與Pol-Ⅱ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合于親本基因啟動子上，促其親本基因轉(zhuǎn)錄[11]。如circRNA基因敲除導(dǎo)致其親本基因表達(dá)降低，位于轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近的ci-ankyrd 52（ciRNA）是一種豐富的RNA，其重復(fù)結(jié)構(gòu)域可以影響RNApol-Ⅱ復(fù)合物的延伸，是Pol-Ⅱ復(fù)合物的正調(diào)控因子，對其親本基因編碼具有順式調(diào)控作用[12]。

1.2.2 circRNA作為miRNA分子海綿 circRNA作為miRNA海綿，參與腫瘤細(xì)胞的多種活動，包括腫瘤增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和化療耐藥性等。circRNA與下游靶基因mRNA競爭性結(jié)合miRNA，進(jìn)而影響mRNA的基因表達(dá)，這也是circRNA目前研究最多的生物學(xué)機(jī)制[13]，即為“circRNA/miRNA/mRNA”軸的調(diào)節(jié)，miRNAs通過與靶mRNA的3'-UTR結(jié)合發(fā)揮調(diào)控靶mRNA表達(dá)的作用，circRNA則通過海綿吸附miRNA，競爭性阻止或減少了miRNA與靶mRNA結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)了靶mRNA基因表達(dá)，促使細(xì)胞增殖、凋亡和惡變等，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[14]。

1.2.3 蛋白質(zhì)翻譯 通常circRNA是不能被翻譯的，但隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)一些circRNA的外顯子序列可被翻譯成蛋白質(zhì)。大部分包含有外顯子circRNA與核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site,IRES）結(jié)合后能在體內(nèi)外進(jìn)行翻譯[15]。目前已有一些circRNA被證實(shí)是由IRES介導(dǎo)翻譯，如circ-FBXW7、circ-MBl、circ-ZNF609等。除了經(jīng)典翻譯模式和上述IRES介導(dǎo)的翻譯模式之外，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）殘基富集于circRNA上，作為IRES翻譯circRNA[16]。METTL3是一種主要的RNA N6腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶，在人肝細(xì)胞癌和多發(fā)性實(shí)體瘤中顯著上調(diào)，METTL3通過m6A-YTHDF2依賴機(jī)制抑制肝癌中SOCS2的表達(dá)進(jìn)而加速HCC的進(jìn)展[17]。還有一些circRNA能與蛋白質(zhì)相互作用抑制翻譯進(jìn)程，WTAP通過m6A-HuR途徑抑制ETS1的表達(dá)，從而促進(jìn)HCC的進(jìn)展[18]。circRNA參與蛋白質(zhì)翻譯在肝癌進(jìn)展中轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用機(jī)制仍未探明。circRNA參與蛋白質(zhì)翻譯及其在腫瘤和相關(guān)組織中的調(diào)控作用可能為circRNA進(jìn)一步研究提供思路。

1.2.4 circRNA與結(jié)合蛋白相互作用 結(jié)合蛋白（RNA binding protein,RBP）是能夠影響circRNA加工、折疊和定位的一類廣泛的蛋白質(zhì)[19]。有研究表明，circRNA可以作為RBP的海綿與RNA QKI、MBL、PolⅡ、Argonaute（AGO）、真核起始因子4A-Ⅲ（EIF4A3）等形成大的RNA-蛋白復(fù)合物（RPC），這些RPC可以調(diào)節(jié)RBP或miRNA的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)親本基因或相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[20]。circRNA可以與RBP結(jié)合促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，circ-Ago2和HuR相互作用并被激活，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移，同時促進(jìn)HuR在靶mRNA3’UTR上的富集，從而阻止Ago2與靶基因的結(jié)合，使Ago2/miRNA介導(dǎo)的基因受到抑制，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和侵襲[21]。此外，RBP還可以通過抑制circRNA的表達(dá)來促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，RBP-RBM3的高表達(dá)會抑制SCD-circRNA2的表達(dá)，從而促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖[22]，見圖1。

2 CircRNA在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用

2.1 circRNA是HCC的致癌因子

circ-0061395在肝癌組織、血清、細(xì)胞和血清衍生外泌體中表達(dá)上調(diào)，在體外誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡，抑制增殖、侵襲和遷移。circ-0061395競爭性結(jié)合miR-877-5p，調(diào)節(jié)PIK3R3的表達(dá)促進(jìn)HCC的生長[23]。外泌體circ-ZNF652通過miR-29a-3p/GUCD1轉(zhuǎn)移到HCC細(xì)胞中，參與HCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和糖酵解[24]。外泌體circ-100338增強(qiáng)HCC細(xì)胞的侵襲性和血管生成，促進(jìn)HCC的轉(zhuǎn)移[25]。circ-MAST1在HCC組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，circ-MAST1吸附miR-1299穩(wěn)定CTNND1的表達(dá)，促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長[26]。circ-0021093作為ceRNA充當(dāng)miR-432的海綿，促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲來促進(jìn)HCC的進(jìn)展[27]。hsa-circ-0000711在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并通過靶向has-miR-103a-3p促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡[28]。circ-0004277在HCC細(xì)胞、組織和血漿外泌體中的表達(dá)明顯上調(diào)，其過表達(dá)增強(qiáng)了HCC細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），加速HCC的進(jìn)展。HCC細(xì)胞中的外泌體circ-0004277通過細(xì)胞交流刺激周邊細(xì)胞的EMT，進(jìn)一步促進(jìn)HCC細(xì)胞對周圍正常組織的侵襲，加速HCC的發(fā)展[29]。由此可見，有相當(dāng)一部分circRNA作為HCC的促癌因子促進(jìn)HCC的進(jìn)展。

2.2 circRNA在HCC中作為抑癌因子

circ-MTO1在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，circ-MTO1作為miR-9-5p的分子海綿，NOX4是miR-9-5p的靶基因。過表達(dá)的circ-MTO1和NOX4抑制HCC細(xì)胞的增殖和遷移并誘導(dǎo)其凋亡[30]。circ-0051443通過外泌體從正常細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到HCC細(xì)胞，與miR-331-3p競爭性結(jié)合，誘導(dǎo)BAK1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期抑制惡性生物學(xué)行為，抑制HCC的進(jìn)展[31]。hsa-circ-0074854在HCC細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，通過與HuR相互作用與抑制外顯體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2極化，抑制HCC細(xì)胞的遷移和侵襲[32]。circ-0001445在HCC表達(dá)下調(diào)，circ-0001445的過表達(dá)并海綿化miR-942-5p提高ALX4表達(dá)，抑制HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移、EMT和糖酵解，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，circ-0001445可能成為抑制HCC發(fā)生發(fā)展的潛在靶點(diǎn)[33]。已有大量circRNA被鑒定為HCC的抑癌因子，在肝癌細(xì)胞組織中表達(dá)下調(diào)，未來有可能作為治療靶點(diǎn)，在HCC早期進(jìn)行干預(yù)，控制HCC進(jìn)展。

2.3 circRNA與HCC相關(guān)腫瘤信號通路

circRNA通過吸附microRNA（miR）和破壞細(xì)胞信號通路參與HCC的發(fā)生發(fā)展。circRNA常與經(jīng)典腫瘤信號通路相關(guān)靶蛋白關(guān)聯(lián)密切。在一項(xiàng)針對肝癌樣本的研究中，circ-PTGR1過表達(dá)激活Met信號通路，并海綿化miR-449a，參與細(xì)胞分化、抑制HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[34]。circZNF609抑制miR-15a-5p/15b-5p的表達(dá)、提高GLI2的表達(dá)，激活Hedgehog通路參與HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)HCC的進(jìn)展[35]。circRNA-ITCH參與調(diào)節(jié)Wnt/RNA-ITCH促信號通路，抑制C-myc和cyclind1的表達(dá)，circRNA-ITCH通過抑制Wnt/NAITCH促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮致癌作用參與HCC進(jìn)展[36]。circ-0014717抑制BTG2的表達(dá)，并通過海綿化miR-668-3p抑制HCC細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。發(fā)現(xiàn)一個新的circ-0014717/miR-668-3p/BTG2相關(guān)HCC的信號調(diào)控通路[37]。has-circ-0007456在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著影響其對NK細(xì)胞的敏感度，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hsa-circ-0007456通過吸附miR-6852-3p和ICAM-1的表達(dá)來發(fā)揮作用機(jī)制。miR-6852-3p/ICAM-1軸是has-circ-0007456介導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷HCC細(xì)胞所必需的。has-circ-0007456/miR-6852-3p/ICAM-1軸是腫瘤免疫逃逸和肝癌發(fā)生過程中的重要信號通路[38]。

除上述與HCC相關(guān)腫瘤信號通路外，還有許多具有不同效應(yīng)的circRNA與HCC相關(guān)的經(jīng)典信號通路有關(guān)，circRNA作為其中重要靶基因，參與HCC的發(fā)生發(fā)展，這些信號通路的激活或抑制下游致癌或抑癌靶基因、介導(dǎo)下游靶蛋白的表達(dá)發(fā)生變化，進(jìn)而產(chǎn)生抑癌或促癌作用。HCC相關(guān)circRNA腫瘤信號通路機(jī)制復(fù)雜多樣，circRNA在HCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及臨床診治具有重大意義。

2.4 circRNA參與HCC腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）被認(rèn)為是腫瘤增殖、免疫逃逸、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的關(guān)鍵因素[39]。首先，circRNA可參與PD-L1調(diào)節(jié)腫瘤免疫逃逸，circRNA作為ceRNA調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視[40]。在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)的hsa-circ-0003288，通過PI3K/AKT信號通路作為miR-145的海綿，上調(diào)PD-L1的表達(dá)，引起腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)EMT和HCC細(xì)胞侵襲，發(fā)揮致癌作用，靶向has-circ-0003288可能是肝癌的一個有價值的治療靶點(diǎn)[41]；第二，缺氧是TME的典型特征，低氧的微環(huán)境可加強(qiáng)癌細(xì)胞對放化療的抵抗性，對腫瘤侵襲和治療有重要影響[42]。cZNF292在肝癌細(xì)胞中以時間依賴的方式誘導(dǎo)，而不依賴于缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α。cZNF292基因敲除增加了SRY-box 9（SOX9）核轉(zhuǎn)位，降低了Wnt/β-catenin通路的活性，從而抑制了缺氧性肝癌細(xì)胞的增殖、VM和體外抗輻射性[43]；第三，HCC是一種典型的富血管性腫瘤，內(nèi)皮細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，參與血管生成，影響HCC的發(fā)生發(fā)展[29]。circ-4911和circ-4302抑制HCC微環(huán)境中人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的增殖和遷移，進(jìn)而抑制HCC的進(jìn)展[44]。

此外，circRNA還可參與重塑細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）、調(diào)控血管生成等過程參與TME，在調(diào)節(jié)肝纖維化、肝癌發(fā)生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，并通過與腫瘤細(xì)胞的串?dāng)_在腫瘤相關(guān)疾病中發(fā)揮作用[31]。circRNA在TME中發(fā)揮多種作用，但具體機(jī)制研究仍處于起步階段，在未來很可能作為一個熱點(diǎn)機(jī)制探索。

3 circRNA在HCC中的潛在臨床價值

circRNA在細(xì)胞質(zhì)中具有進(jìn)化保守、表達(dá)豐富、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特性，在腫瘤診斷、治療、判斷預(yù)后等方面具有較大臨床應(yīng)用價值，可作為HCC的新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[45]。血漿circRNA面板（circPanel），其中包含三個檢測HCC的circRNA（hsa-circ-0000976、hsa-circ-0007750和hsacirc-0139897）聯(lián)合應(yīng)用。circPanel對HCC和小肝癌的診斷準(zhǔn)確率優(yōu)于AFP，能有效鑒別AFP陽性和AFP陰性的小肝癌。因此，研究者認(rèn)為circPanel可作為肝癌臨床診斷的一個新型生物標(biāo)志物[46]。circRNA可以細(xì)胞特異性的方式廣泛分布于血漿、尿液、組織樣本、細(xì)胞唾液等人體成分中，檢測標(biāo)本較易獲取，外周血和其他體液中等無創(chuàng)性標(biāo)本檢測的生物標(biāo)志物具有較好的臨床應(yīng)用價值，將成為癌癥篩查新型指標(biāo)[47]。circRNA還可以預(yù)測HCC患者的生存。hsa-circ-0036683被發(fā)現(xiàn)是HCC的一個獨(dú)立且重要的預(yù)后因子，并強(qiáng)調(diào)它作為預(yù)測患者生存的候選生物標(biāo)志物具有潛在的臨床實(shí)用價值[48]。HCC患者中circARPP21的表達(dá)降低與腫瘤體積增大、tug淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期和甲胎蛋白（AFP）水平升高有關(guān)。研究驗(yàn)證circARPP21作為miR-543的海綿，通過調(diào)節(jié)LIFR抑制HCC細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和遷移，延緩HCC的進(jìn)展[49]。circRNA與HCC的進(jìn)展和放化療耐藥有關(guān)。例如circ-0031242與肝癌對DDP的耐藥性有關(guān)。circ-0031242的沉默降低了DDP耐藥細(xì)胞（Huh7-R和SNU-387-R）的細(xì)胞活力、遷移、侵襲和凋亡，增強(qiáng)了DDP的體內(nèi)敏感性。調(diào)控HCC的進(jìn)展和DDP耐藥影響[50]。

circRNAs調(diào)控腫瘤微環(huán)境、腫瘤免疫、化學(xué)耐藥等的機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。因此，亟需探尋更多的靶向HCC的circRNA參與臨床HCC的治療和判斷預(yù)后。隨著相關(guān)cirRNA與HCC機(jī)制和功能被探明，期待在眾多circRNA中探索出靶向HCC的circRNA作為新型生物標(biāo)志物參與臨床診斷、治療、判斷預(yù)后，見表1。

表1 HCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的circRNATable 1 CircRNA related to occurrence and development of HCC

4 總結(jié)與展望

circRNA作為HCC新型標(biāo)志物，在HCC的早期診斷、治療、預(yù)后判斷中具有潛在臨床價值。circRNA的異常表達(dá)通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、作為miRNA海綿、參與蛋白質(zhì)翻譯、與RBP相互作用等發(fā)揮生物學(xué)機(jī)制，參與調(diào)控HCC細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。當(dāng)前的研究主要集中在其表達(dá)改變和作為miRNA海綿的吸附作用機(jī)制上，對于circRNA蛋白質(zhì)翻譯和調(diào)控基因表達(dá)的具體分子機(jī)制尚不明確。大部分circRNAs與其親本基因、RNA結(jié)合蛋白等的作用機(jī)制關(guān)系亦不清楚。隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入，諸多與腫瘤相關(guān)的circRNA被發(fā)現(xiàn)，目前研究中廣泛存在的問題是circRNA的命名還不夠規(guī)范，亟需建立circRNA的通用標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。circRNA在組織和體液中具有較高的特異性和穩(wěn)定性，標(biāo)本也較易獲得，由于circRNA與腫瘤類型還不能一一對應(yīng)為特異性指標(biāo)，故而組合circPanel（多個對HCC有特異性的circRNA組合）有望成為HCC新型早期診斷、預(yù)后評價和潛在治療靶點(diǎn)。