張燕，張紅蕊，孟丹丹，弋振營，徐志巧

0 引言

食管癌是發(fā)生于食管上皮組織的惡性腫瘤，是消化道常見的惡性腫瘤之一，早期診斷率較低、預(yù)后較差且死亡率較高[1-4]。在中國，食管癌的發(fā)病類型以食管鱗癌為主，占食管癌90%以上[5]。DNA損傷關(guān)鍵蛋白減數(shù)分裂重組蛋白11同系物A（meiotic recombination 11 homolog A,MRE11）是DNA損傷募集因子MRE11-RAD50-Nbs1（MRN）復(fù)合物的重要組分，在DNA損傷的感知和修復(fù)中起關(guān)鍵的作用[6-8]。研究表明，MRE11具有促進腫瘤發(fā)生的作用[9]，如MRE11高表達可促進乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展[10]。然而，尚無關(guān)于MRE11與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的報道。有文獻表明，MRE11可調(diào)控成纖維細胞中AKT的活性，且在淋巴細胞中AKT具有上調(diào)c-myc的作用[11-12]。另外，c-myc可促進食管鱗癌細胞增殖和抑制凋亡[13-14]。本研究擬通過干擾MRE11探究其對食管鱗癌細胞增殖和凋亡的作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Het-1A（貨號：CRL-2692）購自美國ATCC公司；Ec9706和TE-1購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室；胎牛血清（貨號：SH30084.02）、RPMI1640（貨號：SH30809.01）培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；BCA試劑盒（貨號：P0010）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；MRE11兔單抗（貨號：ab109623）、AKT兔多抗（貨號：ab8805）、磷酸化AKT兔單抗（phospho S473，貨號：ab81283）、c-myc兔單抗（貨號：ab32072）、GAPDH兔單抗（貨號：ab8245）和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（貨號：ab150077）均購自美國Abcam公司；BrdU試劑盒（貨號：QIA58）購自美國Sigma公司；Annexin-V FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：556547）購自美國PharMingen公司；Caspase-3活性檢測試劑盒（貨號：556485）購自美國BD公司；MRE11 siRNA（貨號：siB161221091618-1-5）和無關(guān)對照siRNA（貨號：siN0000001-1-5）購自廣州銳博生物公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

人食管上皮細胞Het-1A、人食管鱗癌細胞Ec9706和TE-1均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于5%CO2培養(yǎng)箱，37℃飽和濕度條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。分組如下：Het-1A組（人食管上皮細胞），Ec9706和TE-1組（食管鱗癌細胞），control組（正常培養(yǎng)的食管鱗癌細胞），MRE11 si組（轉(zhuǎn)染MRE11 siRNA的食管鱗癌細胞），non-spe組（轉(zhuǎn)染non-specific siRNA的食管鱗癌細胞），MRE11 si+0、0.1、0.5、1、1.5、1.8和2 μg/ml SC79組（下調(diào)MRE11后0、0.1、0.5、1、1.5、1.8和2 μg/ml SC79孵育細胞24 h），MRE11 si+pc組（轉(zhuǎn)染MRE11 siRNA和pcDNA3.1的細胞）和MRE11 si+c-myc組（轉(zhuǎn)染MRE11 siRNA和pcDNA3.1-c-myc的細胞）。

1.3 Western blot檢測MRE11、磷酸化AKT和c-myc蛋白表達量

收集細胞，加入細胞裂解液，冰浴25 min后收集蛋白，BCA法測定其濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻后，置于100℃沸水中變性5 min。取25 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，封閉后加入一抗：MRE11兔單抗（1:1 000）、AKT兔多抗（1:500）、磷酸化AKT兔單抗（1:5 000，phospho S473）、c-myc兔單抗（1:1 000）或GAPDH兔單抗（1:1 000），4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育2 h。ECL發(fā)光試劑浸泡膜顯影，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。GAPDH為內(nèi)參對照蛋白。以目的蛋白條帶與GADPH灰度比值表示蛋白相對表達水平。

1.4 c-myc過表達載體的構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染

TRIzol法提取待測細胞的總RNA，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)cDNA，PCR擴增c-myc（GenBank accession number NM_002467）全長（包括酶切位點XhoⅠ和EcoRⅠ）序列，擴增產(chǎn)物分別與質(zhì)粒pcDNA.3.1同時進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化到DH5α中擴增，篩選陽性克隆，鑒定，測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pcDNA.3.1-c-myc。將Ec9706和TE-1分別接種于96孔板，于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)12 h，待細胞融合達到80%，按照轉(zhuǎn)染試劑操作說明進行細胞轉(zhuǎn)染實驗。將分別含有pcDNA.3.1-c-myc（3 μg）、pcDNA.3.1（3 μg）、MER11 siRNA（5′-GGA GGU ACG UCG UUU CAG AdTdT-3′，3 μg）或無關(guān)對照siRNA（3 μg）的轉(zhuǎn)染試劑與200 μl不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基混合加入各孔，37℃、5%CO2孵育24 h，Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.5 Caspase-3活性檢測

收集細胞，按照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書檢測Caspase-3活性，酶標(biāo)儀測定420 nm處吸光度。

1.6 Annexin-V FITC/PI檢測細胞凋亡

按照Annexin-V FITC/PI試劑盒說明書檢測細胞凋亡，首先用磷酸鹽緩沖溶液預(yù)冷細胞，然后用Annexin-V FITC（13 μl）于4℃孵育細胞28 min，PBS洗滌細胞一次，加入10 μl PI孵育7 min。流式細胞分析儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 BrdU檢測細胞增殖

按照BrdU ELISA試劑盒說明書檢測各組Ec9706和TE-1細胞的增殖能力，將Ec9706和TE-1細胞分別接種于96孔板進行轉(zhuǎn)染，24 h后每孔加入12 μl BrdU，孵育1.5 h。去上清液，加入100 μl變性溶液孵育細胞15 min。相繼加入BrdU抗體和二抗，最后加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）孵育25 min。酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)值均采用（均數(shù)±SEM）表示。兩組均數(shù)間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRE11在食管鱗癌細胞中表達量升高

Western blot檢測結(jié)果表明，Ec9706和TE-1細胞中MRE11的蛋白表達量較人食管上皮細胞Het-1A顯著升高（P=0.0109和P=0.0325），見圖1。

2.2 下調(diào)MRE11表達抑制食管鱗癌細胞增殖

與non-spe組比較，MRE11 si組中Ec9706和TE-1細胞中MRE11的蛋白表達量顯著降低（P=0.0168和P=0.0117），細胞轉(zhuǎn)染成功，MRE11 si組Ec9706和TE-1細胞增殖能力顯著下降（P=0.0135和P=0.0103），見圖2。

2.3 下調(diào)MRE11表達促進食管鱗癌細胞凋亡

與non-spe組比較，MRE11 si組Ec9706和TE-1細胞凋亡率顯著升高（P=0.0398和P=0.0452），且caspase-3活性顯著上升（P=0.0125和P=0.0231），見圖3。

2.4 MRE11通過調(diào)控AKT磷酸化水平來調(diào)節(jié)c-myc表達

與non-spe組比較，MRE11 si組Ec9706和TE-1細胞AKT磷酸化水平（P=0.0317和P=0.0172）和c-myc蛋白表達量（P=0.0258和P=0.0155）明顯下降，見圖4A。與MRE11 si+0 μg/ml組比較，MRE11 si+1.5（P=0.0185和P=0.0206）、1.8（P=0.0197和P=0.0218）和2 μg/ml組（P=0.0161和P=0.0233）AKT磷酸化水平明顯升高，MRE11 si+1.5（P=0.0162和P=0.0219）、1.8（P=0.0188和P=0.0235）和2 μg/ml組（P=0.0237和P=0.0162）c-myc蛋白表達量顯著升高，見圖4B。與MRE11 si組比較，MRE11 si+1.5 μg/ml組Ec9706和TE-1細胞增殖顯著上升（P=0.0124和P=0.0263），且細胞凋亡顯著下降（P=0.0153和P=0.0245），見圖5。

2.5 MRE11通過調(diào)節(jié)c-myc表達影響食管鱗癌細胞增殖和凋亡

與MRE11 si+pc組比較，MRE11 si+c-myc組Ec9706和TE-1細胞中c-myc蛋白表達量顯著升高（P=0.0147和P=0.0259），見圖6A，細胞增殖率顯著升高（P=0.0165和P=0.0211），見圖6B，caspase-3活性顯著降低（P=0.0207和P=0.0239），見圖6C。

3 討論

食管鱗癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，雖然根治性食管鱗癌切除術(shù)聯(lián)合化療的治療方案已經(jīng)普及，但由于大部分患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，5年生存率較低[15-16]。降低細胞的增殖能力和誘導(dǎo)細胞凋亡將大大提高食管鱗癌的治療效果[17]。MRE11、RAD50和NBSl組成MRN復(fù)合物，對DNA損傷的感知和修復(fù)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要作用，在維持端粒、細胞周期檢查點信號系統(tǒng)、DNA復(fù)制和DNA雙鏈斷裂過程中必不可少[18-19]。Tuxworth等[20]研究發(fā)現(xiàn)，MRE11可降低DNA損傷，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。Yuan等[10]表明MRE11高表達顯著促進乳腺癌細胞的增殖并促進乳腺癌的發(fā)展。然而，Borde等[21]報道顯示MRE11具有抵抗癌癥發(fā)生發(fā)展的重要作用。目前為止仍沒有關(guān)于MRE11對食管鱗癌細胞增殖和凋亡作用的報道。本研究發(fā)現(xiàn)MRE11蛋白表達量在食管鱗癌細胞Ec9706和TE-1中顯著上調(diào)。MRE11 siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞下調(diào)MRE11的表達，有效促進細胞凋亡和caspase-3活性，并且抑制細胞增殖能力。

Fraser等[11]研究表明MRE11可調(diào)控成纖維細胞AKT磷酸化水平。另外，Dominguez-Caceres等[12]發(fā)現(xiàn)在淋巴細胞中AKT具有調(diào)節(jié)c-myc表達量的作用。AKT又稱為蛋白激酶B（protein kinase B,PKB），是細胞增殖和凋亡的重要調(diào)控因子[22]。有文獻表明，AKT活化增強前列腺上皮細胞的增殖能力[23]。在BRD4對膽囊癌細胞增殖和凋亡的作用中AKT也扮演了不可或缺的角色[24]。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)抑制AKT活化具有促進骨肉瘤細胞凋亡的作用。癌基因c-Myc是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、刺激細胞周期[26]。Mahapatra等[27]報道表明降低c-myc表達顯著抑制黑色素瘤和卵巢癌細胞的增殖。干擾c-myc表達促進肺腺癌細胞凋亡[28]。本研究結(jié)果顯示，抑制MRE11表達明顯降低AKT磷酸化和c-myc蛋白表達量，并且AKT激動劑SC79（1.5、1.8和2 μg/ml）顯著逆轉(zhuǎn)了下調(diào)MRE11對c-myc蛋白表達量的抑制作用。說明MRE11可通過調(diào)節(jié)AKT磷酸化水平來調(diào)控c-myc的表達量。目前，已有文獻表明，下調(diào)c-myc表達量可抑制食管鱗癌細胞增殖并促進其凋亡[29-30]。因此，抑制MRE11可通過AKT下調(diào)c-myc表達量，進而抑制食管鱗癌細胞增殖和促進其凋亡。

綜上，MRE11在食管鱗癌細胞中表達量顯著升高，下調(diào)其表達量明顯抑制食管鱗癌細胞增殖且促進細胞凋亡。在食管鱗癌細胞中，干擾MRE11可抑制AKT磷酸化和c-myc的表達量。另外，MRE11通過AKT調(diào)節(jié)c-Myc的表達，從而實現(xiàn)對食管鱗癌細胞增殖和凋亡的調(diào)控作用。