蘇 睿，吳文秀，程 青，高志利

(沈陽市第五人民醫(yī)院呼吸內科，沈陽 110023)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的85%，2018年NSCLC新發(fā)病例數(shù)達到1810萬，其中約180萬死亡[2]。目前化療和放療已達到治療平臺期，免疫治療和靶向治療僅對小部分NSCLC患者有效，5年生存率低至18%[3]。因此，迫切需求尋找分子靶點用于肺癌的治療。LncRNA PITPNA-AS1是新近被報道的LncRNA之一，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，并被認為是促癌因子。LncRNA PITPNA-AS1在結直腸癌、肝細胞癌和甲狀腺乳頭狀癌等惡性腫瘤中促進腫瘤的進展，具有作為抗腫瘤治療分子靶標的潛能[4-6]。CHEN等[7]報道LncRNA PITPNA-AS1在NSCLC表達沉默后抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力。本文探討LncRNA PITPNA-AS1調控NSCLC細胞凋亡和自噬相關的作用及機制，為LncRNA PITPNA-AS1作為NSCLC的抗腫瘤治療靶標提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

LncRNA PITPNA-AS1和GAPDH引物購自美國invitrogen公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒均購自武漢春都生物技術有限公司；NSCLC細胞株A549、H1299、H126和正常支氣管上皮細胞16HBE購自中國科學院細胞庫；DMEM-F12、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清、青霉素/鏈霉素混合物購自美國Gibco公司；LncRNA PITPNA-AS1 siRNA購自上海吉瑪基因技術有限公司；CCK8試劑購自南京BestBio公司；細胞凋亡試劑盒和ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白質測定試劑盒購自美國Thermo試劑公司；PVDF膜購于上海GE試劑公司；caspase 3、caspase 9、Bax、Bcl-2、Beclin-1、LC3B、Atg5、p38、ERK、GAPDH和二抗購于英國Abcam公司。

1.2 臨床組織樣本

收集沈陽市第五人民醫(yī)院2018年2月至2020年2月收治的140例NSCLC患者腫瘤組織及其對應的癌旁組織(遠離癌組織5 cm以上的肺組織)手術標本。將手術過程中獲得的新鮮組織儲存于液氮中以供研究。在手術前NSCLC患者均未接受過治療，并由病理專家確診組織學類型。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過，患者均簽署知情同意書。

1.3 qRT-PCR

用Trizol試劑從NSCLC患者腫瘤組織和非腫瘤組織中提取總RNA，并檢測RNA濃度。按照逆轉錄試劑盒說明書，取5 μg總RNA進行逆轉錄cDNA操作。逆轉錄后，取1 μL合成的cDNA進行擴增。擴增系統(tǒng)如下：cDNA 1 μL，上游和下游引物各0.4 μL，2X TransScript?Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，50X Passive Reference染料 0.4 μL，無RNA酶水補充至20 μL。引物序列見表1。PCR反應條件為：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct進行分析。

表1 引物序列

1.4 細胞培養(yǎng)和轉染

NSCLC細胞株A549培養(yǎng)基為DMEM-F12，NSCLC細胞株及正常支氣管上皮細胞16HBE H1299、H226培養(yǎng)基均為RPMI-1640，添加血清濃度均為10%及青霉素/鏈霉素混合物濃度為1%，放置在37 ℃含有5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用qRT-PCR檢測NSCLC和正常支氣管上皮細胞中LncRNA PITPNA-AS1的表達水平。選擇LncRNA PITPNA-AS1高表達的NSCLC細胞以每孔2×105個接種于6孔板內，分為si-NC組和si-LncRNA PITPNA-AS1組。采用Lip 2000轉染試劑分別將對照siRNA和LncRNA PITPNA-AS1 siRNA轉染至對應組的細胞中。轉染48 h后，通過qRT-PCR檢測轉染效率。

1.5 CCK8實驗

通過CCK8實驗檢測細胞增殖。收獲對數(shù)生長期的細胞以每孔2000個細胞接種到96孔板中，分為si-NC組和si-LncRNA PITPNA-AS1組。在培養(yǎng)的第1、2、3、4和5天加入10 μL CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，通過酶標儀在450 nm處測定吸光度值(OD值)。

1.6 流式細胞術

si-NC組和si-LncRNA PITPNA-AS1組細胞采用0.25%胰蛋白酶消化后制成1×106mL-1懸浮液，PBS清洗2次，加入500 μL染色緩沖液重懸，加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI 混勻。懸浮液在室溫下避光孵育5 min，之后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 Western-blot實驗

si-NC組和si-LncRNA PITPNA-AS1組細胞，用冷PBS洗滌細胞并在含有1%磷酸酶抑制劑和1%蛋白酶抑制劑的冷RIPA裂解緩沖液中裂解30 min。蛋白質樣品在4 ℃下以12 000 r·min-1的速度離心30 min。收集上清液用于繼續(xù)分析，用BCA蛋白質測定試劑盒測量蛋白質濃度。蛋白質通過SDS-PAGE分離并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜與不同的一抗在4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗孵育1 h。使用增強的化學發(fā)光(LAS-4000)使免疫印跡可視化。

1.8 ROS檢測

si-NC組和si-LncRNA PITPNA-AS1組細胞采用PBS洗3次后，與含有10 μM濃度DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中孵育1 h進行探針裝載，PBS洗3次后，胰酶消化收集細胞，采用流式細胞儀以前向散射光(FS)和側向散射光(SS)為參數(shù)檢測細胞中活性氧(ROS)的熒光強度。

1.9 統(tǒng)計學方法

所有實驗重復3次，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示。采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA PITPNA-AS1在NSCLC組織和細胞系中的表達

LncRNA PITPNA-AS1在NSCLC組織中的表達為1.38±0.45，顯著高于在癌旁組織中的表達(0.93±0.49)(t=3.353,P=0.001)。LncRNA PITPNA-AS1在NSCLC細胞系A549、H1299、H226中的表達分別為3.24±0.51、4.38±0.63、1.99±0.70，顯著高于在正常支氣管上皮細胞16HBE中的表達(0.81±0.13)(F=24.55,P<0.001)。見圖1。

A：LncRNA PITPNA-AS1在NSCLC組織中的表達，*P<0.05；B：LncRNA PITPNA-AS1在NSCLC細胞系中的表達，*P<0.05與16HBE相比。n=3。

2.2 LncRNA PITPNA-AS1表達與NSCLC患者病理參數(shù)的關系

不同年齡、性別、組織類型、淋巴結轉移的NSCLC患者LncRNA PITPNA-AS1表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；腫瘤大小>3 cm、TNM分期Ⅲ—Ⅳ患者的LncRNA PITPNA-AS1表達量高于腫瘤大小≤3 cm、TNM分期Ⅰ—Ⅱ患者(P<0.05)。見表2。

2.3 LncRNA PITPNA-AS1 siRNA轉染NSCLC細胞效果

LncRNA PITPNA-AS1在si-LncRNA PITPNA-AS1組H1299細胞中的表達(0.34±0.06)顯著低于si-NC組(1.06±0.12)(t=9.295，P<0.001)，見圖2。

表2 LncRNA PITPNA-AS1蛋白在NSCLC組織中的表達與臨床病理參數(shù)之間的關系

*P<0.05與si-NC組相比,n=3。圖2 qRT-PCR檢測LncRNA PITPNA-AS1 siRNA轉染NSCLC細胞效果

2.4 細胞增殖能力檢測

與si-NC組(細胞在第1—5天的OD值分別為0.19±0.01、0.44±0.09、0.70±0.05、0.84±0.07、0.92±0.07)相比，si-LncRNA PITPNA-AS1組(細胞在第1—5天的OD值分別為0.19±0.01、0.34±0.06、0.45±0.05、0.63±0.08、0.69±0.09)NSCLC細胞H1299的增殖能力顯著降低(P<0.05)。見圖3。

時間/d*P<0.05與si-NC組相比，n=3。圖3 CCK8檢測細胞增殖能力

2.5 細胞凋亡檢測

si-NC組和si-LncRNA PITPNA-AS1組H1299細胞凋亡率分別為(5.94±0.72)%和(24.85±3.49)%，與si-NC組相比，si-LncRNA PITPNA-AS1組NSCLC細胞凋亡顯著增加(t=9.191，P<0.001)，見圖4。與si-NC組相比，si-LncRNA PITPNA-AS1組NSCLC細胞促凋亡蛋白caspase 3、caspase 9、Bax表達顯著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著降低(P<0.05)，見圖5。

2.6 細胞自噬檢測

與si-NC組相比，si-LncRNA PITPNA-AS1組NSCLC細胞自噬標志蛋白LC3B、Atg5及促自噬蛋白Beclin-1表達顯著增加(P<0.05)，見圖6。

圖4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

*P<0.05與si-NC組相比，n=3。圖5 Western-blot檢測細胞凋亡

*P<0.05與si-NC組相比，n=3。圖6 Western-blot檢測細胞自噬

2.7 細胞ROS檢測

si-NC組和si-LncRNA PITPNA-AS1組H1299細胞ROS的相對熒光強度分別為(1.05±0.24)%和(3.95±0.76)%，與si-NC組相比，si-LncRNA PITPNA-AS1組NSCLC細胞ROS產(chǎn)生顯著增加(t=6.302，P=0.001)，見圖7。

*P<0.05與si-NC組相比，n=3。圖7 流式細胞儀檢測細胞ROS

2.8 ERK信號通路檢測

與si-NC組相比，si-LncRNA PITPNA-AS1組NSCLC細胞ERK信號通路p-p38、pERK蛋白表達顯著增加(P<0.05)，見圖8。

*P<0.05與si-NC組相比，n=3。圖8 Western-blot檢測ERK信號通路

3 討論

以往的研究[8]揭示了miRNA和lncRNA等非編碼RNA在肺癌發(fā)展中的關鍵作用，特別是對細胞增殖、凋亡和侵襲轉移等腫瘤惡性生物學行為的調節(jié)作用。其中l(wèi)ncRNA被定義為長度超過200個核苷酸的非編碼轉錄物，它可以通過細胞質中的競爭性內源RNA(ceRNA)網(wǎng)絡實現(xiàn)其調節(jié)功能，即通過海綿化miRNA，釋放其下游靶向的mRNA，參與各種生理和病理過程[9]。lncRNA在包括NSCLC在內的人類腫瘤中表達異常[10]。

LncRNA PITPNA-AS1是新近發(fā)現(xiàn)的LncRNA之一，位于染色體17p13.3上，由SUN等[5]首次發(fā)現(xiàn)并報道在癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中。LncRNA PITPNA-AS1在肝細胞肝癌中異位表達，并與患者總生存率、轉移和TNM分期密切相關。REN等[11]通過在線數(shù)據(jù)庫GEPIA分析顯示LncRNA PITPNA-AS1在肺鱗癌標本中高表達，并在肺鱗癌細胞中得到進一步證實。CHEN等[7]通過TCGA數(shù)據(jù)庫表明LncRNA PITPNA-AS1在NSCLC組織中表達增加。本文收集140例NSCLC手術標本，qRT-PCR檢測顯示LncRNA PITPNA-AS1在包括肺鱗癌和肺腺癌的NSCLC組織中表達顯著上調，與CHEN等[7，11]的研究一致。且TNM分期Ⅲ—Ⅳ患者的LncRNA PITPNA-AS1表達量高于TNM分期Ⅰ—Ⅱ患者，表明LncRNA PITPNA-AS1參與NSCLC的惡性進展，同時本研究在NSCLC細胞系中證實LncRNA PITPNA-AS1表達增加，與在NSCLC組織中的表達水平一致。既往研究[7]顯示沉默LncRNA PITPNA-AS1通過靶向miR-32-5p抑制NSCLC細胞增殖、侵襲和轉移能力，提示LncRNA PITPNA-AS1在NSCLC診斷和治療中是一種很有前景的生物標志物。本研究在組織水平發(fā)現(xiàn)腫瘤大小>3 cm患者的LncRNA PITPNA-AS1表達量高于腫瘤大小≤3 cm患者，提示LncRNA PITPNA-AS1與NSCLC細胞增殖相關。本研究發(fā)現(xiàn)沉默NSCLC細胞中LncRNA PITPNA-AS1的表達后，CCK8實驗顯示NSCLC細胞增殖活力降低。但是LncRNA PITPNA-AS1調控NSCLC細胞增殖能力的機制仍未知。

有研究[11]顯示肺鱗癌中LncRNA PITPNA-AS1敲減抑制腫瘤細胞的增殖、遷移能力并促進細胞的凋亡。同時在結直腸癌、甲狀腺乳頭狀癌和宮頸癌中也顯示LncRNA PITPNA-AS1抑制腫瘤細胞的凋亡[4,6,12]。本研究結果也顯示，抑制LncRNA PITPNA-AS1的表達促進NSCLC細胞凋亡，并且促細胞凋亡蛋白[13]caspase 3、caspase 9和Bax表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，表明LncRNA PITPNA-AS1抑制NSCLC細胞凋亡。自噬是降解細胞器、錯誤蛋白或細胞衰老的生理過程，而自噬在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮雙重角色，在腫瘤的早期自噬發(fā)揮抑癌作用，在腫瘤的后期自噬發(fā)揮促癌作用，但其可促進細胞凋亡[14]。有研究[15]顯示在NSCLC中自噬活性降低，自噬促進基因Beclin-1表達降低與患者處于更晚期、淋巴結轉移、腫瘤分化較差相關。本研究顯示抑制LncRNA PITPNA-AS1的表達后，NSCLC細胞中自噬標志蛋白[16]LC3B和Atg5以及自噬促進蛋白Beclin-1表達增加，表明LncRNA PITPNA-AS1抑制NSCLC細胞自噬。ROS/ERK信號通路誘導細胞自噬可作為NSCLC治療的靶標，胞外多糖通過誘導ROS產(chǎn)生，激活P38和ERK蛋白抑制NSCLC細胞增殖[17]，本研究敲減LncRNA PITPNA-AS1的表達后，NSCLC細胞中ROS產(chǎn)生增多，ERK信號通路相關蛋白p-p38、pERK蛋白表達減少，提示干擾LncRNA PITPNA-AS1可能通過抑制ROS/ERK信號通路抑制NSCLC細胞增殖，促進細胞凋亡和自噬。

綜上所述，LncRNA PITPNA-AS1在NSCLC組織和細胞中均高表達。干擾LncRNA PITPNA-AS1的表達抑制NSCLC細胞增殖，促進細胞凋亡和自噬。其作用可能通過調控ROS/ERK信號通路發(fā)揮作用。