石延霞 李寶聚* 王 朵 張旭娟 施建軍 路雅靜 謝學文 柴阿麗 李 磊

（1 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 杭州佳惠農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，浙江杭州 311200）

蘆筍（L.）也稱石刁柏、龍須菜，素有“蔬菜之王”的美譽，是世界十大名菜之一，我國是世界上蘆筍第一大生產(chǎn)國和出口國。隨著蘆筍種植面積的擴大，土傳病害發(fā)生率亦逐漸上升，常見的病害有莖枯病〔（Sacc.）Bubak〕、枯 萎 ?。ǎ?、根腐?。╯pp.）等，可種傳、種苗傳或者土傳（張岳平 等，2012），尤其蘆筍莖枯病（asparagus stem blight）是一種全球性的毀滅性病害，在中國、日本、泰國等國家均有發(fā)生（Sonoda et al.，1997；Shanmugam et al.，2001；Zhang et al.，2017）。我國由于氣候原因蘆筍莖枯病普遍發(fā)生，3 年以上的蘆筍發(fā)病率幾乎達100%，且南方比北方發(fā)生率高（Yang et al.，2016）。近年來，尤其浙江、江蘇等地蘆筍種植區(qū)莖枯病發(fā)生嚴重，一旦染病，植株迅速死亡，降低了蘆筍的品質(zhì)和產(chǎn)量，給當?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的損失，嚴重影響了出口創(chuàng)匯。

蘆筍莖枯病最適發(fā)病溫度為23～26 ℃，病原菌分生孢子器遇水后釋放分生孢子，隨著風雨等擴散傳播，因此多雨、高濕環(huán)境更利于該病害的發(fā)生和流行（苗華民 等，1991；賈廷祥 等，1992）。2018 年以來，浙江省杭州市佳慧蘆筍種植基地莖枯病發(fā)生日趨嚴重，與當?shù)貧夂驐l件和未及時采取防控措施，錯過了最佳防治時期有關(guān)。目前防治該病害的主要手段仍然是化學藥劑防治，本試驗對杭州蘆筍莖枯病病原菌進行鑒定，探究不同藥劑對其防治效果，以利于合理用藥，有效防控蘆筍莖枯病。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

2018 年10 月至2020 年10 月，在浙江杭州佳慧蘆筍種植基地采集具有明顯發(fā)病癥狀的蘆筍莖稈，帶回實驗室進行致病菌分離，共分離得到病原菌15 株，編號依次為LS18102101、LS18102103、LS18102104、LS18102106、LS18102108、LS18102109、LS18102110、LS18102113、LS18102115、LS18102116、LS18102123、LS18102124、LS18102125、LS18102126、LS18102136。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆筍莖枯病病原菌的分離、純化 選取病癥發(fā)生明顯的蘆筍莖部，在病健交界處切取大小約5 mm × 5 mm 的莖部組織，用75%酒精消毒30 s，置于無菌水中清洗3 次；晾干后置于PDA 培養(yǎng)基上，于27 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d 后在無菌環(huán)境下挑取新長出的菌落邊緣菌絲，移至新的PDA 培養(yǎng)基上進行多次純化培養(yǎng)，直至菌落無雜菌。

1.2.2 蘆筍莖枯病病原菌的形態(tài)學觀察 將純化后的病原菌轉(zhuǎn)接至新的PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d 后，觀察菌落形態(tài)及顏色等特征。待10 d 后病原菌產(chǎn)生分生孢子器，用接種環(huán)輕輕刮拭培養(yǎng)基分生孢子器表面制片，在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)、顏色等特征。

1.2.3 蘆筍莖枯病病原菌的分子生物學鑒定 利用真菌DNA 提取試劑盒（北京酷來搏科技有限公司），在分離出的15 株病原菌中，隨機選取8 株提取病原菌DNA，分別采用真菌通用引物ITS1/ITS4（White et al.，1990）和特異性引物SF/SR（杜宜新 等，2018）對病原菌DNA 進行PCR 擴增。PCR反應體系（50 μL）為：2 ×Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）26 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物各2 μL，ddHO 補足至50 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物送北京博邁德基因技術(shù)有限公司進行測序。將獲得的ITS 基因序列在NCBI 中比對，從GenBank 下載相關(guān)序列，用MEGA 7.0 軟件進行親緣關(guān)系分析，在8 株病原菌中隨機選擇3 株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 蘆筍莖枯病病原菌致病性測定 按照柯赫氏法則，選取盆栽半年生蘆筍幼苗，對分離出的15株病原菌進行接種驗證及致病性測定，每處理15株。將純化培養(yǎng)后的分生孢子濃度調(diào)整為1 × 10個 ·mL（楊迎青 等，2012），在蘆筍苗期，刺傷莖部進行噴霧接種，每處理噴施30 mL，以噴施清水為空白對照。待接種部位發(fā)病后，對發(fā)病部位的病斑再次進行病原菌分離、純化，觀察菌落、分生孢子器和分生孢子特征，如果與最初分離出的病原菌一致，則可確定為該病原菌。

接種14 d 后，對接種幼苗進行病情調(diào)查，計算其病情指數(shù)。

按照楊迎青等（2012）的標準進行病情分級：0 級，全株無病斑；1 級，發(fā)病面積占總面積6%以下；2 級，發(fā)病面積占總面積的6%～10%；3 級，發(fā)病面積占總面積的11%～20%；4 級：發(fā)病面積占總面積的21%～30%；5 級：發(fā)病面積占總面積的30%以上。

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù) × 該級代表值）/（調(diào)查總株數(shù) ×最高級代表值）× 100

1.2.5 不同藥劑對蘆筍莖枯病病原菌的室內(nèi)生物活性測定 以菌株LS18102108 為試材，其致病性在15 株病原菌中最強。將該菌株置于PDA 培養(yǎng)基平板上，27 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后，在菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅。含藥培養(yǎng)基的制備：將供試藥劑（表1）配制成母液，然后按照濃度梯度，用加熱融化后約55 ℃的液體PDA 培養(yǎng)基稀釋，各藥劑在PDA培養(yǎng)基中的終濃度分別為0（對照）、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg·mL，將直徑5 mm 的菌餅接種于不同濃度含藥培養(yǎng)基平板中心，有菌絲一側(cè)向上，每處理重復3 次。接菌后25 ℃黑暗培養(yǎng)，待菌絲長滿含0 μg·mL藥劑的培養(yǎng)基平板時，采用“十”字交叉法測量每處理的菌絲直徑，計算抑制率。

表1 蘆筍莖枯病病原菌室內(nèi)生物活性測定供試藥劑

抑制率=（對照菌落直徑 -處理菌落直徑）/（對照菌落直徑 -0.5 cm）× 100%

采用Microsoft Excel 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理；采用IBM SPSS Statistics 20.0 軟件，以防治藥劑濃度的對數(shù)值為橫坐標，以抑制率的生物幾率值為縱坐標，計算各藥劑的毒力回歸方程和有效中濃度（EC）。

1.2.6 不同藥劑對蘆筍莖枯病活體盆栽藥效評價 以菌株LS18102108 為試材，參試藥劑及試驗濃度詳見表2。分別將5 種稀釋后的藥劑均勻噴施于半年生盆栽蘆筍幼苗上，每種藥劑噴施30 mL，2 h 后待藥液完全被蘆筍吸收后接種病原菌，方法同1.2.4，設置清水對照。每個處理3 次重復，共30 株。待對照植株發(fā)病后，計算病情指數(shù)和防效。

表2 蘆筍莖枯病活體盆栽藥效評價供試藥劑

防效=（對照病情指數(shù) -處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù) × 100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍莖枯病田間發(fā)病癥狀

在浙江杭州佳慧蘆筍種植基地發(fā)現(xiàn)的蘆筍莖枯病主要為害植株莖部，嫩莖和嫩枝最易感病（圖1-A）。典型癥狀為：初期，莖稈上出現(xiàn)外緣呈水漬狀的橢圓形小斑；之后病斑逐漸擴大，中間呈灰褐色大斑（圖1-B）；后期，病斑上出現(xiàn)許多散生或呈輪紋狀排列的黑色小粒點（圖1-C）；病斑持續(xù)擴展并環(huán)繞莖部約一周后，植株莖葉迅速變黃枯死，直至整株死亡（圖1-D）。

圖1 蘆筍莖枯病田間癥狀

2.2 蘆筍莖枯病病原菌形態(tài)特征

將獲得的純化菌株在PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d 后，觀察菌落形態(tài)。該病原菌菌落平坦，初期為白色，氣生菌絲平鋪（圖2-A）；隨著培養(yǎng)時間延長，菌落呈灰白色或淡黃綠色（圖2-B、C）；分生孢子器形成于子座中，子座黑色，常數(shù)個集結(jié)成塊，呈球形，成熟后外露于菌絲層，培養(yǎng)后期子實體分泌橘黃色液狀物（圖2-D、E）；分生孢子呈長橢圓形或卵圓形，少數(shù)呈梭形，無色，單孢，內(nèi)有2 個油球（圖2-F）。

圖2 蘆筍莖枯病病原菌形態(tài)特征

2.3 蘆筍莖枯病病原菌分子生物學鑒定

采用通用引物ITS1/ITS4 和特異性引物SF/SR 對病原菌DNA 進行擴增，分別獲得長度為650 bp 和401 bp 的目標片段（圖3），獲得的ITS 基因序列在NCBI 上的比對結(jié)果與天門冬擬莖點霉（KJ801804.1）的序列同源性為100%。

圖3 蘆筍莖枯病病原菌ITS1/ITS4 和SF/SR 引物擴增結(jié)果

將該序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中比對分析后發(fā)現(xiàn)，菌株LS18102101、LS18102108 和LS18102110與世界不同地區(qū)的擬莖點霉（）（LC203583.1、LC203582.1、LC333579.1、KJ801804.1、KC456277.1、AB247166.1 和HQ832822.1）遺傳距離接近，均屬于同一分支（圖4）。綜合形態(tài)學特征，確定其為天門冬擬莖點霉〔（Sacc.）Bubak〕。

圖4 根據(jù)ITS 基因同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 蘆筍莖枯病病原菌致病性測定

盆栽試驗中，接種病原菌的蘆筍莖葉在接種8 d 后開始發(fā)病。發(fā)病初期莖稈開始出現(xiàn)病斑，嫩莖上逐漸出現(xiàn)小黑點，之后由于上部缺水葉部變黃，與田間癥狀一致（圖5）。將接種后發(fā)病的蘆筍莖部進行組織分離，鏡檢分離出的病原菌與接種的病原菌形態(tài)一致，表明分離獲得的病原菌為蘆筍莖枯病致病菌。接種病原菌的植株發(fā)病率均為100%，病情指數(shù)在34～63 之間，編號LS18102108 的菌株致病性最強，清水對照未發(fā)病。

圖5 蘆筍接種莖枯病病原菌發(fā)病結(jié)果

2.5 不同藥劑對蘆筍莖枯病病原菌的室內(nèi)生物活性測定

從表3 可以看出，在供試藥劑中，25%吡唑醚菌酯懸浮劑對蘆筍莖枯病病原菌菌絲生長抑制作用最強，在供試濃度下對菌絲完全抑制；75%百菌清可濕性粉劑、22.5%啶氧菌酯懸浮劑、70%丙森鋅可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和50%異菌脲可濕性粉劑對病原菌菌絲生長的抑制作用均較強，EC值分別為0.13、0.19、2.04、2.24 μg ·mL和2.25 μg·mL。

表3 不同藥劑對蘆筍莖枯病病原菌的室內(nèi)生物活性測定

2.6 不同藥劑對蘆筍莖枯病活體盆栽藥效評價

從表4 可以看出，25%吡唑醚菌酯懸浮劑的防效最好，達94.56%，與室內(nèi)生物活性測定結(jié)果相符；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、75%百菌清可濕性粉劑、50%異菌脲可濕性粉劑、22.5%啶氧菌酯懸浮劑均有不同程度的防治效果，防效分別為59.78%、58.15%、47.82%、44.56%。

表4 不同藥劑對蘆筍莖枯病病原菌的藥效評價

3 結(jié)論與討論

本試驗通過對蘆筍發(fā)病植株分離得到的病原菌進行顯微形態(tài)學觀察、分子生物學鑒定、接種驗證和致病性測定，明確該蘆筍莖枯病病原菌為天門冬擬莖點霉，這與該病害的病原菌已有報道相符（劉克均 等，1991；陳建 等，2020）。

蘆筍莖枯病是蘆筍主要病害，用于防治該病害的化學藥劑較多，僅在我國登記的就有嘧菌酯、代森鋅、苯醚甲環(huán)唑、福美雙、苯菌靈等10 種殺菌劑和1 種誘導抗病激活劑氨基寡糖素（中國農(nóng)藥信息網(wǎng)，http：//www.chinapesticide.org.cn/fwb/index.jhtml），也有報道表明吡唑醚菌酯、醚菌酯等殺菌劑（董克鋒 等，2015；劉美玲 等，2019；宋化穩(wěn) 等，2019）和春雷霉素、多抗霉素等抗生素（楊迎春等，2018；楊帥 等，2021）對蘆筍莖枯病也有較好的防治效果。為篩選出更多對蘆筍莖枯病具有較好防治效果的殺菌劑，本試驗選取了部分與已經(jīng)登記防治該病害的藥劑具有相同作用機理的殺菌劑，如代森鋅與丙森鋅，均屬于二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑；嘧菌酯與醚菌酯、吡唑醚菌酯、啶氧菌酯均為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其中吡唑醚菌酯和啶氧菌酯均為甲氧基丙烯酸酯類較新的殺菌劑，且活性較高。本試驗對11 種藥劑進行了生物活性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯可以完全抑制蘆筍莖枯病菌菌絲的生長；之后在對5 種殺菌劑防治蘆筍莖枯病的盆栽試驗效果評價時也發(fā)現(xiàn)，吡唑醚菌酯表現(xiàn)最佳，防效可達到94.56%，該殺菌劑在我國登記可用于防治蘆筍褐斑?。⊿acc.）（中國農(nóng)藥信息網(wǎng)）。因此，在蘆筍發(fā)生莖枯病或者褐斑病時選用吡唑醚菌酯進行防治，具有兼防（預防）兩種病害的作用，提高了殺菌劑的使用效率，降低了用藥量，具有節(jié)本增效的意義。

為降低田間頻繁用藥可能導致的抗藥性問題，增加交替用藥的選擇范圍。本試驗在生物活性測定中選擇了具有不同作用機理的殺菌劑，如二甲酰亞胺類觸殺性、保護性殺菌劑異菌脲和腐霉利，應用范圍和殺菌譜較廣的琥珀酸脫氫酶抑制劑氟吡菌酰胺，以及廣譜、保護性殺菌劑百菌清，測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)異菌脲和百菌清對蘆筍莖枯病病原菌均表現(xiàn)較好的生物活性，EC值分別為2.25 μg·mL和0.13 μg·mL，可作為田間防治蘆筍莖枯病的替換用藥。

本試驗同時發(fā)現(xiàn)，在我國登記用于防治蘆筍莖枯病的殺菌劑嘧菌酯的生物活性較差，其EC值高達48.70 μg·mL。嘧菌酯在杭州市佳慧蘆筍種植基地屬于防治蘆筍莖枯病的常用藥劑，推測可能是由于該藥劑在田間應用頻繁，導致當?shù)靥J筍莖枯病病原菌菌株存在一定程度的抗藥性，因此活性降低。生產(chǎn)中建議合理用藥，多種作用機理殺菌劑輪換使用以減少抗藥性發(fā)生。

盆栽藥效評價試驗中，選擇先施藥后接種的預防用藥措施，篩選出了對莖枯病防治效果較好的吡唑醚菌酯。建議在田間蘆筍莖枯病易發(fā)病季節(jié)，提前選擇吡唑醚菌酯進行1～2 次預防用藥，不但可以預防莖枯病的發(fā)生，也可以兼防褐斑病。但由于吡唑醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，國際殺菌劑抗性行動委員會將該類殺菌劑定義為高風險抗藥性類別（FRAC，2021），應用時需要與其他殺菌劑輪換使用，且單個生長季節(jié)不要超過3 次用藥。同時也需要重視新型殺菌劑的開發(fā)和應用（王建國 等，2002），為更好地防控蘆筍莖枯病提供資源儲備。