文中馳，劉拓宙，何洪波，章燦，劉育鵬，廖瞻，曾莉怡

0 引言

骨肉瘤是兒童和青少年人群最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤[1-2]。隨著骨肉瘤治療方式的不斷進步，患者的生存時間與生存質(zhì)量均大幅提升，但骨肉瘤患者5年無病生存率仍維持在60%～70%，其治療進入平臺期[2-5]。

胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R）與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，以往研究多以阻斷胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或直接針對IGF-1或IGF-1R設(shè)計抗體藥物[6-8]，但是現(xiàn)有的臨床研究結(jié)果不理想[4,9-21]，歸其原因是IGF-1R與胰島素受體的同源性。運用抗IGF1R的單克隆抗體常易引起高血糖癥與高胰島素血癥，此外，IGF1R受體被單克隆抗體阻斷之后，機體會代償性分泌大量的IGF1因子和生長激素，使兩者在身體循環(huán)中的水平大幅提升，易誘導(dǎo)患者出現(xiàn)胰島素抵抗。這常被視為IGF受抑制之后機體對IGF缺乏的一種補償。因此，抗IGF1R的單克隆抗體存在有效性不足與可能引起代謝紊亂的不良反應(yīng)[10-13,22]。研究表明，通過設(shè)計IGF1R可溶性肽段來競爭性抑制OS生物學行為是可行的[23]，而至今尚沒有單獨針對IGF1R的β亞基是否可以抑制骨肉瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移，并促進骨肉瘤細胞凋亡的研究。

本研究針對IGF1Rβ亞基的分泌段（s）和跨膜段（m），分別設(shè)計sb-IGF1R、ma-IGF1R兩個可溶性突變體。觀察兩者對骨肉瘤143B細胞生物學行為的影響。明晰其在骨肉瘤中是否具有抑制骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移，從而為骨肉瘤的防治尋找新的有效策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 細胞株 人骨肉瘤細胞系143B購自美國ATCC公司。

1.1.2 質(zhì)粒 piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)與AdEasy系統(tǒng)均由芝加哥大學醫(yī)學中心骨科分子腫瘤學實驗室自創(chuàng)。

1.1.3 主要試劑與儀器 MTT、TRIzol試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司；活體動物成像技術(shù)Xenogen試劑購自美國Xenogen公司；Hoechst試劑購自美國BioLab實驗室；結(jié)晶紫試劑購自美國Sigma公司；Real-time PCR試劑盒購自中國翊圣生物科技有限公司。流式細胞儀（ALTRA）、定量PCR 儀（5700型）、超低溫冰箱均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；紫外/可見光分光光度儀（DU-640）購自美國Beckman公司；熒光顯微鏡購自德國Leica公司；PCR基因擴增儀（9600型）購自美國PE公司。

1.2 研究方法

1.2.1 骨肉瘤細胞的培養(yǎng) 取生長狀態(tài)良好的骨肉瘤143B細胞，應(yīng)用常規(guī)高糖DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素（美國Gibco公司），置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)IGF1R結(jié)構(gòu)，見圖1A，對β亞基的分泌段（s）和β亞基跨膜段（m）分別設(shè)計了一個可溶性肽段sb-IGF1R（741-936aa）和可附著于膜外的（membrane-anchored）ma-IGF1R（741-959aa），見圖1B。將設(shè)計好的兩種針對IGF1Rβ亞基的可溶性肽段通過PCR擴增獲得sb-IGF1R與ma-IGF1R的片段，利用AdEasy系統(tǒng)，按照經(jīng)典分子克隆方法進酶切、沉淀、連接等步驟將目的片段克隆進穿梭質(zhì)粒pAdTrace中。將電轉(zhuǎn)產(chǎn)物涂抹到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)板培養(yǎng)，挑選陽性克隆，通過PCR篩選，酶切鑒定，PCR鑒定，測序之后，將正確克隆擴增，抽提質(zhì)粒保存。

1.2.3 腺病毒的包裝與擴增及實驗分組 將帶有不同目的片段的pAdTrace質(zhì)粒進行EcoRⅠ酶切反應(yīng)，然后電轉(zhuǎn)到BJ-AdEasy1細菌中進行重組，將重組質(zhì)粒提取后轉(zhuǎn)染到普通HEK293細胞，包裝成腺病毒，裂解并收集第一輪病毒，經(jīng)3～4輪擴增后得到較高滴度、可用于實驗的腺病毒液AdsbIGF1R和Ad-maIGF1R組。構(gòu)建IGF1R的RNA干擾腺病毒Ad-GFP，作為驗證Ad-sbIGF1R和AdmaIGF1R有效性的陰性對照組。

1.2.4 實時定量PCR實驗 采用TRIzol及酚-氯仿法提取制備總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后于-20℃保存。采用iQ5 Real-time PCR檢測系統(tǒng)。反應(yīng)條件：95℃變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共擴增35個循環(huán)。最后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后統(tǒng)計每個樣本反應(yīng)的Ct值。GAPDH引物序列：上游引物：5’-AGCCGAAGCAGGAACACC-3’；下游引物：5’-TCAGCCTCGTGGTTGCAG-3’。

1.2.5 骨肉瘤細胞增殖、凋亡和遷移能力實驗 MTT實驗檢測骨肉瘤細胞增殖，將培養(yǎng)細胞接種于培養(yǎng)板中，各組經(jīng)不同條件處理后，棄上清液，按試劑盒說明進行操作。過表達的兩組Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R腺病毒分別處理骨肉瘤143B細胞，48和72 h后行Hoechst染色，熒光顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化，每個時間點分別重復(fù)三次。培養(yǎng)的細胞經(jīng)消化、收集重懸后用70%酒精固定，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。細胞劃痕實驗檢測各組骨肉瘤143B細胞遷移能力，各組感染率均在60%左右，用移液器槍頭劃痕，分別在0、24和48 h針對同一視野攝像，觀察細胞的遷移能力。用Image J軟件分析各組細胞遷移面積。

1.2.6 裸鼠皮下荷瘤實驗 采用4周雄性裸鼠制作腫瘤模型。所有動物飼養(yǎng)和處理程序均由中南大學湘雅三醫(yī)院機構(gòu)動物護理和使用委員會批準。收集對數(shù)生長期不同種類的骨肉瘤細胞，于小鼠四肢根部及胸部行皮下注射，第6、9、12天用直尺測量腫瘤體積，在第12天對小鼠進行活體成像，觀察腫瘤在小鼠皮下的生長和定植情況。定量分析采用Xenogen公司的活成像V2.50.1軟件。待觀察結(jié)束，在第12天處死小鼠，收集腫瘤組織，用HE染色觀察病理形態(tài)。

1.2.7 病理學分析 組織切片HE染色：新鮮組織從小鼠體內(nèi)分離后迅速放入4%多聚甲醛中，4℃固定過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。經(jīng)脫蠟水合后可用于化學染色。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad5軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。兩兩之間比較采用雙尾Student’st檢驗。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建后的Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R在骨肉瘤143B細胞中的表達結(jié)果

結(jié)果顯示，Ad-sbIGF1R和Ad-maIGF1R兩種可溶性肽段成功轉(zhuǎn)染骨肉瘤143B細胞，見圖2A。對轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細胞株143B進行半定量RT-PCR分析，結(jié)果顯示，與對照組Ad-GFP相比，Ad-sbIGF1R和Ad-maIGF1R在骨肉瘤細胞中明顯呈高表達（P＜0.001），見圖2B。

2.2 Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R抑制骨肉瘤143B細胞的遷移

劃痕實驗結(jié)果顯示，與Ad-GFP對比，AdsbIGF1R和Ad-maIGF1R組骨肉瘤細胞的遷移受到抑制。與Ad-GFP對照組相比，Ad-sbIGF1R和AdmaIGF1R組的骨肉瘤細胞愈合率均下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖3。

2.3 Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R抑制骨肉瘤143B細胞的增殖

MTT實驗結(jié)果表明，在低血清（1%FBS）或無血清培養(yǎng)條件下，Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R對骨肉瘤細胞的增殖均具有抑制作用。其中，Ad-sbIGF1R效果最顯著。收集無血清培養(yǎng)組的細胞，裂解后，分光光度計檢測細胞的吸光度值，在分別處理24、48、72 h后，與Ad-IGF相比，AdsbIGF1R明顯抑制骨肉瘤細胞143B增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

2.4 Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R促進骨肉瘤143B細胞的凋亡

與對照組相比，Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R組分別在處理骨肉瘤143B細胞48和72 h后，可見兩組細胞核及細胞形態(tài)變化明顯，兩組凋亡細胞所呈現(xiàn)的核固縮、溶解、碎裂更多，如圖5中箭頭所示，細胞膜及細胞器膜相對完整，但細胞體積變小。細胞周期分析結(jié)果顯示：與空白對照組相比，Ad-sbIGF1R和Ad-maIGF1R組的G0/G1期細胞數(shù)明顯增加（P＜0.05），S期細胞數(shù)明顯降低（P＜0.01），其中Ad-sbIGF1R組的S期細胞數(shù)降低最明顯（P＜0.001），見圖5。

2.5 Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R在體外抑制腫瘤的生長

荷瘤實驗結(jié)果顯示，Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R兩組突變體有效抑制了種植在裸鼠皮下的骨肉瘤細胞生長；Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R轉(zhuǎn)染的143B細胞，注射4周后觀察裸鼠皮下腫瘤大體觀，可見Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R組裸鼠平均腫瘤體積明顯小于Ad-GFP對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖6A。

活體成像顯示，在皮下注射12天后的突變體與對照組相比，兩個突變體組成像信號明顯較低，表明腫瘤生長明顯抑制；量化分析活體成像的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖6B；HE染色結(jié)果顯示，各組腫瘤在顯微鏡下表現(xiàn)為典型的骨肉瘤，且兩種IGF1Rβ亞基突變體誘導(dǎo)的腫塊壞死明顯，增殖細胞明顯減少，見圖6C。

3 討論

IGF信號在正常骨的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其主要信號分子IGF1和IGF2以多肽的形式通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌的方式發(fā)揮作用，它們的受體IGF1R可以形成同源二聚體，也可以與胰島素受體（insulin receptor,IR）一起形成 IR/IGF1R雜交受體。兩類受體都能被IGF1與IGF2所激活，并觸發(fā)IGF1R自身的磷酸化以及下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括PI3K/AKT和Ras/Raf/ERK信號通路，而這些通路被廣泛認為與癌癥發(fā)生密切相關(guān)[20-21,24]。IGF1R通路在腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化過程中被認為是不可或缺的，其在體內(nèi)的表達水平與癌癥發(fā)生密切相關(guān)。兒童及青少年最常發(fā)生的骨肉瘤部位是長骨的干骺端，此處也是IGFs水平最高的區(qū)域。而在IGF信號缺失的情況下，癌癥的發(fā)生率也將降低。Kuijjer等運用全基因組表達分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)高級骨肉瘤活檢標本與細胞系中，IGF1R均高表達，而與之相反，其上游的抑制因子表達卻下調(diào)[20]。與此同時，也有研究發(fā)現(xiàn)IGF信號通路參與骨肉瘤的生長、轉(zhuǎn)移等生物學行為，激活后的IGF1R觸發(fā)下游的分子事件，促使腫瘤細胞表現(xiàn)出更強的增殖、抗凋亡和轉(zhuǎn)移能力[22]。

IGF1R是一種四聚體結(jié)構(gòu)，由1 367個氨基酸組成的大分子結(jié)構(gòu)，其擁有4個亞基，膜外2個α亞基和跨膜的兩個β亞基。本研究提出了一種全新設(shè)計的阻斷骨肉瘤IGF信號的策略，即針對IGF1Rβ亞基設(shè)計的兩個“顯性負性”可溶性突變體，分別為針對β亞基的sb-IGF1R（包括aa741-936）和根據(jù)β亞基跨膜段設(shè)計可錨定于膜上的ma-IGF1R（包括aa741-959）。這一設(shè)計避免了單克隆抗體治療策略對胰島素通路的“誤傷”，能更加精確的作用于IGF通路，因此，分子量較小的IGF1R胞外可溶性短肽具有高度的特異性、有效性和體內(nèi)負作用更小的優(yōu)勢。本研究將Ad-sbIGF1R、Ad-maIGF1R兩種突變體成功轉(zhuǎn)染骨肉瘤143B細胞后，結(jié)果顯示細胞增殖、遷移均顯著抑制，同時能誘導(dǎo)骨肉瘤細胞凋亡。MTT結(jié)果表明，Ad-sbIGF1R能更早抑制骨肉瘤細胞增殖，且抑制增殖效果更明顯；并且Ad-sbIGF1R組的S期細胞數(shù)降低最明顯，這可能是因為β亞基的分泌段（s）能更快接受到IGF配體。另外，Ad-sbIGF1R和Ad-maIGF1R似乎對G2/M期影響不大，兩者可能是通過增加G0/G1期和減少S期抑制OS細胞進展。

綜上所述，無論體外實驗還是體內(nèi)實驗都提示可溶性突變體可能通過競爭性結(jié)合大部分胰島素樣受體配體來抑制骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，以及促進骨肉瘤細胞的凋亡。這種改良后的IGF1R受體，可能為臨床治療的應(yīng)用提供了一種全新的思路，減少對生理性胰島素通路的影響。后續(xù)工作中，將進一步探討Ad-sbIGF1R和Ad-maIGF1R影響骨肉瘤細胞及小鼠腫瘤生長的分子機制。