晏 陽，鄧勇志

(山西醫(yī)科大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院心臟大血管外科，太原 030024)

心臟肥大是指在心臟前負(fù)荷或者后負(fù)荷增加的情況下，為了維持心臟對于外周器官的灌注量，以滿足其正?；驊?yīng)激條件下需求而導(dǎo)致的心肌細(xì)胞數(shù)量不變但心臟體積增加。

有證據(jù)[1-4]表明，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)與微小RNA(microRNA,miRNA)均與心臟肥大高度相關(guān)。ZHU等[3]指出lncRNA-MIAT可增強(qiáng)miR-150的表達(dá)，影響心肌細(xì)胞的病理發(fā)育，從而促進(jìn)心肌肥大的發(fā)生與發(fā)展；也有研究[4]證明，miR-20b通過抑制磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)的表達(dá)并間接增強(qiáng)蛋白激酶AKT的活性來誘導(dǎo)心臟肥大，而CHAR的過度表達(dá)可導(dǎo)致miR-20b的下調(diào)，提示lncRNA CHAR通過海綿樣作用吸收miR-20b，調(diào)節(jié)miR-20b-PTEN-AKT信號傳導(dǎo)途徑減輕心肌肥大。這些研究表明lncRNA可能通過調(diào)節(jié)miRNA進(jìn)而在心臟肥大的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。另有證據(jù)[5-6]表明lncRNA-miRNA-mRNA競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與乳腺癌、肝癌、骨肉瘤的發(fā)生呈高度相關(guān)性，但關(guān)于心臟肥大的類似研究相對較少。本研究采用生物信息學(xué)方法分析心臟肥大的相關(guān)差異表達(dá)基因，并構(gòu)建lncRNA、miRNA、mRNA之間的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，旨在為心臟肥大的發(fā)病機(jī)制及潛在治療靶點的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)

GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)代表了目前最大的微陣列數(shù)據(jù)公共存儲庫。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中檢索與心臟肥大相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)，并下載符合要求(包含心臟肥大患者及健康對照的芯片數(shù)據(jù))的基因表達(dá)譜GSE60291(平臺GPL570，Affymetrix人類基因組U133 Plus 2.0陣列)，共包含6份心肌樣本，其中3份心臟肥大患者心肌樣本及3份正常心肌樣本。所有數(shù)據(jù)均以原始狀態(tài)獲得，并使用Perl(版本5.32.3)和R軟件(版本：4.0.2)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 數(shù)據(jù)處理

1.2.1 差異表達(dá)基因的篩選

在GEO數(shù)據(jù)庫中下載原始數(shù)據(jù)，將探針I(yè)D轉(zhuǎn)移到基因符號或mRNA名稱。將下載好的數(shù)據(jù)按照R語言包分為實驗組與對照組，將其用于篩選肥大心臟心肌細(xì)胞與正常組織之間差異表達(dá)的mRNA。同時計算對數(shù)倍數(shù)變化(logFC)，P值與校正P值，然后將P<0.05和|logFC|>0.5設(shè)置為差異表達(dá)mRNA的納入標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得差異表達(dá)基因并繪制其熱圖。

1.2.2 lncRNA結(jié)合的miRNA

在lncRNADisease數(shù)據(jù)庫2.0(http://www.rnanut.net/lncrnadisease/)中搜索[7]，檢索詞為“cardiomegaly”，得到與心臟肥大相關(guān)的lncRNA，并進(jìn)一步篩選已知其全部長度及序列的lncRNA，包括SLC26A4 antisense RNA(ENSG00000233705)、Pvt1 oncogene(ENSG00000249859)、MAGL1 intronic transcript 1(ENSG00000272610)、CCDC144NL antisense RNA(ENSG00000233098)、BACE1 antisense RNA(ENSG00000278768)、ATXN8 opposite strand(ENSG00000230223)。通過Starbase數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)篩選出6個lncRNA對應(yīng)的miRNA，以構(gòu)建心臟肥大相關(guān)的lncRNA ceRNA網(wǎng)絡(luò)，研究心臟肥大可能的發(fā)病機(jī)制。

1.2.3 預(yù)測與心臟肥大有關(guān)的miRNA的下游靶基因

將預(yù)測到的與lncRNA結(jié)合的miRNA，通過miRNet(https://www.mirnet.ca/)預(yù)測miRNA對應(yīng)的靶點基因與從芯片GSE60291中篩選的差異基因取交集，以得到的交集mRNA構(gòu)建相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)并對取得的mRNA進(jìn)行基因本體論(Gene ontology，GO)功能分析與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路分析。分子功能、生物過程、細(xì)胞成分的mRNA通過使用org.Hs.eg.db、ggplot2、cIusterProfiIer等軟件包，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行GO與KEGG信號通路分析。

1.2.4 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape軟件(版本3.7.1)分別構(gòu)建lncRNA-miRNA以及miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，在此基礎(chǔ)上用merge功能得到lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，連線代表節(jié)點之間存在著調(diào)控關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)的mRNA

從GEO數(shù)據(jù)庫獲得3份心肌肥大組織樣本與3份正常心肌組織樣本，以|logFC|>0.5且校正后P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共獲得差異mRNA 104個，使用R語言制作差異表達(dá)mRNA的熱圖。見圖1。

C：對照組T：實驗組。1個小格為1個基因，顏色表示基因的表達(dá)水平，紅色表示高表達(dá)，藍(lán)色表示低表達(dá)，顏色越深則表示表達(dá)水平越高。

2.2 與lncRNA結(jié)合的miRNA

在lncRNA數(shù)據(jù)庫中檢索得到6個與心臟肥大相關(guān)的lncRNA，通過Starbase數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)篩選出6個lncRNA對應(yīng)的37個miRNA。將37個miRNA通過miRNet(https://www.mirnet.ca/)預(yù)測miRNA對應(yīng)的mRNA，最終得到16 724個靶基因，將所有靶基因與分析芯片得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行取交集得到共同差異基因86個，使用生物信息學(xué)與進(jìn)化基因組學(xué)網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn/calculate_venn.htpl)繪制韋恩圖(圖2)。使用Cytoscape v3.7.1進(jìn)行l(wèi)ncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中包括差異表達(dá)RNA 86個，miRNA 37個，有調(diào)控關(guān)系的lncRNA 6個。見圖3。

2.3 GO功能和信號通路富集分析

將所篩選出的差異表達(dá)基因分別在分子功能、生物過程、細(xì)胞成分3個方面進(jìn)行分析。根據(jù)GO功能注釋，在細(xì)胞成分方面顯示目標(biāo)基因富集于黏著斑、前突觸、突觸小泡等。見圖4A。生物過程分析結(jié)果表明目標(biāo)基因在肌肉組織發(fā)育、肌肉器官發(fā)育、橫紋肌組織發(fā)育、DNA復(fù)制等過程中富集顯著。見圖4B。而分子功能分析表明目標(biāo)基因在ATP酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面顯著富集。見圖4C。KEGG分析結(jié)果顯示目標(biāo)基因主要在MAPK信號通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、乳腺癌等方面富集顯著。見圖5。

A：細(xì)胞成分；B：生物過程；Count:空集于該功能的miRNA數(shù)目。圖4 靶基因GO富集分析可視化氣泡圖

C：分子功能;Count:空集于該功能的miRNA數(shù)目。圖4(續(xù))

圖5 靶基因KEGG通路富集分析可視化氣泡圖

3 討論

lncRNA構(gòu)成了人類轉(zhuǎn)錄基因組的大部分，在許多細(xì)胞過程如細(xì)胞分化、組織器官發(fā)育、癌癥中均發(fā)揮重要作用[8]。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，競爭性內(nèi)源性RNA即ceRNA與具有共享miRNA反應(yīng)元件(miRNAs responses elements,MRE)的miRNA的mRNA競爭，并通過影響miRNA的可用水平以此充當(dāng)miRNA的調(diào)節(jié)劑，而lncRNA與環(huán)狀RNA則以共同共享的MRE以此充當(dāng)miRNA的“海綿”，抑制正常的miRNA和靶向mRNA的活性。這些MRE共享元件形成轉(zhuǎn)錄后ceRNA以調(diào)節(jié)mRNA表達(dá)。lncRNA可作為ceRNA與miRNA競爭性地結(jié)合，調(diào)節(jié)miRNA的沉默與表達(dá)并在許多生物過程中發(fā)揮作用，如有研究[10]發(fā)現(xiàn)lncRNA-ROR與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)中的核心轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TF)，即Oct4，Sox2和Nanog共有共同的MRE，螯合miR-145降低了miRNA介導(dǎo)的這些轉(zhuǎn)錄因子的阻遏效應(yīng)，提示在典型的ceRNA機(jī)制中，當(dāng)Linc-ROR和核心ESC TF相互交叉調(diào)節(jié)以提高它們的水平時，ceRNA的活性導(dǎo)致了Linc-ROR和核心ESC TF之間的反饋調(diào)節(jié)環(huán)，且這種反饋調(diào)節(jié)回路在ESC中運(yùn)行，以維持多能性。在lncRNA-miRNA-mRNA軸的基礎(chǔ)上，lncRNA可能參與多種病理生理過程，影響心臟疾病的發(fā)生與發(fā)展。CHENG等[11]在探索lncRNA ZEB2-AS1與PTEN對細(xì)胞表面積的調(diào)控作用時，發(fā)現(xiàn)lncRNA ZEB2-AS1可以通過下調(diào)PTEN來刺激心臟肥大。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)lncRNA Gm15834通過自身高表達(dá)來增強(qiáng)心肌細(xì)胞的自噬活性促進(jìn)心肌肥大的發(fā)生，Gm15834還可以作為microRNA(miR)-30b-3p的內(nèi)源性“海綿”RNA，在心肌肥大中被下調(diào)。抑制miR-30b-3p增強(qiáng)了心肌的自噬活性加劇了心肌肥大。這些研究均表明肥厚心肌中的lncRNA及其下游靶基因的表達(dá)譜在心臟肥大的病因與分子機(jī)制中有著重要的作用。

本研究利用lncRNADisease數(shù)據(jù)庫篩選出6個與心臟肥大高度相關(guān)的lncRNA，對其進(jìn)行miRNA及下游靶基因預(yù)測，再與通過GEO數(shù)據(jù)集GSE60291中篩選出的104個差異表達(dá)的基因取交集，共得到86個相同的差異基因。將lncRNA對應(yīng)的miRNA所對應(yīng)的靶基因分別與這86個差異基因取交集，以此成功構(gòu)建出lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨后對這86個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析與KEGG富集分析：靶基因在分子功能、生物過程、細(xì)胞成分3個方面最顯著富集的為ATP酶活性、肌肉組織發(fā)育、前突觸等方面，提示這些富集的基因或蛋白質(zhì)分子在心臟肥大的生物學(xué)過程中扮演著重要的角色。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，靶基因富集到絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、p53信號通路等信號通路富集，提示在研究心臟肥大的發(fā)病機(jī)制與發(fā)展過程中應(yīng)重點關(guān)注這些信號通路。MAPK是協(xié)調(diào)各種生理和病理事件(如癌癥、炎癥、心臟重塑等)的中央信號傳導(dǎo)體，MAPK激活通常是通過膜受體或其它不確定的應(yīng)激感應(yīng)效應(yīng)子來實現(xiàn)的，然后導(dǎo)致高度組織化的順序發(fā)揮作用的蛋白激酶序列激活，這些蛋白激酶既放大信號又介導(dǎo)多種細(xì)胞質(zhì)和核調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化，由此MAPK可廣泛地參與心肌肥厚、心臟重塑、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。最新研究[14]表明miR-326可通過阻斷MAPK信號通路來調(diào)節(jié)心臟肥大的進(jìn)程。BA等[15]發(fā)現(xiàn)大蒜素可以通過激活MAPK/ERK/mTOR信號通路抑制自噬的發(fā)生，從而減輕病理性心肌肥大。另有研究[16]證明大蒜及其代謝產(chǎn)物可通過誘導(dǎo)Na+/K+-ATPase在大鼠心臟中的活性來減輕心肌肥大及心臟重塑，其機(jī)制可能是在低Na+/K+-ATPase水平或活性通過NCX促進(jìn)Ca2+流入，導(dǎo)致Ca2+積累，從而加速心肌壞死、收縮衰竭并引發(fā)心律失常。而鈣超載是Iso誘導(dǎo)的心臟肥大和心力衰竭的機(jī)制之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)lncRNA-miRNA-mRNA在調(diào)節(jié)心臟肥大的過程中，靶基因顯著富集于黏著斑。黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一種廣泛表達(dá)的非受體酪氨酸激酶，可轉(zhuǎn)導(dǎo)整合素，生長和激素因子的信號，是許多基本生物學(xué)過程和功能(包括細(xì)胞黏附，遷移，增殖和存活)的關(guān)鍵參與者。FAK在這一功能范圍內(nèi)的參與支持了它在機(jī)體發(fā)育和疾病的重要方面的作用，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管發(fā)育，癌癥，心臟肥大和組織纖維化[17]。FAK在其非活化、活化和高活性狀態(tài)之間是通過磷酸化來控制切換的。有研究[18]表明S910磷酸化的FAK可暴露埋藏的生長因子受體(growth factor receptor 2,Grb2)相互作用位點而引起病理性心臟肥大。在進(jìn)一步的研究中通過計算機(jī)篩選PM2307被確定為最佳抑制劑，PM2307的結(jié)合親和力優(yōu)于FAT-Grb2復(fù)合物以及先前報道的小分子抑制劑，可以抑制生長因子受體2-局部黏著激酶相互作用，用于治療病理性心肌肥大[19]。這些都提示FAK在心臟肥大的病理機(jī)制中有著重要作用。此外，肥厚心肌差異表達(dá)基因也顯著富集于乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、自噬等多個信號通路，提示心臟肥大可能與這些癌癥的發(fā)病機(jī)制有著共同之處，但具體需進(jìn)一步探討。

綜上，本研究通過分析心臟肥大中的mRNA表達(dá)差異，成功構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可望為研究心臟肥大的發(fā)病機(jī)制提供新的思路和潛在的治療靶點。但本研究納入的樣本數(shù)量較少，這可能導(dǎo)致篩選的lncRNA、miRNA及mRNA出現(xiàn)偏差，在后續(xù)的研究中可提高樣本數(shù)及深入的實驗研究來驗證這些差異表達(dá)基因的作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的效應(yīng)。