劉旭玲， 左文思， 劉 威， 王良文， 張段芹， 李松晶

(1.鄭州輕工業(yè)大學 機電工程學院， 河南 鄭州 450002； 2.哈爾濱工業(yè)大學 機電工程學院， 黑龍江 哈爾濱 150001)

引言

微混合器是微流控應用中一個重要組件，特別是在生化分析和生物領域需要兩個或更多的液體混合[1-2]。在微尺度下，低雷諾數(shù)流動處于層流狀態(tài)，液體混合只能通過自然對流進行。在體積/面積比較小的微流控芯片中，緩慢的擴散混合遠遠不能滿足需求，尤其是在有大分子(比如細胞)需要擴散的場合，實驗時間、研究成本、試劑消耗量大大增加，有悖于“綠色環(huán)?！钡目茖W實驗宗旨[3-4]。為了克服這個問題，目前很多學者對被動和主動的微混合器進行了研究。為了增加不同液體樣品的界面接觸面積，實現(xiàn)更好的混合，被動混合器利用通道幾何形狀來折疊流體流[5-6]。這類無源微混合器的缺點是微通道較長和設計結構的較復雜， 在制造過程中容易增加故障率。在微流體網(wǎng)絡中，主動混合可以通過多種方法來實現(xiàn)[7-10]。主動式微混合器中一種比較流行的是配置式氣動微混合器，它由外部正、負氣壓驅動[11-12]。HSIUNG等[13]研究了一種新型氣動微混合器，利用兩對氣動側動壁在動態(tài)對稱和動態(tài)不對稱模式下對樣品進行混合。但該類氣動微混合器結構復雜，封裝時容易造成坍塌，且很難操作。

在相對狹小、封閉且操作時間短的微流控芯片上作業(yè)，這種環(huán)境下混合效果的檢測面臨很大挑戰(zhàn)。在傳統(tǒng)方法中，利用人眼根據(jù)混合試劑的顏色來判斷兩種或多種液體試劑的混合效果。該方法受燈光、觀察位置、視差和人為感知能力等因素影響，容易造成對結果判斷的不精確。利用熒光顯微鏡獲得定量混合效率來獲取圖像，用數(shù)字圖像處理技術評估密封微通道網(wǎng)絡中的混合效率，缺點是后期處理復雜且設備昂貴。一些學者通過圖像中示蹤粒子密度指標來反映混合均勻程度，該方法因需要考慮圖像中每兩個粒子之間的權值和圖像灰度差，故示蹤粒子密度的計算量較大。而且，利用微珠濃度來反應液體試劑的混合效率不是一種直接、有效、方便的測量方法[14-17]。

本研究提出一種新型基于RGB色彩模型的混合效率量化分析方法，根據(jù)數(shù)字圖像對混合結果進行量化分析。利用高彈PDMS材料和軟刻蝕方式對結構簡單的氣動微混合芯片進行封裝，利用兩種不同顏色的試劑進行混合實驗研究。實驗結果表明，這種微混合芯片和混合效率的量化分析方法簡單、方便，可用于生物反應、孵化和其它生物化學應用場合。

1 基于RGB色彩模型的混合效率

利用數(shù)字電荷耦合設備(CCD)相機來捕捉混合圖像的紅、綠、藍(RGB，三種原色)數(shù)據(jù)，以實現(xiàn)色度測量。通過色彩模型數(shù)學模型，可以實現(xiàn)RGB色彩模型向灰度模型的轉換。Ri、Gi和Bi分別表示每個像素的三種原色R、G和B值，通過計算其RGB數(shù)據(jù)的平均值，得到每個像素的灰色數(shù)據(jù)(Ci)。根據(jù)人眼的視覺特征和對原色的敏感度，定義了線性加權平均的權重來補償敏感度的不均勻性，一般R、G和B分量值得權值分別為0.299、0.587和0.114。該轉換模型可以用式(1)來表示，實現(xiàn)RGB色彩空間到灰度空間的轉化[18]。

Ci=Ri*0.299+Gi*0.587+Bi*0.114

(1)

混合效率灰度差評價法是根據(jù)顏色的分布表示混合效果的方法。利用立體式顯微鏡采集得到數(shù)字圖像，對其進行分析處理，根據(jù)整個被測區(qū)域內(nèi)圖像色彩的偏移量(均勻性)評價混合程度，整幅圖像的色彩均勻度通過計算數(shù)字圖像上每個像素點的灰階與其它各像素點的灰階的偏差來表示。例如，CCD圖像的像素分辨率為m×n，定義其某一像素(i，j)與另一像素(p，q)之間的灰度偏差Eij用式(2)表示[19]。

p≠i或q≠j

(2)

式中,aij—— 像素(i，j)的灰階

apq—— 像素(p，q)像素(i，j)的灰階

Eij—— 像素(i，j)與所有像素點灰度差的加權和，加權因子為距離的倒數(shù)

整個圖像的總灰度差用式(3)表示[20]。

(3)

混合效率可用以下混合效率指數(shù)(混合指數(shù))來量化，用式(4)表示。

(4)

這種根據(jù)像素點的RGB值計算圖像混合效率的方法直觀清晰，但是因為要計算每個像素點與其它像素點的灰度差，因此計算量巨大，一個分辨率為100×100 ppi的CCD照片，乘法計算量可達到107次左右，耗費太多的計算時間。因此，采用簡化的灰度偏差來評價混合區(qū)域的混合效率。用式(5)和式(6)的計算方法定義了混合效率Imix[21]。

(5)

(6)

式中,N—— 測量區(qū)域內(nèi)的像素點數(shù)目

Ci—— 每一個像素點的灰階

若兩液流充分混合，則Imix=1，若完全沒有混合，則Imix=0。

2 實驗準備

2.1 材料和設備的選取

采用具有高彈易變形特性PDMS材料作為封裝微混合器的主要結構材料，相比于其他常見的微流控芯片制備材料，具有許多理想的微制備特性，包括生物相容性、靈活性、透明度和易于封裝的優(yōu)越性[22]。

實驗過程中使用的藍、黃色試劑均采用兩種固態(tài)水彩顏料和DI水混合而成，質量比為1∶1。固態(tài)水彩顏料顆粒細膩，具有水溶解性，試劑顏色較高，有利于觀察和采集數(shù)字圖像。液體水彩顏料具有色彩艷麗、透明高、表現(xiàn)力佳和高耐恒久的穩(wěn)固特性，常用作微流控混合實驗中的有色試劑[23]。

拍照環(huán)境為室內(nèi)環(huán)境自然光源下，混合過程和結果由立體顯微鏡(MA2003A)用CCD攝像機拍攝，拍攝鏡頭垂直于微混合芯片表面拍攝照片。該顯微鏡變倍比為1∶6.4，目鏡采用WF10X/20 mm，放大倍數(shù)為7x-45x。該顯微鏡照明采用透射光源12V/15W鹵素燈，亮度獨立可調(diào)，且底座配置7W熒光燈。CCD攝像機拍攝后上傳到PC機中利用MATLAB圖像處理功能進行處理。需要說明的是，在不同的光源強度、照度下，采集的數(shù)字圖像的RGB值會有微小變化，但是基于圖像的混合效率量化分析方法僅與圖像像素任意兩點之間的灰度差有關系，因此在自然光源下，輔助光源對后期混合效率量化分析影響不大。

2.2 設計和封裝

氣動微混合芯片結構如圖1a所示，把液體溶液a和b分別放置于R1和R2儲液區(qū)，利用氣壓驅動液流系統(tǒng)將其泵入液體微流道內(nèi)。PDMS氣壓驅動微閥Vp1和Vp2分別控制a、b兩種試劑參與混合的量，即當兩種液流試劑驅動壓力一定時，Vp1驅動腔壓力決定了其膜閥閥口開度，從而控制系統(tǒng)中a試劑的流速及流量，同樣Vp2驅動腔壓力決定系統(tǒng)中b試劑的流速及流量，從而控制a和b試劑質量(體積)比。實際應用中，可根據(jù)需要參與反應的量，分別調(diào)節(jié)Vp1和Vp2驅動腔的壓力，以控制不同試劑參與混合的量。

兩種溶液在微混合器M中充分混合并反應后，經(jīng)由蠕動式微泵P泵出，在儲液區(qū)R3進行收集整理。上層液體微混合腔M設計尺寸為1.0 mm×1.0 mm×0.1 mm，下層驅動腔尺寸為0.8 mm×0.8 mm×0.1 mm，微混合腔和驅動腔的中心位置在空間上重疊放置，進氣微流道和進液微流道在空間上垂直，形成對稱結構，中間層是40 μm厚PDMS驅動薄膜。圖中，黃色代表黃色試劑，藍色代表藍色試劑，綠色代表完全混合后試劑，粉色代表氣體驅動層。

圖1b是PDMS驅動薄膜在一個驅動循環(huán)內(nèi)的運動，開關信號控制PDMS氣壓驅動微閥Vp打開，黃色和藍色試劑分別進入液體微流道，然后進入微混合腔。當三通微閥Vt與氣源連接的端口打開時，壓縮氣體進入驅動腔，PDMS驅動薄膜向微混合腔

圖1 氣動微混合芯片結構及其工作原理示意圖

方向運動，促使微混合腔內(nèi)流體產(chǎn)生對流，加速混合。三通微閥Vt與氣源連接端口關閉，驅動腔與大氣連接的端口打開，驅動腔內(nèi)壓力降低時，PDMS驅動薄膜形變恢復，擠壓出的液體回流到微混合腔內(nèi)。運行多個循環(huán)，微混合腔內(nèi)兩種試劑由于振動產(chǎn)生對流，快速、充分混合[24]。

微混合腔和驅動室的封裝尺寸分別為1.0 mm×1.0 mm×0.1 mm和0.8 mm×0.8 mm×0.1 mm，如圖2所示，微混合腔與驅動室的中心位置重疊，形成對稱結構。與驅動腔連接的氣體微通道和與微混合腔連接的液體微通道在空間上垂直，中間層薄膜厚度為40 μm，由勻膠機設置1500 r/min旋涂制備。

圖2 封裝的PDMS氣動微混合芯片照片

采用干膜負光刻膠模具制備具有矩形截面的氣動層，帶圓弧角的方形微混合腔和帶圓弧邊緣的微通道可采用正性光刻膠高溫回流工藝實現(xiàn)，關于封裝過程的詳細工藝可以在本課題組之前的研究中找到[25]。

2.3 試劑混合

實驗前，用去離子水(DI)水清洗微微流控芯片約10 min，以排出微混合腔內(nèi)的氣泡。利用藍色和黃色兩種明亮而易區(qū)分的顏色，進行混合性能實驗研究。藍色液體和黃色液體分別用于代表兩種不同的樣品試劑。實驗研究中，黃色試劑約0.04 μl，藍色試劑約0.02 μl，通過驅動裝置泵入到微混合腔中。根據(jù)顏色匹配原理，當藍色試劑大于黃色試劑時，人眼觀察到的混合試劑顏色為灰色，否則為綠色。對微混合腔中兩種試劑的混合現(xiàn)象進行觀測，需要借助顯微鏡來觀察其變化過程。試劑注入和混合過程的圖像經(jīng)由MA2003A體視顯微鏡的光路放大后，由高速圖像采集系統(tǒng)CCD感應混合動態(tài)目標光線生成數(shù)字圖像，傳輸給計算機，經(jīng)由存儲處理平臺完成數(shù)字圖像數(shù)據(jù)的合成并動態(tài)存儲，為混合效率的量化提供試驗數(shù)據(jù)。

3 實驗結果和討論

利用圖像采集系統(tǒng)采集黃色和藍色試劑分別充滿微混合腔的數(shù)字圖像，并利用圖像處理軟件Adobe Photoshop中的顏色拾取器工具或仿真軟件MATLAB中的數(shù)據(jù)提取點工具，提取其每個像素點的RGB值。后續(xù)處理的數(shù)字圖像是通過CCD線性相機的成像裝置放大后拍攝，其放大倍數(shù)為30倍。獲取圖像過程中應根據(jù)實際光線效果調(diào)整CCD參數(shù)，

以實現(xiàn)正確的自動曝光、聚焦和白平衡等。CCD數(shù)字圖像分辨率為每英寸96個像素點，測量區(qū)域數(shù)字圖像包含1104×1098個像素點。向微混合器的微混合腔內(nèi)充入一定比例的黃和藍色試劑，自然對流情況下，觀察微混合腔內(nèi)兩種不同顏色試劑的混合情況，如圖3a所示，顏色強度的變化過程表示樣品混合的過程。根據(jù)顯微照片的顏色，可以看出在自然對流條件下25 min時還沒有完全混合。驅動腔壓力為0.01 MPa，采用振動混合方式，氣動微混合芯片振動頻率設置為2 Hz，振動混合過程顯微照片如圖3b所示。人眼觀察微混合腔圖片時，在5 s時混合試劑顏色幾乎接近于統(tǒng)一，說明微混合腔內(nèi)兩種試劑接近于完全混合，即溶劑在經(jīng)歷5次振動后幾乎完全混合。

圖3 微混合腔內(nèi)自然對流混合和振動混合圖片對比

因為試驗條件有限，圖片中會顯示出設備棱角、反光和有制造瑕疵的地方，這些原因造成的色差會給混合效率的計算帶來背景性誤差。因此，讀取測量區(qū)域圖片的RGB值后，應去除上述具有瑕疵的像素點后，再進行混合效率的計算，以減小計算誤差。利用式(1)至式(6)計算混合效率，為了減少計算量，在CCD數(shù)字圖像中每隔5個像素點提取一個像素點進行混合效率計算。如圖4所示，計算得到自然對流混合條件下，25 min時試劑總體混合效率為68.75%，在上述振動混合試驗條件下，5 s時試劑總體混合效率為94%，從量化的混合效率對比結果看出，振動混合器在5 s時的混合效率高于自然對流條件下25 min時的混合效率。

圖4 微混合腔內(nèi)試劑自然對流混合和振動混合量化結果比較

與目前通常用來測定微混合器混合效果方法——PH檢測法、熒光粒子示綜法和染色對比法相比，基于數(shù)字圖像的混合效率量化分析方法簡單直接，僅需要根據(jù)混合過程中圖片的顏色變化即可判斷密閉微混合腔內(nèi)流體流動及混合情況，進而評定微混合芯片性能的優(yōu)劣。

4 結論

設計了一種結構簡單、封裝容易的PDMS氣動微混合芯片，給出了基于RGB色彩模型的混合效率量化分析方法，對微混合腔內(nèi)藍、黃試劑充分混合，并與自然對流混合效率進行對比。研究結果表明，基于數(shù)字圖像的混合效率量化分析方法簡單有效、方便可行，且該PDMS氣動微混合芯片能夠滿足大多數(shù)需要混合應用場合的需求。相對現(xiàn)有的微混合芯片，該設計結構簡單且易于實現(xiàn)，為未來微流控試劑混合技術提供了研究基礎。此外，由于基于圖像的混合效率量化分析方法僅與圖像像素的RGB值和相鄰兩點之間的灰度差有關系，因此該方法不僅適用于兩種不同顏色試劑混合，也適用于多種顏色試劑混合。

可通過流體仿真軟件進一步研究微混合腔的質量流動特性，通過研究其質量流動特性來獲得合適的驅動空氣壓力和驅動頻率和優(yōu)化PDMS薄膜厚度和微混合腔的深度，進一步提高混合芯片上不同試劑的混合效率。