程兆瑞，程小平孫誠(chéng)誼，喻 超

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)a.研究生院; b.附屬醫(yī)院肝膽外科，貴陽(yáng) 550000； 2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南昌 330006)

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上最常見(jiàn)的癌癥之一，在全球癌癥相關(guān)死亡原因中排名第三[1-2]。目前,已知的HCC主要致病因素包括病毒性肝炎、攝入黃曲霉素等有毒物質(zhì)、非酒精性脂肪性肝炎和酒精相關(guān)性肝病等[3-4]。然而，多數(shù)HCC患者確診時(shí)已是晚期，預(yù)后往往不佳。因此，尋找一個(gè)有效的生物學(xué)標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)是一項(xiàng)緊迫且意義重大的任務(wù)。microRNA(miRNA)是指序列長(zhǎng)度為22～25個(gè)堿基的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)mRNA降解或抑制其翻譯[4-5]。miRNAs的失調(diào)常見(jiàn)于多種人類惡性腫瘤，有研究[6-7]發(fā)現(xiàn)miRNAs在細(xì)胞凋亡、增殖、分化等生理過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。因此，miRNA已被公認(rèn)為是HCC診斷與治療中很有前景的治療和預(yù)后生物標(biāo)志物。最新研究[8]發(fā)現(xiàn)miR-4746-5p是一種新型的癌癥相關(guān)微小RNA，在多種癌癥中異常表達(dá)，其表達(dá)水平可用于預(yù)測(cè)患者存活率。雖然已有研究[9]報(bào)道m(xù)iR-4746-5p在肝癌中顯著上調(diào)且與肝癌患者不佳預(yù)后相關(guān)，但未見(jiàn)有探討miR-4746-5p表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征關(guān)系的獨(dú)立研究。本研究基于癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)探索miR-4746-5p在肝癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征、免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性，以期為miR-4746-5p在HCC診療及預(yù)后預(yù)測(cè)中的應(yīng)用提供新的線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cancergenome.nih.gov/)下載HCC患者的臨床信息和miR-4746-5p的表達(dá)數(shù)據(jù)，用R軟件(v3.6.3)處理并整合數(shù)據(jù)，剔除生存隨訪數(shù)據(jù)不全和miR-4746-5p表達(dá)缺失的病例樣本。共獲得375例肝癌和50例癌旁肝組織的數(shù)據(jù)。將375例肝癌以miR-4746-5p表達(dá)量的中位數(shù)為界，分為高表達(dá)組(n=188)和低表達(dá)組(n=187)。

1.2 生物信息學(xué)分析

mirDIP(http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp#r)綜合了15個(gè)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[10]，可用于預(yù)測(cè)miR-4746-5p的潛在靶基因。從GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)網(wǎng)站下載HCC的差異表達(dá)基因?；虮倔w(GO)功能、京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)均基于R軟件以“FDR<0.2和P<0.05”為閾值，用“cluster Profiler”包進(jìn)行富集分析，用“ggplot2”包進(jìn)行可視化。利用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析miR-4746-5p的潛在靶基因在HCC中的預(yù)后價(jià)值。

1.3 通過(guò)ssGSEA分析免疫細(xì)胞特征

HCC免疫浸潤(rùn)水平通過(guò)單樣本基因集富集分析(ssGSEA)和R軟件中的GSVA包進(jìn)行分析。首先對(duì)腫瘤樣本中的24種免疫細(xì)胞進(jìn)行GSEA分析，然后根據(jù)各種免疫細(xì)胞的特征基因，從每個(gè)腫瘤樣本的基因表達(dá)譜中量化每種免疫細(xì)胞的相對(duì)富集分?jǐn)?shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R語(yǔ)言edgeR軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。miR-4746-5p在肝癌組織與癌旁組織的表達(dá)差異比較，如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)比較；如數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則采用Wilcoxom秩和檢驗(yàn)。ROC曲線采用“pROC”包生成。miR-4746-5p表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用Logistic回歸分析。采用Cox單因素、多因素回歸分析和Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。采用Spearman相關(guān)性分析miR-4746-5p與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性以及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平與miR-4746-5p不同表達(dá)的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織miR-4746-5p的表達(dá)差異

通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，miR-4746-5p在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肝組織(P<0.01，圖1A)及配對(duì)癌旁組織(P<0.01，圖1B)；T3/T4期肝癌患者miR-4746-5p表達(dá)水平較T1/T2期患者明顯增高(均P<0.05，圖1C)，Ⅲ/Ⅳ期(TNM分期)肝癌患者miR-4746-5p表達(dá)水平較Ⅰ/Ⅱ期患者明顯增高(P<0.05，圖1D)，組織學(xué)水平G3/G4級(jí)肝癌患者較G1/G2級(jí)患者明顯增高(P<0.05，圖1E)。miR-4746-5p在肝癌ROC曲線下面積為0.891(圖1F)。

圖1 miR-4746-5p在肝癌組織中的表達(dá)差異及ROC曲線

2.2 miR-4746-5p表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

miR-4746-5p表達(dá)水平與TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、年齡、甲胎蛋白水平、是否伴血管侵犯及T分期顯著相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 miR-4746-5p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 miR-4746-5p表達(dá)水平與肝癌患者不良預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier分析顯示，高表達(dá)組總生存期和疾病特異生存時(shí)間較低表達(dá)組明顯縮短(P=0.018、0.016,圖2A—B)。單因素Cox分析顯示，T分期、M分期、TNM分期及miR-4746-5p表達(dá)水平是影響肝癌患者總生存率的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，進(jìn)一步多因素Cox分析顯示，TNM分期和miR-4746-5p表達(dá)水平是影響肝癌患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01)，見(jiàn)表2。

圖2 miR-4746-5p表達(dá)與肝癌患者不良預(yù)后的關(guān)系

表2 肝癌預(yù)后影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析

2.4 miR-4746-5p靶基因富集分析

通過(guò)miRDIP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，可找到miR-4746-5p的潛在靶基因共821個(gè)，利用GO/KEGG對(duì)821個(gè)靶基因進(jìn)行GO/KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)：生物過(guò)程類(BP)靶基因主要富集的條目是“正調(diào)節(jié)分化相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)”“小GTP酶結(jié)合活性”“軸突部的組成”(圖3A)；靶基因主要富集的信號(hào)通路是MAPK信號(hào)通路、軸突引導(dǎo)信號(hào)通路、自噬信號(hào)通路等(圖3B)。

圖3 miR-4746-5p靶基因的富集分析

2.5 miR-4746-5p表達(dá)與HCC免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析顯示，miR-4746-5p表達(dá)與癌組織中性粒細(xì)胞(Neutrophils)、NK細(xì)胞(NK cells)、巨噬細(xì)胞(Macrophages)、CD8 T細(xì)胞(CD8 T cells)等免疫細(xì)胞的豐度呈負(fù)相關(guān)，而與Th2細(xì)胞(Th2 cells)、輔助性T細(xì)胞(T helper cells)、濾泡性輔助T細(xì)胞(TFH)、樹(shù)突狀細(xì)胞(aDC)等的豐度呈正相關(guān)(圖4A)；miR-4746-5p表達(dá)水平與 Th2 細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.546、P<0.001，圖4B)。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果也同樣顯示，miR-4746-5p高表達(dá)組中Th2細(xì)胞的富集評(píng)分較低表達(dá)組顯著升高(圖4B)。

圖4 miR-4746-5p表達(dá)與HCC免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系

2.6 miR-4746-5p靶基因的表達(dá)水平及其預(yù)后分析

首先使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒定肝細(xì)胞癌樣本和正常樣本之間的差異表達(dá)基因(篩選條件：|Log2FC|臨界值=1，P臨界值=0.01)，共篩選出了2207個(gè)差異表達(dá)基因(圖5A)。并對(duì)HCC的差異基因和miR-4746-5p的下游靶基因進(jìn)行綜合分析后，交集出67個(gè)差異靶基因，其中22個(gè)基因在HCC中下調(diào)(圖5B)，進(jìn)一步通過(guò)Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站評(píng)估這22個(gè)下調(diào)基因在HCC預(yù)后中的作用(以P<0.05作為篩選條件)，結(jié)果顯示，ASPG、CXCL12、IGF2、c11orf96、SEC31B 5個(gè)基因的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5C)。

圖5 miR-4746-5p靶基因表達(dá)水平及其預(yù)后生存率分析

圖5(續(xù))

3 討論

盡管關(guān)于HCC的靶向藥物開(kāi)發(fā)和臨床綜合治療的研究不斷取得新進(jìn)展，但仍有很大一部分肝癌患者因疾病發(fā)展到晚期才得到診斷，導(dǎo)致預(yù)后不佳而死亡。因此，迫切需要尋找一個(gè)新的生物標(biāo)志物來(lái)幫助患者確診，改善預(yù)后[11]。近年來(lái)，隨著大數(shù)據(jù)發(fā)展和高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)收集并公開(kāi)共享了大量各種癌癥患者的原始數(shù)據(jù)，供研究人員進(jìn)行各種生物信息學(xué)研究，為腫瘤的診斷和治療提供重要的生物標(biāo)志物[12]。最近研究[8，13-15]發(fā)現(xiàn)miR-4746-5p作為一種新型的促癌因子，在頭頸鱗癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤中顯著上調(diào)，并且與患者不良預(yù)后相關(guān)。ZHANG等[13]研究報(bào)道m(xù)iR-4746-5p在頭頸部鱗癌中過(guò)表達(dá)，并通過(guò)EMT相關(guān)通路參與HPV16陽(yáng)性頭頸癌的進(jìn)展，影響患者預(yù)后。KUMARAN等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-4746-5p在乳腺癌組織中特異性表達(dá)。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)：miR-4746-5p在肝癌中的表達(dá)顯著高于正常肝組織及配對(duì)的癌旁組織；并且miR-4746-5p在HCC中的高表達(dá)與晚期臨床病理特征(年齡、病理分期、組織學(xué)類型、血管侵犯、AFP水平)和短生存期有關(guān)；ROC特異性分析也表明miR-4746-5p對(duì)HCC具有較高的診斷價(jià)值，這些結(jié)果都提示miR-4746-5p可能是HCC的潛在分子靶標(biāo)。為了進(jìn)一步探究miR-4746-5p的生物學(xué)功能及作用機(jī)制，本文利用miRDIP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-4746-5p進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)，共獲得821個(gè)潛在靶基因，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行GO功能注釋及KEGG富集分析。結(jié)果顯示其靶基因參與的主要生物學(xué)過(guò)程有：正調(diào)節(jié)分化相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)、小GTP酶結(jié)合活性和軸突部的組成；且主要富集于MAPK信號(hào)通路、軸突引導(dǎo)信號(hào)通路、自噬信號(hào)通路等通路來(lái)參與肝癌的惡性發(fā)展。本研究還利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)下載了HCC中2207個(gè)顯著差異基因并與下游靶基因交集后得到67個(gè)基因，其中22個(gè)基因在肝癌中呈低表達(dá)，進(jìn)一步利用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析并篩選出與肝癌患者預(yù)后相關(guān)的5個(gè)基因(ASPG、CXCL12、IGF2、C11orf96、SEC31B)。BELVISO等[16]研究發(fā)現(xiàn)ASPG能夠顯著誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡從而抑制白血病的發(fā)展，是一種有前途的抗癌靶標(biāo)。KHARE等[17]發(fā)現(xiàn)CXCL12可與CXCR4參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移。本文結(jié)果提示miR-4746-5p可能通過(guò)調(diào)控ASPG/CXCL12/IGF2/C11orf96/SEC31B軸來(lái)促進(jìn)HCC的發(fā)生與發(fā)展并導(dǎo)致患者不良預(yù)后。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-4746-5p表達(dá)水平與HCC中多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平相關(guān)：與Th2細(xì)胞和aDC的浸潤(rùn)水平之間存在中到強(qiáng)的正相關(guān)；與TFH細(xì)胞、輔助型T細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈顯著正相關(guān),但與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)。有研究[18]表明Th1/Th2平衡的異常變化與多種腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)，過(guò)高水平的Th2細(xì)胞是引起肝癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要危險(xiǎn)因素[19]。因此miR-4746-5p可能通過(guò)改變免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平來(lái)促進(jìn)HCC的惡性發(fā)展，提示miR-4746-5p或是HCC的潛在治療靶點(diǎn)。但是，本研究?jī)H進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，未進(jìn)行臨床樣本收集及細(xì)胞水平驗(yàn)證，后續(xù)計(jì)劃將在肝癌細(xì)胞系中進(jìn)行關(guān)于miR-4746-5p生物學(xué)功能及機(jī)制的研究。