崔紅磊，張笑丹，郭丹風(fēng)，閆志平，郭文治，張水軍

0 引言

原發(fā)性肝癌是目前我國(guó)第四位常見(jiàn)的惡性腫瘤及第二位腫瘤致死病因，肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）約占原發(fā)性肝癌總數(shù)的90%[1]。由于起病隱匿且生長(zhǎng)迅速，大部分肝癌患者確診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)[2]。對(duì)于這部分患者，藥物治療是其為數(shù)不多的選擇之一。相比各類分子靶向藥物和免疫治療藥物，含奧沙利鉑（Oxaliplatin,OXA）的系統(tǒng)化療方案更經(jīng)濟(jì)，且被證實(shí)同樣有效而被多數(shù)晚期HCC患者接受[3-5]。奧沙利鉑可通過(guò)與DNA相互作用，阻斷DNA復(fù)制，引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞死亡；也可通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)生成氧自由基，導(dǎo)致DNA氧化損傷[6]。肝癌細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性，是晚期HCC化療面臨的主要問(wèn)題。靶向分子治療聯(lián)合化療是治療腫瘤的新思路[7]，尋找可與奧沙利鉑協(xié)同作用的分子，提高HCC對(duì)奧沙利鉑的敏感度有重要臨床意義。

烯醇化酶（enolase,ENO），在糖酵解代謝途徑中發(fā)揮催化作用，肌肉特異性烯醇化酶（ENO3）是ENO三種同工酶之一，與糖原代謝、脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[8-9]。ENO3在HCC與激活的肝星狀細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[10-11]，預(yù)示著其可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。ENO3是否影響肝癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑敏感度的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)過(guò)表達(dá)ENO3基因，檢測(cè)奧沙利鉑處理后的細(xì)胞活力和凋亡率，明確ENO3在肝癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑敏感度中的作用，探討其可能的機(jī)制，以期為提高HCC對(duì)奧沙利鉑的敏感度提供新的分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料

收集2019—2020年鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院48例患者（其中男29例、女19例；年齡44歲～58歲，平均年齡52.5歲，中位年齡50歲）術(shù)后新鮮肝細(xì)胞肝癌組織和正常肝組織標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受任何放化療等抗腫瘤治療，患者臨床病理信息和隨訪記錄均完整。本試驗(yàn)經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，由患者本人或家屬簽署知情同意書(shū)。MHCC97H與HepG2細(xì)胞株來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室留存；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司；2x SYBR Green qPCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bimake生物科技有限公司；奧沙利鉑購(gòu)自美國(guó)Selleck生物科技有限公司；ENO3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-ENO3及空載質(zhì)粒pcDNA-con購(gòu)自江蘇PPL質(zhì)粒與蛋白共享庫(kù)；LipoMax轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自南京南晶生物技術(shù)有限公司；Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司；兔抗Bcl-2、Bax及Caspase-3多克隆抗體購(gòu)自上海泊灣生物科技有限公司；兔抗ENO3多克隆抗體、鼠抗GAPDH單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測(cè)ENO3mRNA在肝癌中表達(dá)根據(jù)TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取肝癌及正常肝組織中的總RNA，測(cè)定RNA濃度及純度，參照反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。ENO3的上游引物序列：5’-TCTGGGGAGACTGAGGACAC-3’，下游引物序列：5’-GCCTTCGGGTTACGGAACTT-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TGATTCCACCCATGGCAAATTC C-3’，下游引物序列：5’-CATGGTGGTGAAGACGC CAG-3’。反應(yīng)條件：95℃ 10 min預(yù)變性，然后95℃15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果按照2-ΔΔCt法計(jì)算ENO3的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ENO3蛋白在肝癌中的表達(dá) 蠟塊包埋的肝癌組織與正常肝組織經(jīng)切片、制片后，依次用二甲苯脫蠟、濃度梯度乙醇脫水，然后用高壓鍋煮沸枸櫞酸鹽溶液進(jìn)行抗原修復(fù)10 min。室溫自然冷卻后用3%過(guò)氧化氫室溫孵育20 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，加入ENO3抗體（稀釋比為1:300），4℃過(guò)夜。次日常溫孵育二抗1 h，PBS洗滌后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精對(duì)比染色，脫水透明后中性樹(shù)膠封片。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4級(jí)：無(wú)陽(yáng)性著色（陰性）計(jì)0分，淡黃色（弱陽(yáng)性）計(jì)1分，棕黃色（陽(yáng)性）計(jì)2分，棕褐色（強(qiáng)陽(yáng)性）計(jì)3分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比分為4級(jí)：≤25%計(jì)1分，＞25%～50%計(jì)2分，＞50%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘得出最終評(píng)分結(jié)果。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將MHCC97H細(xì)胞接種于DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 u/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素），置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，加2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空載組（Vector組）和ENO3過(guò)表達(dá)組（ENO3組）。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97H與HepG2細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度達(dá)到約70%時(shí)，換液，按說(shuō)明書(shū)將空載質(zhì)粒和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入空載組和ENO3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，胰酶消化收集各組細(xì)胞，提取mRNA及蛋白質(zhì)，Western blot和qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4 ENO3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)肝癌細(xì)胞奧沙利鉑藥物毒性的影響 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，將細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后換液，Vector組和ENO3組細(xì)胞分別加入含奧沙利鉑濃度為0、5、10、20、40、60、80 μmol/L的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔分別加入10 μl CCK-8試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。相對(duì)抑制率（%）=[1－（實(shí)驗(yàn)孔OD值－空白孔OD值）/（對(duì)照孔OD值－空白孔OD值）]×100%。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，將細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后換液，Vector+OXA組和ENO3+OXA組加入奧沙利鉑濃度為20 μmol/L的培養(yǎng)基，其余兩組加入不含奧沙利鉑的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔分別加入10 μl CCK-8試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞吸光度值。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×103個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后換液，Vector+OXA組和ENO3+OXA組加入奧沙利鉑濃度為20 μmol/L的培養(yǎng)基，其余兩組加入不含奧沙利鉑的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)14天后，移除培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌干凈后室溫晾干，顯微鏡下計(jì)數(shù)形成的克隆球數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后將細(xì)胞接種于24孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后換液，Vector+OXA組和ENO3+OXA組加入含20 μmol/L奧沙利鉑的培養(yǎng)基，其余兩組加入不含奧沙利鉑的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用不含EDTA的胰酶消化、收集各孔細(xì)胞。按照Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，每孔細(xì)胞依次加入500 μl結(jié)合緩沖液Binding Buffer懸浮細(xì)胞，5 μl Annexin V-APC染液，5 μl 7-AAD染液，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 Western blot法檢測(cè)Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，Vector+OXA組和ENO3+OXA組細(xì)胞加入奧沙利鉑濃度為20 μmol/L的培養(yǎng)基，其余兩組加入不含奧沙利鉑的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。胰酶消化收集各組細(xì)胞，離心后除去上清液，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，然后4℃，12 000 r/min離心10 min得到細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后，取30 μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠與分離膠濃度均為10%；電泳結(jié)束后，將含有目標(biāo)蛋白的凝膠在300 mA，恒流條件下作用90 min，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。轉(zhuǎn)膜后，將膜置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉2 h，TBST洗滌后加入Bcl-2、Bax和Caspase-3抗體，4℃過(guò)夜孵育。次日取出一抗，洗滌后室溫避光孵育熒光二抗1 h。利用Odyssey LICOR雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測(cè)目標(biāo)蛋白，并分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Graphpad prism8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。肝癌組織和正常肝組織中ENO3表達(dá)差異的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ENO3在肝癌組織中的表達(dá)情況

肝癌組織中ENO3 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.270±0.307，正常肝組織為0.885±0.665，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）；肝癌組織中ENO3蛋白表達(dá)為3.375±1.632，正常肝組織為7.563±2.665，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001），見(jiàn)圖1。

2.2 ENO3過(guò)表達(dá)水平的驗(yàn)證

與Vector組相比，ENO3組ENO3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯提高。在MHCC97H細(xì)胞中，Vector組mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.028±0.162，ENO3組為9.261±0.855；Vector組蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.361±0.031，ENO3組為0.816±0.051，二者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0001）；HepG2細(xì)胞中，Vector組mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.948±0.126，ENO3組為14.540±1.155；Vector組細(xì)胞蛋白表達(dá)量為0.180±0.033，ENO3組為0.720±0.056，二者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0001），見(jiàn)圖2。

2.3 CCK-8法和克隆形成法檢測(cè)過(guò)表達(dá)ENO3聯(lián)合OXA對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

隨奧沙利鉑濃度的升高，兩組細(xì)胞的抑制率均逐漸升高，奧沙利鉑濃度為20 μmol/L時(shí)，Vector組細(xì)胞抑制率為（43.81±1.6）%，ENO3組為（58.76±1.1）%，兩組差異最為顯著（P＜0.0001），見(jiàn)圖3A。此濃度既可充分抑制細(xì)胞增殖能力，又不至于完全殺死細(xì)胞，使用此濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。奧沙利鉑分別處理各組細(xì)胞48 h后，兩種細(xì)胞Vector+OXA組和ENO3+OXA組細(xì)胞活力均降低（均P＜0.0001）。過(guò)表達(dá)ENO3聯(lián)合奧沙利鉑時(shí)，在MHCC97H細(xì)胞中，Vector+OXA細(xì)胞活力為（56.03±1.21）%，ENO3+OXA組為（39.91±1.40）%，與Vector+OXA組相比，ENO3+OXA組細(xì)胞活力可進(jìn)一步下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）。在HepG2細(xì)胞中，Vector+OXA組細(xì)胞活力為（62.90±3.43）%，ENO3+OXA組為（50.69±2.12）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0014），見(jiàn)圖3B?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ENO3后，ENO3組細(xì)胞較Vector組增殖能力下降；用奧沙利鉑處理后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，無(wú)法形成克隆球；顯微鏡下觀察，兩組細(xì)胞均僅有少量細(xì)胞增殖，其中ENO3+OXA組細(xì)胞增殖能力弱于Vector+OXA組，見(jiàn)圖3C、3D。

2.4 過(guò)表達(dá)ENO3聯(lián)合OXA對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

單獨(dú)過(guò)表達(dá)ENO3時(shí)，與Vector組相比，兩種細(xì)胞ENO3組細(xì)胞凋亡均無(wú)明顯變化。奧沙利鉑處理48 h后，在MHCC97H細(xì)胞中，Vector+OXA組細(xì)胞凋亡率為（20.58±1.46）%，ENO3+OXA組細(xì)胞凋亡率為（27.87±1.45）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0004）。在HepG2細(xì)胞中，Vector+OXA組細(xì)胞凋亡率為（5.33±0.32）%，ENO3+OXA組細(xì)胞凋亡率為（11.07±0.55）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001），見(jiàn)圖4。

2.5 過(guò)表達(dá)ENO3聯(lián)合OXA對(duì)肝癌細(xì)胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)影響

奧沙利鉑處理后，兩種細(xì)胞加藥組Bcl-2蛋白表達(dá)均降低，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)均增高。過(guò)表達(dá)ENO3聯(lián)合奧沙利鉑時(shí)，與Vector+OXA組相比，ENO3+OXA組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低（MHCC97H:P=0.025;HepG2:P=0.0008），而B(niǎo)ax（MHCC97H:P=0.0118;HepG2:P=0.0433）和Caspase-3（MHCC97H:P＜0.0001;HepG2:P=0.0127）蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高，見(jiàn)圖5。

3 討論

含奧沙利鉑的系統(tǒng)性化療是臨床治療中晚期HCC的一線方案[1]，應(yīng)用奧沙利鉑對(duì)HCC患者姑息性化療，可提高患者的總體生存率[12]?；熯^(guò)程中細(xì)胞容易出現(xiàn)耐藥，大大降低了治療效果[4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，肝癌組織中越來(lái)越多的異常表達(dá)基因被人們發(fā)現(xiàn)可影響肝癌的發(fā)生發(fā)展以及化療效果和預(yù)后[10]。

ENO3在正常肝臟組織中表達(dá)較高，可參與糖原代謝和脂質(zhì)代謝，其表達(dá)缺失可造成糖原代謝障礙[10]。ENO3在腫瘤中的研究較少，僅有研究發(fā)現(xiàn)其在非小細(xì)胞肺癌與結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)[13-14]，而在胰腺癌與肝癌中表達(dá)下調(diào)[10,15]。目前尚未有證據(jù)明確ENO3在腫瘤中的作用及其是否可增強(qiáng)化療藥物的殺傷作用。肝星狀細(xì)胞與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，其過(guò)度激活可致肝纖維化和肝硬化[16]，ENO3在激活的肝星狀細(xì)胞與肝癌中表達(dá)均下調(diào)[10-11]，預(yù)示著其可能在早期肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。

本研究結(jié)果顯示ENO3在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，與研究報(bào)道一致[10]?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)ENO3后，細(xì)胞的增殖能力下降；過(guò)表達(dá)ENO3聯(lián)合奧沙利鉑，細(xì)胞增殖能力可以在過(guò)表達(dá)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低，證明了二者有協(xié)同作用。我們?cè)贛HCC97H和HepG2細(xì)胞中分別單獨(dú)過(guò)表達(dá)ENO3以及過(guò)表達(dá)ENO3聯(lián)合奧沙利鉑后檢測(cè)各組細(xì)胞的活力與凋亡率，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ENO3后，細(xì)胞活力與凋亡率變化不明顯。然而過(guò)表達(dá)ENO3聯(lián)合奧沙利鉑后，細(xì)胞活力可在單獨(dú)使用奧沙利鉑的基礎(chǔ)上進(jìn)一步下降，凋亡率進(jìn)一步增加，說(shuō)明過(guò)表達(dá)ENO3可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感度。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是奧沙利鉑發(fā)揮作用的機(jī)制之一[2]。Bcl-2蛋白家族成員在凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，其家族成員Bax蛋白可從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，引起線粒體外膜通透性改變，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終由Caspase-3執(zhí)行凋亡[17-18]。Bcl-2作為抗凋亡基因，可抑制Bax蛋白在線粒體膜上形成復(fù)合物，減輕細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示奧沙利鉑可以誘導(dǎo)MHCC97H和HepG2細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)增加。我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ENO3后，細(xì)胞Bcl-2，Bax和Caspase-3蛋白變化不明顯，然而過(guò)表達(dá)ENO3聯(lián)合奧沙利鉑后，細(xì)胞Bcl-2蛋白較奧沙利鉑單獨(dú)作用條件下進(jìn)一步下降，Bax和Caspase-3蛋白則進(jìn)一步增加，提示ENO3可能通過(guò)下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax和Caspase-3來(lái)促進(jìn)凋亡進(jìn)而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感度。

綜上所述，ENO3在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)ENO3可以通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其對(duì)奧沙利鉑的敏感度。本研究為臨床提高HCC對(duì)奧沙利鉑的敏感度提供了新的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。