曲守方 胡澤斌 孫楠 黃傳峰 黃杰

染色體非整倍體（Chromosome Aneuploidies）是指相對(duì)于人正常的46 條染色體而言，某一條或幾條染色體數(shù)目增加或減少，與嬰幼兒期顯著的發(fā)病率和死亡率有著密切的關(guān)系。其中唐氏綜合征（Trisomies 21）、愛德華氏綜合征（Trisomies 18）和帕陶氏綜合征（Trisomies 13）是臨床上最常見的染色體非整倍體疾?。?-3］。產(chǎn)前診斷金標(biāo)準(zhǔn)方法是以創(chuàng)傷性的手術(shù)取材方法結(jié)合實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞遺傳學(xué)診斷對(duì)胎兒染色體進(jìn)行核型分析，但有創(chuàng)取樣容易導(dǎo)致破水、羊膜腔炎、陰道出血、胎兒刺傷甚至是流產(chǎn)等問題［4］。

隨著母體游離胎兒DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的發(fā)現(xiàn)和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展成熟，無創(chuàng)胎兒染色體疾病產(chǎn)前檢測(cè)（Noninvasive Prenatal Testing，NIPT）成為可能［5］。中國食品藥品檢定研究院于2014年研制高通量測(cè)序用外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18 和T13）國家參考品，用于NIPT 試劑盒的上市前的注冊(cè)檢測(cè)。2021年國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)胎兒染色體非整倍體21 三體、18 三體和13 三體檢測(cè)試劑盒（高通量測(cè)序法）行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布，用于規(guī)范該類產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)。本研究使用國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測(cè)試劑盒，對(duì)產(chǎn)品技術(shù)要求中的陰性參考品符合率、檢測(cè)限、微缺失微重復(fù)參考品符合率和嵌合體參考品符合率等項(xiàng)目進(jìn)行考察，評(píng)價(jià)市場(chǎng)上使用的NIPT 試劑盒質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 材料

高通量測(cè)序用外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18 和T13）國家參考品，中國食品藥品檢定研究院提供。

胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）（簡稱試劑盒A）和Next-Seq CN500 基因測(cè)序儀，杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司提供。

胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）（簡稱試劑盒B）和Next-Seq550AR 基因測(cè)序儀，安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司提供。

胎兒染色體非整倍體（T13、T18、T21）檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）（簡稱試劑盒C）和NextSeq550AR 基因測(cè)序儀，杭州杰毅麥特醫(yī)療器械有限公司提供。

胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測(cè)試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法）（簡稱試劑盒D）和BGISEQ-500 基因測(cè)序儀，華大生物科技（武漢）有限公司提供。

胎兒染色體非整倍體21 三體、18 三體和13 三體檢測(cè)試劑盒（半導(dǎo)體測(cè)序法）（簡稱試劑盒E）和DA8600 半導(dǎo)體測(cè)序儀，廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司提供。

胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測(cè)試劑盒（半導(dǎo)體測(cè)序法）（簡稱試劑盒F）和BioelectronSeq 4000測(cè)序儀，東莞博奧木華基因科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 血漿游離DNA 提取

采用試劑盒說明書推薦的核酸提取試劑，提取國家參考品的血漿游離DNA。

1.2.2 文庫的制備

采用6 家胎兒染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒，對(duì)血漿游離DNA 進(jìn)行文庫構(gòu)建。先將血漿游離DNA 片段末端修復(fù)，然后在DNA 片段末端進(jìn)行接頭連接（或者繼續(xù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增），獲得文庫。使用核酸提取或純化試劑對(duì)文庫進(jìn)行純化，測(cè)定各個(gè)文庫的濃度，并進(jìn)行文庫的質(zhì)量檢測(cè)。

1.2.3 測(cè)序

將定量的文庫，按照試劑盒規(guī)定的比例進(jìn)行混合。將混合文庫加到測(cè)序芯片上，使用胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）檢測(cè)試劑盒配套的基因測(cè)序儀檢測(cè)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

使用試劑盒說明書指定的數(shù)據(jù)分析軟件，進(jìn)行序列比對(duì)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算13 號(hào)、18 號(hào)、21 號(hào)染色體的Z 值。根據(jù)試劑盒的參考值范圍和Z 值大小，進(jìn)行樣本染色體非整倍體的判定，如果樣本的染色體Z 值大于等于或者大于試劑盒的相應(yīng)染色體參考值，判定為該染色體非整倍體。

2 結(jié)果

2.1 陰性參考品符合率

對(duì)于胎兒游離DNA 10%濃度的國家陰性參考品，包括29 個(gè)非21、18 和13 三體的其他染色體非整倍體樣本和6 個(gè)染色體正常的陰性樣本，6 個(gè)不同試劑盒結(jié)果顯示均未檢出21 三體、18 三體和13三體。對(duì)于其他染色體非整倍體樣本，試劑盒C不僅報(bào)告試劑盒范圍內(nèi)的21、18 和13 號(hào)染色體非整倍體的結(jié)果，Z 值均小于3.2；而且報(bào)告對(duì)性染色體和試劑盒范圍外的其他染色體非整倍體的結(jié)果，對(duì)于25 個(gè)其他染色體非整倍體樣本檢出了21個(gè)相應(yīng)染色體非整倍體陽性，4 個(gè)性染色體非整倍體樣本檢出了2 個(gè)陽性。見圖1。

圖1 試劑盒C 陰性參考品的結(jié)果Figure 1 Results of national negative reference by kit C

2.2 檢測(cè)限

對(duì)于72 個(gè)胎兒游離DNA 5%濃度的T21、T18和T13 樣本（包括高GC PCR 產(chǎn)物和膽紅素的干擾樣本）和50 個(gè)胎兒游離DNA 3.5%濃度的T21、T18 和T13 樣本的國家檢測(cè)限參考品，5%濃度的國家檢測(cè)限參考品結(jié)果顯示試劑盒均能正確檢出相應(yīng)染色體三體，準(zhǔn)確檢出率均是100%；3.5%濃度國家檢測(cè)限參考品結(jié)果顯示試劑盒B 檢出48個(gè)，準(zhǔn)確檢出率為96%；其余試劑盒均檢出50 個(gè)，準(zhǔn)確檢出率是100%。見圖2。

圖2 國家檢測(cè)限參考品結(jié)果（3.5%）Figure 2 Results of national limit reference（3.5%）

2.3 微缺失微重復(fù)參考品符合率

對(duì)于胎兒游離DNA 10%濃度的國家微缺失微重復(fù)參考品，包括2 個(gè)18 號(hào)染色體微重復(fù)的樣本和8 個(gè)其他染色體微缺失的樣本，18 號(hào)染色體微重復(fù)的樣本結(jié)果顯示試劑盒均能正確檢出18 三體高風(fēng)險(xiǎn)，18 號(hào)染色體的Z 值均大于試劑盒的陽性判斷值，同時(shí)13 三體低風(fēng)險(xiǎn)和21 三體低風(fēng)險(xiǎn)，見圖3；而另外8 個(gè)其他染色體微缺失的樣本結(jié)果顯示試劑盒均未檢出21 三體、18 三體和13 三體。

圖3 18 號(hào)染色體國家微重復(fù)參考品的結(jié)果Figure 3 Results of national microduplication reference with chromosome 18

2.4 嵌合體參考品符合率

對(duì)于70%和30%嵌合比例的國家嵌合體參考品，試劑盒能夠全部正確檢出相應(yīng)染色體三體，相應(yīng)染色體的Z 值均大于試劑盒的陽性判斷值，表明試劑盒能夠正確檢測(cè)出一定嵌合比例的嵌合體樣本。見圖4。

圖4 國家嵌合體參考品的結(jié)果Figure 4 Results of national chimera reference

3 討論

隨著出生缺陷防控的需求和優(yōu)生優(yōu)育意識(shí)的增強(qiáng)，產(chǎn)前篩查和診斷越來越受到重視。與傳統(tǒng)的絨毛活檢、羊水穿刺或者臍靜脈血穿刺等介入性檢測(cè)相比，NIPT 因其操作便捷、安全性高和準(zhǔn)確率高等多方面的優(yōu)勢(shì)受到青睞［6-7］。從目前注冊(cè)檢測(cè)的試劑盒情況可以看到，胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測(cè)試劑盒的發(fā)展呈現(xiàn)多家生產(chǎn)企業(yè)、多種高通量測(cè)序平臺(tái)（聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法、可逆末端終止測(cè)序法和半導(dǎo)體測(cè)序法）和多種檢測(cè)方法（如全基因組低深度的高通量測(cè)序法、基于SNP 位點(diǎn)的靶向測(cè)序技術(shù)和基因芯片技術(shù)等）的特點(diǎn)。隨著行業(yè)技術(shù)水平的提高，NIPT 針對(duì)于胎兒染色體異常的檢測(cè)也由21 號(hào)、18 號(hào)和13 號(hào)染色體三體進(jìn)一步擴(kuò)展至性染色體數(shù)目異常、其他的常染色體數(shù)目異常以及各種染色體微缺失/微重復(fù)等［8-10］。

本研究參考擬實(shí)施的推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1801-2021 胎兒染色體非整倍體21 三體、18 三體和13 三體檢測(cè)試劑盒（高通量測(cè)序法），使用國家參考品對(duì)批準(zhǔn)上市的胎兒染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)［11-12］。研究報(bào)道cffDNA 含量低于4%時(shí)，NIPT 檢測(cè)可能失敗或出現(xiàn)假陰性結(jié)果［13］?，F(xiàn)有的商業(yè)NIPT 分析需要至少4%的胎兒比例［14-15］。因此國家檢測(cè)限參考品設(shè)置了5%和3.5%胎兒DNA 濃度的不同21 號(hào)、18 號(hào)和13 號(hào)染色體三體樣本，用于對(duì)試劑盒的檢測(cè)限性能評(píng)價(jià)。隨著檢測(cè)技術(shù)的提高，國家參考品的檢測(cè)限要求對(duì)胎兒DNA 濃度3.5%的檢測(cè)限參考品由至少10 個(gè)以上的檢出提高到必須有25 個(gè)以上的檢出。3.5%濃度的國家檢測(cè)限參考品的檢測(cè)結(jié)果表明試劑盒的正確檢出率均大于50%。國家嵌合體參考品設(shè)置了70%和30%嵌合比例的不同三體樣本，用于對(duì)試劑盒的嵌合體檢測(cè)性能的評(píng)價(jià)。嵌合體參考品的檢測(cè)結(jié)果表明試劑盒均能正確檢出30%嵌合比例的三體樣本。18 號(hào)染色體國家微重復(fù)參考品包含了18 號(hào)染色體20 Mb 以上重復(fù)，要求試劑盒均能檢出18 號(hào)染色體三體，結(jié)果表明試劑盒能夠滿足要求。本次研究結(jié)果顯示抽檢的產(chǎn)品均無不合格的產(chǎn)品。但是通過對(duì)國家參考品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)有的產(chǎn)品的軟件解讀結(jié)果存在著超出檢測(cè)范圍的內(nèi)容，包括對(duì)性染色體非整倍體和試劑盒范圍外的其他染色體非整倍體的檢測(cè)結(jié)果，并不符合批準(zhǔn)的試劑盒對(duì)胎兒染色體非整倍體疾病21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征進(jìn)行產(chǎn)前輔助判斷的范圍，建議應(yīng)對(duì)產(chǎn)品的分析軟件進(jìn)行相應(yīng)的修改。本次抽檢到的產(chǎn)品在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施前都已獲得注冊(cè)證，企業(yè)都以各自的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)或產(chǎn)品技術(shù)要求作為其檢驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，但其產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)或產(chǎn)品技術(shù)要求中檢測(cè)項(xiàng)目與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)還是存在一定的差異和問題，企業(yè)需要根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及國家參考品的要求，對(duì)自身的技術(shù)要求進(jìn)一步完善，從而保證檢測(cè)試劑盒的有效性。