何曉麗 江洪 鄧夏

喉癌是常發(fā)于頭頸部的惡性腫瘤之一，其中鱗狀細(xì)胞癌是其最主要的病理類型，可高達(dá)90%以上［1］。近年來隨著人們生活行為習(xí)慣的改變，喉癌的發(fā)病率及死亡率不斷上升，嚴(yán)重危害患者的生命安全。國內(nèi)的流行病學(xué)調(diào)查表明，喉癌的5年生存率不到80%；而美國的研究也顯示，在過去40年里，喉癌的5年生存率已經(jīng)從原來的66%降低至63%［2-3］。因此，針對喉癌患者預(yù)后生存率較差等問題，尋找與其病理特征、預(yù)后相關(guān)的特異性標(biāo)志物已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一，對于喉癌的病情監(jiān)測、預(yù)后評估及靶向治療新靶點(diǎn)的提示等均具有重要的意義。而隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，喉癌預(yù)后評價(jià)的分子生物學(xué)指標(biāo)體系也得到不斷補(bǔ)充和完善。研究表明［4-6］，Sox2、cMyc是多種惡性腫瘤預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)因素，然而目前關(guān)于二者與喉癌的發(fā)生發(fā)展存在何種關(guān)聯(lián)尚不清楚。本研究檢測98 例喉癌組織中SOX2、cMyc的表達(dá)情況，并分析探討二者與喉癌患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年1月至2021年1月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院二鼻咽喉頭頸科收治的98 例經(jīng)病理確診的喉癌患者為研究對象。其中男性55 例，女性43 例；年齡平均（61.84±9.57）歲。分化程度：高分化35 例，中分化36 例，低分化27 例。T 分期：T1+T2 期47 例，T3+T4 期51 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有36 例，無62 例；臨床分型：聲門上型38 例，聲門型54 例，聲門下型6 例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期50 例，Ⅲ+Ⅳ期48 例。以于98 例喉癌患者的腫瘤部位取材的喉癌組織標(biāo)本作為喉癌組，同時(shí)以98 例患者對應(yīng)癌旁正常組織（即距離腫瘤切緣0.5 cm 以上部位）取材標(biāo)本作為癌旁組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①癌組織經(jīng)術(shù)后病理學(xué)診斷均為鱗狀細(xì)胞癌［7］；②均為初次治療且近期未接受放化療或其他治療者；③均有完整的臨床資料及隨訪記錄；④患者或家屬均知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤患者；②伴有重要臟器功能障礙者；③腫瘤已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；④依從性極差或中途退出研究者。本研究已獲得醫(yī)院倫理研究委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑

兔抗人SOX2單克隆抗體，兔抗人CMYC單克隆抗體，免疫組化EnVision 二抗，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組化法檢測Sox2、cMyc的表達(dá)

取石蠟包埋切片，進(jìn)行常規(guī)脫蠟和水化處理，采用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行熱抗原修復(fù)，以3% H2O2溶液于室溫孵育15 min，PBS 洗滌2 次，每次5 min。滴加兔抗人SOX2、CMYC 單克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜，復(fù)溫后再次進(jìn)行3 次PBS洗滌（5 min/次），使用DAKO EnVision 二抗系統(tǒng)室溫孵育30 min。室溫下進(jìn)行DAB 顯色約5 min，蘇木素復(fù)染2 min，采用中性樹膠將沖洗干燥后的切片進(jìn)行封片，鏡檢。以PBS 作為一抗作陰性對照。全部染色切片由2 位工作經(jīng)驗(yàn)≥5年的資深病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲法閱片，獨(dú)立評估免疫組化結(jié)果。免疫組化陽性判定標(biāo)準(zhǔn)［8］：SOX2、CMYC的陽性著色表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或細(xì)胞核中，呈棕黃色或棕褐色細(xì)小顆粒。①著色強(qiáng)度評分：與背景對比，無色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色或黑色為3 分。②陽性細(xì)胞比例評分：隨機(jī)采集10 個(gè)代表性視野，根據(jù)公式“陽性細(xì)胞比例=陽性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞數(shù)×100%”進(jìn)行陽性細(xì)胞比例計(jì)算。以陽性細(xì)胞比例＜5%為0 分，陽性細(xì)胞比例5%～25%為1 分，陽性細(xì)胞比例26%～50%為2 分，陽性細(xì)胞比例51%～75%為3 分，陽性細(xì)胞比例＞75%為4 分。將著色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞比例評分相乘，其乘積總分≤3 分為陰性、＞3 分為陽性。

1.2.3 隨訪

所有患者均通過電話或門診復(fù)診形式隨訪，以患者死亡為終點(diǎn)事件，本研究中末次隨訪截止日期為2021年12月31日，無失訪。隨訪時(shí)間至少1年，生存84 例，死亡14 例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；并以Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析Sox2、cMyc表達(dá)與喉癌預(yù)后的關(guān)系。以Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并以Log-Rank法進(jìn)行組間生存差異檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌和癌旁組織中Sox2、cMyc陽性表達(dá)率比較

喉癌組的Sox2、cMyc陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 喉癌和癌旁組織中Sox2、cMyc 的表達(dá)率比較［n（%）］Table 1 Comparison of Sox2 and cMyc expression in laryngeal carcinoma and adjacent tissues［n（%）］

圖1 喉癌和癌旁組織中Sox2、cMyc 的表達(dá)（SP，×200）Figure 1 Expression of Sox2 and cMyc in laryngeal carcinoma and adjacent tissues（SP，×200）

2.2 Sox2、cMyc 陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

喉癌組織的Sox2、cMyc陽性表達(dá)與T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）；而與年齡、性別、吸煙史、飲酒史、臨床分期、臨床分型、分化程度無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見表2。

表2 Sox2、cMyc 陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Table 2 Correlation between positive expression of Sox2 and cMyc and clinicopathological features［n（%）］

2.3 影響喉癌預(yù)后的單因素分析

本研究喉癌患者的1年生存率為85.71%（84/98）。單因素分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、T 分期、Sox2及cMyc是影響喉癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響喉癌預(yù)后的單因素分析［n（%）］Table 3 Single factor analysis of prognosis of laryngeal cancer［n（%）］

2.4 影響喉癌患者預(yù)后的Cox 回歸分析

以喉癌患者預(yù)后為因變量進(jìn)行Cox多因素回歸分析，結(jié)果顯示，T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Sox2陽性、cMyc陽性為喉癌預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），見表4。Sox2陽性表達(dá)組（80.82%）1年生存率低于陰性表達(dá)組（100.00%），cMyc陽性表達(dá)組（80.28%）1年生存率低于陰性表達(dá)組（100.00%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 影響喉癌患者預(yù)后的Cox 回歸分析Table 4 Cox regression analysis of influence on prognosis of patients with laryngeal cancer

3 討論

喉癌是指起源于喉黏膜的一種頭頸部原發(fā)性腫瘤，惡性程度較高，預(yù)后較差［8］。目前喉癌的治療手段主要有手術(shù)、放化療等，但預(yù)后仍不夠理想［9］。至今臨床上仍未闡明喉癌確切的發(fā)病機(jī)制，但研究已證實(shí)癌基因的復(fù)雜調(diào)控參與惡性腫瘤的進(jìn)展過程，同時(shí)也是誘發(fā)喉癌患者不良預(yù)后的關(guān)鍵因素之一［10］。SOX2基因是一種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，在維持胚胎干細(xì)胞的全能性中扮演著重要角色?，F(xiàn)代研究已將SOX2基因確定為鱗狀細(xì)胞癌癌基因譜，其異常表達(dá)與胰腺癌、乳腺癌、腎癌等多種惡性腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移有關(guān)，但目前關(guān)于其在喉癌中的研究較少［11］。cMyc基因?qū)儆谝环N原癌基因，不僅參與細(xì)胞周期的調(diào)控過程，還可作為轉(zhuǎn)錄蛋白發(fā)揮促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖、分化的雙向調(diào)節(jié)作用。研究表明［12］，cMyc的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴細(xì)胞瘤、肺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但目前cMyc在喉癌的研究鮮見報(bào)道。

本研究結(jié)果提示喉癌患者腫瘤組織中的Sox2、cMyc表達(dá)異常，可能會(huì)促進(jìn)患者腫瘤惡性進(jìn)展，進(jìn)而導(dǎo)致不良預(yù)后。cMyc基因位于染色體8q24，具有雙向調(diào)節(jié)作用，其編碼產(chǎn)物在機(jī)體新血管生成、細(xì)胞增殖分化等病理及生理過程均可扮演著核心角色［13］。cMyc在健康機(jī)體細(xì)胞中的表達(dá)很少，但一旦發(fā)生過度表達(dá)，可通過激活一系列細(xì)胞相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)而促使細(xì)胞從靜止期向分裂周期過渡，從而起到抑制細(xì)胞的凋亡及促進(jìn)細(xì)胞的增殖的作用，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移［14］。SOX2基因位于染色體3q26.33，是SOX基因家族的主要成員之一，具有高遷移率族（HMG）特征性結(jié)構(gòu)域，可參與機(jī)體的組織、胚胎發(fā)育以及干細(xì)胞的自我更新、分化等的調(diào)控過程中［15］。孟新雨等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，SOX2蛋白在喉癌組織的表達(dá)水平較癌旁組織更高，且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T 分期有關(guān)，與本研究結(jié)果基本一致。原因可能是由于SOX2的異常表達(dá)使機(jī)體腫瘤或胚胎干細(xì)胞相關(guān)凋亡及阻滯因子的活性受到干擾，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移進(jìn)程。本研究結(jié)果提示SOX2、cMyc可能參與促進(jìn)了喉癌的惡化過程，有可能成為病情監(jiān)測與預(yù)后評估的重要指標(biāo)之一。

綜上所述，喉癌組織中的Sox2、cMyc異常高表達(dá)，且其表達(dá)與T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，其表達(dá)情況可反映喉癌患者病情進(jìn)展和預(yù)后狀況，有可能成為喉癌腫瘤進(jìn)展檢測及預(yù)后評估的特異性指標(biāo)。但本研究的樣本量較小，仍需擴(kuò)大大樣本進(jìn)行進(jìn)一步的前瞻性分析以驗(yàn)證。同時(shí)，關(guān)于Sox2、cMyc具體如何調(diào)節(jié)喉癌生長、浸潤的通路機(jī)制問題，未來仍需學(xué)者繼續(xù)進(jìn)行研究以闡明。