王錦，張海，曲素欣

1.青島婦女兒童醫(yī)院，山東 青島 266034； 2.上海市第一婦嬰保健院，上海 201204

結(jié)直腸癌是一種惡性腫瘤，最新版全球腫瘤發(fā)病情況統(tǒng)計結(jié)果顯示，其發(fā)病率排名第3；病死率位居第2，僅次于肺癌[1]。在我國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率也呈上升趨勢[2]。結(jié)直腸癌的發(fā)生受飲食、年齡、腸道微生物、炎癥性腸病等多種因素影響。現(xiàn)階段，手術(shù)切除輔以放化療和生物療法仍為結(jié)直腸癌主要治療手段[3]。隨著化療方案的不斷改進，部分患者的無進展生存期延長，但結(jié)直腸癌患者的化療后常出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)，這不僅降低了患者的生活質(zhì)量，也限制了化療療效。

中藥由于其多靶點、低毒性的特點，在結(jié)直腸癌治療中的作用不容忽視。三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]為五加科人參屬草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴草藥之一[4]。其主要成分皂苷類具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護、抗腫瘤等多種藥理活性[5-7]。課題組前期研究表明，三七總皂苷可能是結(jié)直腸癌預(yù)防和治療的活性物質(zhì)[8]。另有研究顯示，三七可有效抑制結(jié)直腸癌細胞的增長，緩解AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌模型小鼠的腫瘤生長，降低炎癥因子表達[9-10]。不僅其中的初級皂苷，如三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd等具有抗結(jié)直腸癌活性[11-12]；其次級代謝產(chǎn)物，如人參皂苷 C-K 也表現(xiàn)出較好的抗結(jié)直腸癌活性[13]。三七治療結(jié)直腸癌的機制可能與激活活性氧簇/c-Jun氨基末端激酶/p53途徑誘導(dǎo)細胞凋亡[14]，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族蛋白阻止腫瘤細胞的遷移、侵襲[15]以及調(diào)控腸道菌群平衡[8]等相關(guān)，但其具體治療結(jié)直腸癌的活性成分和機制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學可以在分子水平方面分析化合物多靶點、多通路調(diào)控疾病的可能機制，提供藥物-靶點-疾病之間的相互作用關(guān)系，為重要的藥理研究提供了更多的方向。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法構(gòu)建了三七的“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，并進行基因本體(gene ontology，GO) 功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopaedia of gene and genomes，KEGG)通路富集分析，以探索三七治療結(jié)直腸癌的潛在機制，同時為后續(xù)相關(guān)研究提供一定的理論支持，也為抗結(jié)直腸癌藥物開發(fā)提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 三七主要活性成分及相關(guān)靶點篩選通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[16]檢索三七中化學成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為初步篩選條件。此外，檢索已發(fā)表文獻補充非此范圍內(nèi)的重要化合物信息。將上述所有候選化合物導(dǎo)入Gene Cards數(shù)據(jù)庫(http：//www.genecards.org/)獲得相應(yīng)的靶點信息[17]。

1.2 結(jié)直腸癌相關(guān)靶點自基因表達綜合(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索“Colorectal Cancer”，篩選相關(guān)數(shù)據(jù)集，最終選擇GSE25070數(shù)據(jù)集[18]。該數(shù)據(jù)集來源于GPL6883芯片平臺，為結(jié)直腸癌及其匹配的臨近非腫瘤結(jié)直腸組織的基因表達分析陣列，共26例患者信息。使用GEO2R進行分析，篩選其中P<0.05及|logFC|>1的差異基因作為結(jié)直腸癌相關(guān)靶標，并使用微生信進行作圖(http：//www.bioinformatics.com.cn/)。

1.3 三七治療結(jié)直腸癌靶點并構(gòu)建三七“活性成分-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)利用在線Venn工具(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將三七有效成分靶點與結(jié)直腸癌相關(guān)靶標取交集，得到三七主要成分對結(jié)直腸癌的治療靶點。將這些差異基因與相應(yīng)的活性成分作為節(jié)點(Node)，相互作用作為連接(Edge)導(dǎo)入Cytoscape軟件(3.7.2版本)[19]，構(gòu)建三七治療結(jié)直腸癌的“活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將三七藥物和結(jié)直腸癌交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org)構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型[20]。其中生物種類設(shè)置為“Homo spaiens”，隱去無連接靶點，其余采用默認設(shè)置，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)后導(dǎo)入Cytoscape(版本3.7.2)進一步可視化，根據(jù)度值(Degree)大小設(shè)定節(jié)點大小和顏色，結(jié)合分數(shù)的大小設(shè)定邊(Edge)粗細。

1.5 三七成分-結(jié)直腸癌靶點功能及通路富集分析將三七治療結(jié)直腸癌的靶點錄入Metascape平臺(http：//metascape.org/gp/index.html)[21]，設(shè)置P<0.01，最小富集值1.5，最小重合靶點3，富集分析其主要生物學過程及代謝通路，結(jié)合log10的值及P<0.01和文獻研究結(jié)果選取排名前20的數(shù)據(jù)，上傳至微生信平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)和Origin 9可視化分析。

1.6 三七活性成分-結(jié)直腸癌靶點-通路網(wǎng)絡(luò)拓撲圖構(gòu)建利用Cytoscape 軟件(3.7.2版本)構(gòu)建“三七活性成分-結(jié)直腸癌靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，通過軟件內(nèi)置插件對三七活性成分及靶點拓撲參數(shù)進行分析，參數(shù)主要為度值、介度和緊密度，并根據(jù)這些參數(shù)判斷核心靶點和主要藥效活性成分。

1.7 活性成分-靶點分子對接從PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org)獲得靶點蛋白結(jié)構(gòu)，在Pymol軟件(www.pymol.org)中除去配體和其他不相關(guān)分子，使用Autodock軟件進行分子對接，Pymol軟件對結(jié)果進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 三七主要活性成分及作用靶點獲取TCMSP平臺符合篩選條件的三七化學成分共8個，分別為：豆甾醇、槲皮素、十八碳十二烯、人參皂苷Rh2、人參皂苷F2、鄰苯二甲酸二異辛酯、食脂素、β-谷甾醇。同時查閱文獻，檢索結(jié)果顯示，三七入血成分中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd均為三七抗結(jié)直腸癌的重要活性成分[22-23]。此外，三七中多種皂苷經(jīng)腸道菌群代謝后產(chǎn)生的人參皂苷CK也是潛在的抗結(jié)直腸癌活性成分[24-25]。因此，結(jié)合篩選的三七化學成分和文獻檢索結(jié)果，共獲得13個有效成分，具體活性成分基本信息見表1。將13種化合物導(dǎo)入Gene Cards數(shù)據(jù)庫中獲取相應(yīng)靶標，使用相關(guān)分數(shù)(relevance score)≥1進行篩選，合并后刪去重復(fù)值，共得到相關(guān)靶點614個。

表1 三七活性成分基本信息

2.2 結(jié)直腸癌相關(guān)靶點分析自GEO數(shù)據(jù)庫GSE25070數(shù)據(jù)集篩選得到756個結(jié)直腸癌差異基因，刪除重復(fù)基因后，共獲得706個與結(jié)直腸癌相關(guān)靶點，其中下調(diào)基因462個，上調(diào)基因244個。分別采用火山圖和熱圖展示差異基因及標志差異基因的分布情況。在火山圖中，紅色代表上調(diào)基因，藍色代表下調(diào)基因，見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌差異基因表達熱圖(A)、火山圖(B)

2.3 三七活性成分治療結(jié)直腸癌的“活性成分-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建獲取三七主要活性成分的作用靶點和結(jié)直腸癌疾病靶點的交集，交集結(jié)果見圖2。共得到三七活性成分-結(jié)直腸癌共同靶點63個，參與調(diào)控的三七活性成分12個?；诖私Y(jié)果構(gòu)建“三七化合物-作用靶點-結(jié)直腸癌”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3。該網(wǎng)絡(luò)包含77個節(jié)點和219條邊，其中槲皮素有34個靶點，十八碳十二烯有38個靶點，人參皂苷F2有13個靶點，人參皂苷Rb1有14個靶點，人參皂苷Rd有17個靶點，人參皂苷CK有14個靶點，每個有效成分均關(guān)聯(lián)兩個或以上作用靶點，每個靶點也均關(guān)聯(lián)兩個或以上成分，充分展現(xiàn)了中藥“多成分-多靶點”治療疾病的特點。

圖2 三七成分-結(jié)直腸癌靶點韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析將獲得的“三七成分-結(jié)直腸癌”共同靶點63個提交到STRING平臺，獲得靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將此數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件(版本3.7.2)進一步可視化，結(jié)果見圖4。該網(wǎng)絡(luò)圖中共有62個節(jié)點，279條邊。節(jié)點大小和顏色與度值相對應(yīng)，節(jié)點越大，由藍色到橙色對應(yīng)的度值越大，邊的粗細與結(jié)合分數(shù)值相對應(yīng)，結(jié)合分數(shù)值越大邊越粗。其中最靠前的靶點分別為血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor，VEGFA)，絲裂原活化蛋白激酶-3(mitogen activated protein kinase，MAPK3)，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，細胞周期素D1(cyclin D1，CCND1)，重組人趨化因子8(recombinant human eotaxin 8，CXCL8)及MMPs，這些靶點為潛在的關(guān)鍵靶點。

圖4 三七-結(jié)直腸癌核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 靶點功能及通路富集分析通過Metascape平臺對三七調(diào)控結(jié)直腸癌相關(guān)靶點進行富集分析，并使用微生信平臺和Origin 9.0可視化結(jié)果，見圖5。從圖5中可見多個靶點和結(jié)直腸癌的產(chǎn)生有緊密聯(lián)系。圖5A表明，三七主要參與的生物學過程有脂肪酸代謝過程、一元羧酸代謝過程、炎癥性應(yīng)答、上皮細胞分化調(diào)控等方面；圖5B表明，相關(guān)靶點治療結(jié)直腸癌的功能主要富集于一元羧酸結(jié)合、細胞因子活動、氧化還原酶活性、信號受體激活活動等；圖5C表明，發(fā)生變化細胞組分主要包括細胞膜小凹、血小板微粒膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。利用Metascape平臺分析三七治療結(jié)直腸癌潛在靶點的KEGG通路(P<0.01)，見圖6和表2，三七治療結(jié)直腸癌的潛在靶點主要涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、PPAR信號通路、藥物代謝等。GO及KEGG通路富集涉及細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、細胞生長等多個生物學過程；涉及疾病通路包括結(jié)直腸癌和炎癥性腸炎等通路以及IL-17、Toll樣受體、核因子-κB等炎癥相關(guān)通路和膽汁酸代謝。

表2 三七治療結(jié)直腸癌靶點通路富集結(jié)果

注：A：GO-BP分析；B：GO-MF分析；C：GO-CC分析

圖6 三七治療結(jié)直腸癌主要成分潛在靶點的KEGG通路富集分析

2.6 三七成分-結(jié)直腸癌-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建采用Cytoscape軟件進行三七成分-結(jié)直腸癌-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，使用軟件內(nèi)置Network Analyzer對三七治療結(jié)直腸癌的網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)進行分析，獲得核心成分和作用靶點，結(jié)果見圖7和表3。該網(wǎng)絡(luò)有77節(jié)點和236條邊。其中度值較大的活性成分包括十八碳十二烯(度值28，介度0.337 6及緊密度0.517 0)，槲皮素(度值26，介度0.248 3及緊密度0.524 1)，人參皂苷Rd(度值15，介度0.050 9及緊密度 0.444 4)，人參皂苷CK(度值13，介度0.036 1及緊密度 0.434 3)，人參皂苷Rb1(度值13，介度 0.037 1 及緊密度0.429 4)，人參皂苷F2(度值12，介度 0.030 4 及緊密度0.429 4)等。度值較大的靶點蛋白主要有CCND1、IL-1β、MAPK3、FOS等，見表4，這些可能是三七治療結(jié)直腸癌的潛在作用靶點。

注：橢圓形節(jié)點為藥物活性成分，矩形為作用靶點，倒三角形為通路；節(jié)點的面積代表其度值，面積越大表明該節(jié)點越重要

表3 三七主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

表4 主要靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

2.7 活性成分-靶點分子對接結(jié)果將2.6項中核心活性成分，與關(guān)鍵靶點CCND1(6p8e)、IL-1β(2nvh)、MAPK3(4qtb)進行分子對接和結(jié)合能力預(yù)測，見表5。分子結(jié)合能小于-5 kcal·mol-1為結(jié)合能力較佳，從結(jié)果可以看出人參皂苷CK和槲皮素與各蛋白親和力較好，可能是三七發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用的主要活性成分，而其他活性成分與這些蛋白親和力一般。

表5 活性成分-靶點結(jié)合能

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個復(fù)雜而連續(xù)的過程。它涉及了遺傳、蛋白質(zhì)組學、代謝和微生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，包括對DNA損傷、基因突變、種群動態(tài)、炎癥和代謝-免疫平衡的反應(yīng)、腸道菌群失調(diào)等[26-28]。傳統(tǒng)中藥具有天然來源、多靶點和整體理念等獨特優(yōu)勢，在治療復(fù)雜疾病，特別是對單獨使用西藥反應(yīng)差的疾病方面具有優(yōu)勢。課題組前期結(jié)果表明，三七可以抑制結(jié)直腸癌小鼠腫瘤的進程，但具體機制尚不明確[8]。本研究采用基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法揭示三七治療結(jié)直腸癌的藥理作用，為治療結(jié)直腸癌提供新的治療策略。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，初步從三七中篩選出化學成分13個及作用靶基因614個，通過與結(jié)直腸癌的靶點取交集，共獲得12個活性成分及63個靶基因，并構(gòu)建了三七“活性成分-結(jié)直腸癌靶點”網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，三七中多數(shù)化合物均調(diào)控兩個以上靶點，其中槲皮素、人參皂苷Rd、人參皂苷CK、人參皂苷Rb1分別作用34個、17個、14個、14個靶點，在網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位，可能是潛在的治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵物質(zhì)。不同的成分作用于不同的靶點，同時也有一些成分同時作用于同一靶點。由此可以看出，三七的多種活性成分或許可以協(xié)同調(diào)控多個靶點來發(fā)揮作用。

槲皮素是一種類黃酮物質(zhì)，可通過調(diào)節(jié)多種生物途徑治療結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種疾病[29-30]。研究表明，其可通過調(diào)控β-catenin和APC蛋白表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖等途徑治療小鼠結(jié)直腸癌[31]。人參皂苷Rd對結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移具有較好的抑制作用，該作用可能是通過調(diào)控表皮生長因子受體實現(xiàn)[32]。此外，人參皂苷Rd還可通過調(diào)控結(jié)直腸癌小鼠腸道有益菌和有害菌數(shù)目、提高腸黏膜免疫功能、恢復(fù)腸黏膜結(jié)構(gòu)等方面治療結(jié)直腸癌[33]。人參皂苷Rb1是一種人參屬植物中重要的活性物質(zhì)，其經(jīng)腸道菌群代謝后可轉(zhuǎn)化為人參皂苷CK，而人參皂苷CK在抗炎和促進腫瘤細胞凋亡方面作用更強[34-35]，這與分子對接結(jié)果中人參皂苷CK可以更好地結(jié)合炎癥相關(guān)因子IL-1β和凋亡相關(guān)蛋白CCND1結(jié)果一致。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，MAPK3、IL-1β、CCND1、VEGFA、CXCL8、FOS和MMPs等位于PPI網(wǎng)絡(luò)核心位置的基因，提示這些靶點可能是三七治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵靶點。IL-1β和CXCL8均為免疫反應(yīng)中較為重要的細胞因子，二者都可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進腫瘤炎癥性微環(huán)境的產(chǎn)生。IL-1β結(jié)合IL-1受體(IL-1R)后，可激活p38、MAPK、JNK、核因子-κB等多條通路[36-37]來調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展。此外，IL-1β可以通過調(diào)控CXCL8、MMP-1、MMP-9 增強腫瘤細胞的遷移性和侵襲性，進而可促進腫瘤轉(zhuǎn)移[38]。FOS也是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因。研究證實，隨著結(jié)直腸癌組織中c-FOS蛋白表達增加，患者的存活率明顯下降[39]。VEGFA通過VEGFA/VEGFAR通路激活p38-絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)和磷脂酰激酶B(AKT)來誘導(dǎo)MMPs基因表達，進而促進腫瘤細胞的侵襲[40]，靶VEGF/VEGFR信號通路的藥物在結(jié)直腸癌治療中也顯示出較好療效[41-42]。CCND1在結(jié)直腸癌組織中的表達顯著高于癌旁組織[43]；且其作為Wnt/β-catenin的末端靶基因之一，與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展都有緊密聯(lián)系[44]。這些研究與本研究結(jié)果共同表明，IL-1β、MAPK3、CCND1、VEGFA、CXCL8、FOS和MMPs可能是三七治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵靶點。分子對接結(jié)果顯示，槲皮素和人參皂苷CK與IL-1β和CCND1具有較好的結(jié)合能力。這也證明了三七可能通過結(jié)合這些靶點來調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果表明，三七治療結(jié)直腸癌主要與脂肪酸代謝、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等有關(guān)。其中IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、p53信號通路和核因子-κB信號通路都已被證實與結(jié)直腸癌的病理進程相關(guān)。IL-17是一種促炎因子，在結(jié)直腸癌組織中顯著升高[45]。研究表明，IL-17可通過刺激結(jié)直腸癌細胞中VEGF的產(chǎn)生來促進血管生成[46]；刺激PGE2、MMP-9和MMP-13的產(chǎn)生來促進結(jié)直腸癌細胞的遷移[47-48]。TNF-α在結(jié)直腸癌細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[49-50]。Toll樣受體信號通路是促進結(jié)直腸癌發(fā)生的重要通路，它在結(jié)直腸上皮止血和激活先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[51]。目前，已有部分針對Toll樣受體的相關(guān)制劑應(yīng)用于治療結(jié)直腸癌的臨床試驗中[52]。腫瘤抑制蛋白p53是細胞應(yīng)激下誘導(dǎo)細胞周期阻滯、衰老和凋亡的轉(zhuǎn)錄因子。其突變發(fā)生在40%～50%的散發(fā)性結(jié)直腸癌中，與結(jié)直腸癌的預(yù)后息息相關(guān)[53]。核因子-κB信號通路是結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡、炎癥、血管生成、轉(zhuǎn)移和耐藥的關(guān)鍵調(diào)控因子[54]。研究表明，抑制NF-kB通路還可使結(jié)直腸癌細胞對化療和放療敏感，為腫瘤治療提供更有效的策略[55-56]。

高攝入量的膳食脂肪和炎癥性腸炎均被認為是誘發(fā)結(jié)直腸癌的高風險因素[57-58]。高脂肪飲食的促腫瘤活性可能歸因于其對腸道微生物群組成和代謝的影響，特別是在膽汁酸方面。而KEGG富集分析結(jié)果表明，脂肪吸收和消化、炎癥性腸炎以及膽汁分泌均與三七治療結(jié)直腸癌作用相關(guān)。研究證實，三七皂苷治療結(jié)直腸癌作用與調(diào)控腸道菌群豐度相關(guān)[8]，表明三七或可通過介導(dǎo)腸道菌群治療結(jié)直腸癌。此外，三七還可能通過PPAR信號通路、AMPK信號通路、HIF-1信號通路、Hippo信號通路發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示，三七中同一物質(zhì)可對不同靶點進行調(diào)控，而同一靶點也可對不同信號通路進行干預(yù)，體現(xiàn)了三七可通過多通路、多靶點聯(lián)合調(diào)控結(jié)直腸癌的特點。這為后續(xù)三七抗結(jié)直腸癌研究提供了理論依據(jù)，為后續(xù)挖掘三七藥物-靶點相互作用機制奠定了基礎(chǔ)，但仍需后期的實驗研究進一步論證。