李軍紅，趙朋月，魏素姣，王 芳

(鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院：1.病理科；2.生殖醫(yī)學(xué)科，河南 洛陽 471000)

慢性子宮內(nèi)膜炎(CE)是指子宮內(nèi)膜的慢性炎癥，以子宮內(nèi)膜間質(zhì)中漿細(xì)胞浸潤為特征[1]。在不孕癥患者中的發(fā)生率可高達(dá)57%[2]。不孕癥患者合并CE的臨床癥狀輕微或無癥狀，確診主要依賴組織病理學(xué)核查，診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”為子宮內(nèi)膜間質(zhì)中查見漿細(xì)胞[3]。傳統(tǒng)蘇木素-伊紅(HE)染色法對(duì)漿細(xì)胞的分辨困難，容易造成CE的漏診，從而導(dǎo)致不孕癥患者反復(fù)植入失敗和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。本研究通過比較HE和免疫組織化學(xué)(免疫組化)多發(fā)性骨髓瘤致癌蛋白1(MUM1)/多配體蛋白聚糖-1(CD138)雙染2種方法在不孕癥合并CE中的診斷價(jià)值，以及漿細(xì)胞計(jì)數(shù)與妊娠結(jié)局的關(guān)系，以期為臨床診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 選取2019年1-12月因不孕癥在本院行宮腔鏡子宮內(nèi)膜診刮術(shù)的活檢標(biāo)本567份作為研究對(duì)象。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過。

1.1.2儀器與試劑 所用單克隆抗體CD138(MI15)、MUM1(MUM1p)均為即用型工作液，均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。顯色系統(tǒng)分別為Ultra View Universal AP Red及Ultra View Universal DAB，均購于羅氏公司。儀器為羅氏全自動(dòng)免疫組化染色儀(Benchmark ULTRA)。

1.1.3納入標(biāo)準(zhǔn) (1)已婚，月經(jīng)周期規(guī)律,診斷為原發(fā)或繼發(fā)不孕癥；(2)有規(guī)律性生活；(3)未接受過輔助生殖助孕技術(shù)助孕；(4)術(shù)前簽署本研究知情同意書。

1.1.4排除標(biāo)準(zhǔn) (1)合并其他宮腔畸形及腫瘤性病變；(2)女性激素異常；(3)男方弱精、少精或無精。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集與制作 所有患者均在月經(jīng)結(jié)束后3～7 d行宮腔鏡檢查及子宮內(nèi)膜活檢術(shù)。標(biāo)本取檢后立即置入4%中性福爾馬林固定6～24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE和免疫組化MUM1/CD138雙染。

1.2.2判讀標(biāo)準(zhǔn) 分別由2名高年資病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲判讀，有分歧的病例在多頭顯微鏡下共同商量確定。

1.2.2.1HE染色判讀標(biāo)準(zhǔn) 子宮內(nèi)膜間質(zhì)中出現(xiàn)核呈偏心性、染色質(zhì)呈車輪狀或鐘面狀等典型漿細(xì)胞特征的細(xì)胞判讀為陽性，無典型漿細(xì)胞出現(xiàn)判讀為陰性。

1.2.2.2免疫組化MUM1/CD138雙染判讀標(biāo)準(zhǔn) 以MUM1細(xì)胞核出現(xiàn)棕褐色、CD138細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)紅色，且著色在同一個(gè)細(xì)胞上判讀為陽性，不著色、僅細(xì)胞質(zhì)著紅色或僅胞核著棕褐色均判為陰性。

1.2.3漿細(xì)胞計(jì)數(shù) 計(jì)數(shù)20個(gè)高倍鏡(HPF)下陽性漿細(xì)胞數(shù)(個(gè)/20 HPF)，子宮內(nèi)膜息肉視野中的漿細(xì)胞不納入計(jì)數(shù)范圍。

1.2.4治療、妊娠情況及分組 對(duì)病理檢查診斷為CE的患者進(jìn)行1個(gè)療程的一線藥物治療(多西環(huán)素，每天2次，每次口服100 mg，連續(xù)治療14 d)。選取其中行人工輔助生殖技術(shù)并獲得隨訪妊娠結(jié)局的患者278例(術(shù)后通過門診或電話隨訪3～15個(gè)月)，根據(jù)妊娠結(jié)局分為妊娠組(183例)和非妊娠組(95例)。

1.2.5觀察指標(biāo) 比較HE和免疫組化MUM1/CD138雙染2種方法診斷CE的差異和2組患者漿細(xì)胞計(jì)數(shù)的差異。

2 結(jié) 果

2.1HE染色及免疫組化MUM1/CD138雙染判讀結(jié)果 見圖1、2。

箭頭處指陽性漿細(xì)胞。

箭頭處指陽性漿細(xì)胞。

2.2HE染色和MUM1/CD138雙染對(duì)CE的診斷率比較 567份標(biāo)本中HE染色診斷CE 217例(診斷率為38.3%)，MUM1/CD138雙染診斷CE 354例(診斷率62.4%)，MUM1/CD138雙染診斷率明顯高于HE染色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=186.368，P=0.001)。見表1。

表1 HE染色和MUM1/CD138雙染診斷CE結(jié)果比較(n)

2.3妊娠組與非妊娠組患者漿細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 278例患者中妊娠183例(65.8%)，MUM1/CD138雙染漿細(xì)胞計(jì)數(shù)為6(1，30)個(gè)/20 HPF；278例患者中非妊娠95例(34.2%)，MUM1/CD138雙染漿細(xì)胞計(jì)數(shù)為0(0，5)個(gè)/20 HPF，妊娠組患者M(jìn)UM1/CD138雙染漿細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于非妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

與非妊娠組比較，aP<0.05。

3 討 論

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，CE與不孕癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和反復(fù)種植失敗密切相關(guān)，因此，在生殖臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域備受重視。CE引起的子宮內(nèi)膜的持續(xù)性慢性炎癥狀態(tài)可導(dǎo)致局部免疫微環(huán)境紊亂、免疫調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞黏附因子、炎癥因子及趨化因子等失調(diào)，最終導(dǎo)致胚胎種植失敗。目前認(rèn)為，CE最主要致病因素為宮腔微生物感染，針對(duì)病因使用抗菌藥物治療可明顯改善患者生殖預(yù)后[2-5]。由于CE的臨床癥狀輕微且無特異性，因此對(duì)CE的診斷幫助不大[6-7]。CE的病理形態(tài)學(xué)特征為黏膜表層水腫樣改變、間質(zhì)細(xì)胞密度增加、腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)中成纖維細(xì)胞成熟分離和內(nèi)膜間質(zhì)中漿細(xì)胞浸潤[3]。100多年前HITSCHMAN等[1]提出將子宮內(nèi)膜間質(zhì)中出現(xiàn)漿細(xì)胞作為病理檢查診斷CE的“金標(biāo)準(zhǔn)”，至今幾乎所有CE相關(guān)的研究均沿用了此標(biāo)準(zhǔn)。其分子生物學(xué)證據(jù)為子宮內(nèi)膜中存在許多免疫調(diào)控細(xì)胞，但攜帶抗原體的淋巴細(xì)胞卻很少在子宮內(nèi)膜的功能層中出現(xiàn)，然而在CE患者的子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞可浸潤內(nèi)膜的基底層和功能層，可能的原因是微生物激發(fā)了內(nèi)膜的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)了B淋巴細(xì)胞的遷移，進(jìn)而B淋巴細(xì)胞受影響分化成了子宮內(nèi)膜間質(zhì)中的漿細(xì)胞[1]，因此，漿細(xì)胞的識(shí)別成為CE診斷的關(guān)鍵。傳統(tǒng)HE染色對(duì)漿細(xì)胞的識(shí)別較困難，且存在與子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞或單核細(xì)胞難以區(qū)分的情況，常導(dǎo)致診斷不足。如何在不孕癥患者子宮內(nèi)膜診刮標(biāo)本中更精準(zhǔn)地識(shí)別漿細(xì)胞、提高CE的診斷率，并在此基礎(chǔ)上有針對(duì)性地進(jìn)行規(guī)范化抗感染治療提高患者受孕成功率是臨床和病理醫(yī)師面臨的共同挑戰(zhàn)。

CD38、CD138、MUM1均是目前病理檢查診斷中常用的識(shí)別漿細(xì)胞的抗體。CD38是轉(zhuǎn)膜糖蛋白中的Ⅱ型，在活化的B淋巴細(xì)胞、前B淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、漿細(xì)胞中均有表達(dá)。CD138是漿細(xì)胞最特異的指標(biāo),大約95%石蠟切片中漿細(xì)胞膜表面均有CD138表達(dá)[8-9]，同時(shí)，也會(huì)在前B淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá)。MUM1也稱為干擾素調(diào)節(jié)因子4，是由人類6號(hào)染色體上的干擾素調(diào)節(jié)因子4基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，主要表達(dá)在漿細(xì)胞、活化的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。國內(nèi)有研究表明，CD38和CD138在CE的診斷中具有重要價(jià)值[10-12]。在實(shí)際工作中單獨(dú)使用CD38或CD138會(huì)造成一定程度的假陽性，MUM1作為識(shí)別子宮內(nèi)膜中漿細(xì)胞的標(biāo)志物具有比CD138更高的靈敏度[8]，單獨(dú)使用也存在假陽性的問題。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，免疫組化CD38、CD138聯(lián)合使用有助于提高漿細(xì)胞的識(shí)別準(zhǔn)確率[13]，但需在2張免疫組化切片上對(duì)同一靶細(xì)胞進(jìn)行判讀，不僅受細(xì)胞定位偏差及切片切面變化影響，而且非常耗時(shí)。

為更準(zhǔn)確地識(shí)別漿細(xì)胞，本研究引入了免疫組化MUM1/CD138雙染技術(shù)。該技術(shù)是一種先進(jìn)的免疫組化染色方法，以不同的酶系統(tǒng)催化不同顯色底物呈現(xiàn)不同顏色，從而在同一切片上同時(shí)顯示2種不同的抗原表達(dá)[14]。該方法在宮頸病變及腫瘤脈管侵犯的診斷中應(yīng)用較廣泛，且取得了滿意的效果[15-16]。

MUM1/CD138雙染是專門為診斷CE設(shè)計(jì)的抗體組合，只有靶細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)同時(shí)表達(dá)MUM1和CD138 2種抗體才能作為識(shí)別漿細(xì)胞的可靠證據(jù)。這種雙染技術(shù)定位準(zhǔn)確，使?jié){細(xì)胞的識(shí)別更加清晰，且比單獨(dú)使用單一抗體具有更好的特異性。本研究結(jié)果顯示，MUM1/CD138雙染判讀CE的診斷率(62.4%)明顯高于HE染色(38.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提高了子宮內(nèi)膜炎的檢出率，與鄭捷等[17]采用的MUM1/CD38雙染技術(shù)比較，MUM1/CD138雙染對(duì)漿細(xì)胞的識(shí)別特異性更強(qiáng)。

由于MUMI/CD138雙染對(duì)漿細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行了雙重標(biāo)記，定位準(zhǔn)確、清晰，極大地提高了漿細(xì)胞判讀的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，不僅有利于判讀，而且便于計(jì)數(shù)，為進(jìn)一步研究漿細(xì)胞計(jì)數(shù)在CE診治中的半定量分析奠定了基礎(chǔ)。陳玉清等[18]研究表明，在未經(jīng)抗感染治療接受輔助生殖技術(shù)的患者中非CE組術(shù)后1年內(nèi)累積妊娠率明顯高于CE組，表明CE很可能是不孕患者的病因之一。梁榮麗等[13]研究表明，對(duì)CE陽性組和CE可疑組患者干預(yù)治療后陽性組患者妊娠率高于可疑組，與本研究結(jié)果有類似之處，顯示有針對(duì)性地抗感染治療能改善子宮內(nèi)膜的炎癥狀態(tài)，從而提高CE陽性患者妊娠率。

本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，診刮子宮內(nèi)膜標(biāo)本中漿細(xì)胞數(shù)與妊娠結(jié)局相關(guān)，妊娠組患者漿細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于非妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。推測(cè)可能的原因?yàn)闈{細(xì)胞計(jì)數(shù)高的CE患者對(duì)一線藥物治療更敏感，經(jīng)規(guī)范抗感染治療能顯著改善其生殖預(yù)后[3]；按查見漿細(xì)胞大于或等于1個(gè)/20 HPF診斷為CE的患者中部分患者漿細(xì)胞計(jì)數(shù)偏低(<5個(gè)/20 HPF)，推測(cè)其不孕原因可能并非主要為炎癥所致，故而一線抗感染治療不能明顯改善其生殖預(yù)后，其不孕原因可能與非CE患者類似，另有其他因素。根據(jù)本研究結(jié)果，推薦漿細(xì)胞大于或等于5個(gè)/20 HPF作為一線抗感染治療的截?cái)嘀?，避免漿細(xì)胞計(jì)數(shù)偏低的CE患者過度治療。

本研究尚有需完善之處：(1)本研究樣本量不大，尚有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。(2)漿細(xì)胞數(shù)在不孕癥合并CE的診斷中尚未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[10,18-19],加之輔助生殖技術(shù)成本較高，為避免患者因炎癥因素未規(guī)范治療導(dǎo)致助孕失敗，本研究定義CE的標(biāo)準(zhǔn)為查見漿細(xì)胞大于或等于1個(gè)/20 HPF，相較于部分文獻(xiàn)[3，10，20]采用漿細(xì)胞大于或等于5個(gè)/20 HPF的標(biāo)準(zhǔn)更加寬松。(3)本組定義為CE的患者在給予輔助生育技術(shù)前均進(jìn)行了1個(gè)療程的一線藥物治療，抗感染治療后未再次進(jìn)行子宮內(nèi)膜活檢對(duì)比漿細(xì)胞計(jì)數(shù)情況。(4)本研究發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞計(jì)數(shù)需排除宮腔鏡可見的典型息肉樣病變，僅在非息肉區(qū)域的子宮內(nèi)膜組織中進(jìn)行計(jì)數(shù)。有研究表明，部分子宮內(nèi)膜息肉中漿細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高，但其影響不孕的原因可能與息肉導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜不規(guī)則出血、機(jī)械性阻止精子通過、免疫因素抑制精子穿過透明帶等有關(guān)[21]，慢性炎癥并非其關(guān)鍵因素，息肉摘除是其首選治療方案[22]。

綜上所述，免疫組化MUM1/CD38雙染識(shí)別漿細(xì)胞定位準(zhǔn)確、清晰，可作為診斷不孕癥合并CE的可靠依據(jù)，能顯著提高不孕癥合并CE的診斷率；漿細(xì)胞計(jì)數(shù)高的患者不孕原因與子宮內(nèi)膜炎癥的關(guān)系更大，對(duì)漿細(xì)胞大于或等于5個(gè)/20 HPF的CE患者進(jìn)行一線抗感染治療能有效改善其生殖預(yù)后，但更深機(jī)制及量化關(guān)系尚有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。