高海寧，白瑞霞，趙鵬偉，宋婉瑩，林萱

0 引言

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有隱匿性，嚴(yán)重威脅女性健康。盡管卵巢癌的治療效果在細(xì)胞減滅術(shù)和化療方面有所改善，但常在癌癥晚期被診斷為轉(zhuǎn)移和化療耐藥，5年總存活率不到30%[1]。自噬是真核細(xì)胞中高度保守的生物學(xué)行為，可在缺氧、饑餓或極端pH值等條件下激發(fā)，分解細(xì)胞不必要或喪失功能的成分，一旦缺失或過(guò)度激活則可能引起一系列病理改變[2]。研究證實(shí)，多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥都與自噬有著密不可分的聯(lián)系。在卵巢癌中，自噬水平下調(diào)，促進(jìn)自噬有助于抑制卵巢癌的發(fā)展[3]。自噬在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中的發(fā)生機(jī)制仍未闡明，亟需深入探索其生物學(xué)機(jī)制。MicroRNAs（MiRNAs）是一種由18～22個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后抑制信使RNA的表達(dá)。近期研究表明，miR-581與膽管癌、結(jié)直腸癌和食管鱗癌的增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)，也能夠在胃癌的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用[4-7]。因此本研究擬探究miR-581在卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3購(gòu)自BNCC（北納生物，河南）公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗、0.25%胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。miR-581 mimics、miR-581 NC以及miR-581引物和U6內(nèi)參引物的設(shè)計(jì)及合成均由廣州銳博生物科技有限公司完成。LC3抗體、Beclin1抗體、GAPDH抗體、FOXO1抗體均購(gòu)自CST（美國(guó)）。miRNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGN公司（北京）。反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。蛋白裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、SDSPAGE凝膠配置試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。ECL發(fā)光液購(gòu)自天根生化科技有限公司（北京）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒Lip3000購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。FOXO1抑制劑AS1842856購(gòu)自MCE公司（上海）。二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Heal-Force公司。ABI Step One Plus Real-Time PCR System購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。UVP BioSepctrum 610成像系統(tǒng)購(gòu)自UVP美國(guó)紫外線制品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞株在RPMI 1640完全培養(yǎng)基、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，RPMI 1640完全培養(yǎng)基包含10%胎牛血清，1%雙抗。培養(yǎng)基根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行更換，待細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、傳代和接種。

1.2.2 細(xì)胞分組 在檢測(cè)miR-581過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞構(gòu)建時(shí)，觀察miR-581對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和Beclin1表達(dá)的影響和觀察miR-581對(duì)靶基因FOXO1的影響，分別將細(xì)胞分為Control、miR-581 NC和miR-581 mimics組；在觀察靶基因FOXO1對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和Beclin1表達(dá)的影響時(shí)，將細(xì)胞分為Control和AS1842856組；在觀察miR-581通過(guò)靶基因FOXO1對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和Beclin1表達(dá)的影響時(shí)，將細(xì)胞分為Control、AS1842856、miR-581 mimics和miR-581 mimics+AS1842856組。上述分組，提取RNA時(shí)，轉(zhuǎn)染組作用時(shí)間均為24 h；提取蛋白時(shí)，轉(zhuǎn)染組作用時(shí)間均為48 h；AS1842856作用時(shí)間為24 h，且在miR-581 mimics+AS1842856組中AS1842856提前1 h加入。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞按照每毫升2.5×105個(gè)接種于6孔板中，待細(xì)胞密度為50%～60%時(shí)，根據(jù)Lip3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將miR-581 mimics及miR-581 NC轉(zhuǎn)染進(jìn)SKOV3細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至相應(yīng)的時(shí)間。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-581表達(dá)量 將Control、miR-581 NC和miR-581 mimics三組細(xì)胞根據(jù)說(shuō)明書(shū)分別提取miRNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA并作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）擴(kuò)增，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-581的表達(dá)情況。所有反應(yīng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，SYBR Green嵌合熒光方法在熒光定量PCR儀上擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因。以U6為內(nèi)參基因，miR-581的相對(duì)定量用2-ΔΔct法。

1.2.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平 將Control、miR-581 NC、miR-581 mimics、AS1842856、miR-581 mimics+AS1842856五組細(xì)胞根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，BCA 蛋白濃度測(cè)試盒測(cè)定并將樣品調(diào)定至統(tǒng)一濃度，加蛋白上樣緩沖液，沸水煮10 min使蛋白變性，分裝后于-80℃冰箱保存。取30 μg總蛋白通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入用抗體稀釋液稀釋的特異性一抗LC3、Beclin1、FOXO1、GAPDH（1:1 000），4℃過(guò)夜。次日用TBST洗滌3次，每次10 min。放入稀釋好的二抗中（1:2 000），室溫孵育1 h，用TBST再次洗滌3次，每次10 min。ECL法顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，計(jì)算灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，觀察各組檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-581過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞的構(gòu)建

與Control組相比，miR-581 NC組miR-581的表達(dá)變化不明顯（P＞0.05）；miR-581 mimics組明顯升高（P＜0.05）；與miR-581 NC相比，miR-581 mimics組也明顯升高（P＜0.05），以上結(jié)果表明miR-581過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞的構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-581對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，miR-581 NC組Beclin1、LC3Ⅱ表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；與Control和miR-581 NC組相比，miR-581 mimics組Beclin1、LC3Ⅱ表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.01），表明過(guò)表達(dá)miR-581能夠抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬的發(fā)生，見(jiàn)圖2。

2.3 過(guò)表達(dá)miR-581對(duì)FOXO1蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)TargetScanHuman數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示FOXO1的3’UTR含有2處與miR-581互補(bǔ)的序列，見(jiàn)圖3，F(xiàn)OXO1可能為miR-581的靶基因。進(jìn)一步Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示，與Control組相比，miR-581 NC組FOXO1表達(dá)量無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與Control和miR-581 NC組相比，miR-581 mimics組FOXO1表達(dá)量明顯降低（均P＜0.01）。表明過(guò)表達(dá)miR-581能夠抑制FOXO1的表達(dá)，見(jiàn)圖4。

2.4 FOXO1對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，加入AS1842856后，LC3Ⅱ和Beclin1表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），表明FOXO1能夠促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬的發(fā)生，見(jiàn)圖5。

2.5 miR-581通過(guò)FoxO1影響卵巢癌細(xì)胞自噬

Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，AS1842856組及miR-581 mimics組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)下調(diào)（P＜0.05、P＜0.01），miR-581 mimics+AS1842856組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)下調(diào)（P＜0.01、P＜0.01）；與AS1842856組相比，miR-581mimics+AS1842856組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)下調(diào)（P＜0.05、P＜0.01）；與miR-581mimics組相比，miR-581 mimics+AS1842856組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)下調(diào)（P＜0.05、P＜0.01），表明miR-581通過(guò)FOXO1影響卵巢癌細(xì)胞自噬，見(jiàn)圖6。

3 討論

卵巢癌位于女性癌癥性死亡的第五位，也是發(fā)達(dá)國(guó)家中最致命的婦科惡性腫瘤[8]。雖然卵巢癌的治療手段有所提高，但在過(guò)去的20年里，卵巢癌患者的生存率并沒(méi)有得到改善[9]。靶向治療能影響腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)、血管或細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]，因此，靶基因的發(fā)現(xiàn)可能為卵巢癌的治療提供新方向，進(jìn)一步改善患者的生存率。

2006年首次證明miRNA與癌癥的發(fā)生相關(guān)[11]。miRNA在癌癥中的作用主要通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)來(lái)影響多種生物過(guò)程，包括增殖、分化、細(xì)胞周期、凋亡和免疫應(yīng)答等[12]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中差異表達(dá)的miRNA通過(guò)調(diào)控靶基因影響卵巢癌細(xì)胞自噬的發(fā)生[13]。

自噬是細(xì)胞內(nèi)一種自我消化的過(guò)程，是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要途徑，在細(xì)胞增殖、分化和衰老中發(fā)揮重要作用[14]。隨著對(duì)自噬研究的深入了解，人們意識(shí)到自噬在腫瘤中的作用是一把雙刃劍，它既可以促進(jìn)也可以抑制腫瘤的發(fā)生，這取決于細(xì)胞環(huán)境和疾病階段[15]。例如，在腫瘤發(fā)生的早期階段，自噬水平的降低可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，刺激自噬可能有益于癌癥預(yù)防[16-17]。在近年來(lái)的研究中，多種類型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)均存在自噬水平的改變，如肺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌等[14]。自噬在卵巢癌進(jìn)展中的機(jī)制可能與自噬相關(guān)信號(hào)通路的激活或抑制、自噬相關(guān)的抑癌基因突變或缺失以及miRNAs的異常表達(dá)有關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-581抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬。

有研究發(fā)現(xiàn)miR-581通過(guò)靶基因SMAD7、影響結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[5]。miR-581在卵巢癌中的作用機(jī)制尚未闡明。FOXO1是叉頭盒O（FOXO）家族成員，在腫瘤中具有重要的調(diào)控作用[18]。而最近研究發(fā)現(xiàn)FOXO1是不同細(xì)胞類型和疾病條件下調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵介質(zhì)[19]。如李云等[20]研究發(fā)現(xiàn)幽門(mén)螺桿菌VacA能夠通過(guò)增加FOXO1蛋白的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的自噬。AS1842856是FOXO1的特異性抑制劑，有文獻(xiàn)報(bào)道AS1842856僅通過(guò)與FOXO1結(jié)合而降低FOXO1活性，而不影響其轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入抑制劑后，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)減少，F(xiàn)OXO1表達(dá)變化不明顯。TargetScanHuman數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)及Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO1為miR-581的靶基因，并且過(guò)表達(dá)的miR-581通過(guò)調(diào)控FOXO1的表達(dá)來(lái)影響卵巢癌細(xì)胞自噬。

綜上，本實(shí)驗(yàn)在卵巢癌細(xì)胞水平上證明了過(guò)表達(dá)miR-581可抑制FOXO1的表達(dá)，進(jìn)而抑制自噬的發(fā)生，為卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬的發(fā)展提供了新的理論機(jī)制，可能成為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)。