程秀峰，張金超，趙 倩，羅 章，劉振東

（西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏林芝 860000）

梨果仙人掌（Opuntia ficus-indica（Linn.） Mill.）又被稱作米邦塔，營養(yǎng)和藥用價值較高，食用歷史悠久，且種類繁多，分布廣泛[1]。西藏林芝市察隅縣察瓦龍鄉(xiāng)，位于林芝察隅縣東南部，地理位置相對偏遠(yuǎn)，交通不便，但氣候獨特，盛產(chǎn)野生的梨果仙人掌。其富含多種營養(yǎng)物質(zhì)和活性功能成分，多糖作為其功能性成分之一，含量較高[2]。仙人掌粗多糖是機體免疫調(diào)節(jié)劑，是細(xì)胞生長代謝過程中不可或缺的一類高分子化合物[3]。有研究表明，仙人掌多糖具有抗氧化、抗癌、抗病毒、降血糖、降血脂及增強免疫等多種生理活性[4]。郭利平[5]的研究表明：仙人掌多糖具有清除自由基、延緩衰老、降低血糖含量、防治癌癥等功效。王海濤等[6]發(fā)現(xiàn)米邦塔仙人掌多糖能夠有效抑制SDS 對細(xì)胞膜和DNA 的損傷。郭慶啟等[7]表示仙人掌多糖提取液能夠有效抑制大腸桿菌和枯草桿菌的生長繁殖。

炎癥是生物體對損傷或感染的應(yīng)答反應(yīng)[8]。通常情況下，炎癥過程能夠被機體較好地調(diào)控，發(fā)揮其有利作用。但當(dāng)其不受控制時，持續(xù)性的過度炎癥反應(yīng)就會破壞正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和組織功能。在炎癥反應(yīng)過程中，免疫細(xì)胞最先被激活，第一時間趕到機體的損傷部位，導(dǎo)致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的生成[9]。高濃度的ROS 對機體是有害的，會氧化蛋白及脂質(zhì)細(xì)胞成分，破壞DNA 的完整性[10]。炎癥反應(yīng)過程，能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的損傷，增加早老性癡呆的發(fā)生概率[11]。慢性炎癥的輕微增加會導(dǎo)致肥胖和抑郁癥風(fēng)險增大[12?14]，炎癥長時間得不到控制，會擾亂正常生理功能，誘發(fā)各類疾病[15?16]。近年來許多研究者證明，大部分多糖具有很好的抗炎活性[17?20]。Liu 等[21]發(fā)現(xiàn)，蟹味菇多糖具有抗炎及抗氧化活性，可抑制LPS 誘導(dǎo)的肺衰竭。Zhang 等[22]發(fā)現(xiàn)，沙棘漿果多糖可以通過抗氧化和消炎作用來預(yù)防四氯化碳導(dǎo)致的小鼠肝中毒。

目前，雖然已經(jīng)有了仙人掌干、仙人掌酒等初級加工產(chǎn)品，但是產(chǎn)量有限、創(chuàng)收有限、附加值較低[23]。對西藏梨果仙人掌進(jìn)行深入研究，可以為其食用價值和藥用價值的深度開發(fā)提供理論依據(jù)，進(jìn)而帶動當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究在對梨果仙人掌粗多糖組分分析的基礎(chǔ)上，對粗多糖的抗炎效果進(jìn)行了評價，為仙人掌的開發(fā)利用和深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

仙人掌 在2019 年9 月29 日采自林芝市察隅縣察瓦龍鄉(xiāng)的梨果仙人掌品種。將新鮮的仙人掌莖去刺、切片后置于?80 ℃超低溫冰箱預(yù)凍，預(yù)凍后使用真空冷凍干燥機進(jìn)行冷凍干燥至樣品完全干燥，備用；SPF 級雄性昆明小鼠 5~6 周齡，體重18~22 g，由儀征安立卯生物科技有限公司生產(chǎn)，許可證：SCXK（蘇）2016-0005。小鼠飼養(yǎng)及相關(guān)動物實驗嚴(yán)格按照《試驗動物管理條例》要求進(jìn)行[24]；TFA 三氟乙酸 AR，阿拉丁試劑有限公司；PMP 甲醇、單糖AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸銨 AR，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；ELISA 試劑盒 上海博湖生物科技有限公司。

FTIR Nicolet iS 5 FT-IR 傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技；waters 1525 凝膠色譜儀GPC

美國waters 公司；三重四級桿質(zhì)譜 UPLC-MS/MS

沃特世科技（上海）有限公司；101-A4（640L）電熱鼓風(fēng)干燥箱 無錫瑪瑞特科技有限公司；xmtd-204數(shù)顯恒溫水浴鍋 河北德科機械科技有限公司；WMS-1033 光學(xué)顯微鏡 上海豫光儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 仙人掌莖粗多糖提取 西藏梨果仙人掌莖的粗多糖含量參照出口植物源食品中粗多糖的測定之苯酚-硫酸法[25]進(jìn)行測定。稱取5.00 g 仙人掌凍干粉于1000 mL 燒杯中，用95%乙醇浸泡，每8 h 更換一次乙醇，浸泡至樣品呈白色，室溫干燥。按照1 g樣品50 mL 水的比例加入蒸餾水，90 ℃熱水浸提3 h，4000 r/min、20 min 離心后，棄去沉淀取上層清液。用4 倍體積95%乙醇醇沉，4000 r/min、20 min離心，取沉淀棄去乙醇，置于?80 ℃超低溫冰箱預(yù)凍，于低溫冷凍干燥機凍干即得仙人掌莖粗多糖。

1.2.2 總糖含量及分子量測定 參照GB/T 15672-2009 食用菌中總糖含量的測定方法[26]測定莖粗多糖的總糖含量。凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，GPC）測定粗多糖總糖分子量的實驗條件[27]為檢測器：2414，色譜柱：PL aquqgel-OH MIXED 8 μm，流動相：0.2 mol/L NaNO30.01 mol/L NaH2PO4pH7，流速：1 mL/min，溫度：30 ℃，進(jìn)樣量100 μL。配制1.0 mg/mL 多糖溶液，過0.45 μm 水相濾膜后，進(jìn)樣檢測。

1.2.3 單糖組成及含量測定 采用PMP 衍生法測定莖粗多糖中的單糖組分[28]，具體操作如下：

多糖水解：稱取10 mg 粗多糖樣品于20 mL 鉗口瓶中，加入2 mol/L 的TFA 水溶液5 mL，按照流速10 L/min，時間1 min 充氮氣封管，100 ℃水解2 h；冷卻后取樣品1 mL，加入1 mL 甲醇，70 ℃水浴下氮氣吹干，如此重復(fù)2 次，去除TFA；加入0.3 mol/L的NaOH 溶液1 mL，充分溶解殘渣，得到多糖水解液，按一定梯度稀釋后衍生測定。

水解后單糖的提?。悍Q取干樣約0.4 g、濕樣1.5 g（精確到小數(shù)點后4 位）于具塞刻度管中，加入10 mL 80%乙醇，在70 ℃水浴超聲提取30 min；10000 r/min 離心，取濾液用80%乙醇定容至10 mL，然后取2 mL 加入試管用氮氣吹干，之后加入1 mL 0.3 mol/L NaOH 溶液充分溶解，確保無殘留。

單糖衍生化[29]：取400 μL 的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液于5 mL 具塞試管中，加PMP 溶液400 μL，漩渦振蕩混勻，70 ℃水浴2 h，放涼至室溫，加0.3 mol/L 的HCl 400 μL 進(jìn)行中和，先后加水和氯仿1200 μL，漩渦振蕩混勻后，靜置，棄去氯仿相，重復(fù)以上步驟，萃取2 次。用水系0.45 μm 微孔膜將剩余水相過濾后供HPLC 進(jìn)樣檢測分析。

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測條件[30]：HPLC 檢測過程的色譜條件：色譜柱AGILENTEC-C182.7 μm，2.1 mm×50 mm，流動相A：50 mmol/L 乙酸銨緩沖液（氨水調(diào)節(jié)至pH=8.0），流動相B：乙腈，流速：0.4 mL/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：2 μL，質(zhì)譜掃描條件：特征離子掃描模式（SIR），ESI+噴霧電壓：2.0 kV，錐孔電壓：30 V，離子源溫度：150 ℃，脫溶劑溫度：500 ℃，脫溶劑氣（N2）：1000 L/h，SIR 模式檢測離子：481.09、495.1、510.1、511.08、525.06。

為使樣品的所有組分在最短時間內(nèi)實現(xiàn)最佳分離，提高柱效，改善檢測器的靈敏度，梯度洗脫，洗脫程序為：0~1 min，86%A；1~7 min，86%~81.5%A；7~11 min，81.5%~80%A；11~13 min，80%~40%A；13~14.5 min， 40%A； 14.5~14.6 min， 40%~86%；14.6~17 min，86%A。

1.2.4 粗多糖紅外光譜特征基團(tuán)分析 通過KBr 壓片法制得粗多糖樣品薄片，用傅里葉變換紅外光譜儀測定[31]，掃描范圍4000~400 cm?1，分辨率0.5 cm?1，以空氣做參比。在吸收光譜上，以基線法測定吸收帶的峰高和峰面積，用于定性分析。

1.2.5 小鼠足腫脹抗炎試驗

1.2.5.1 小鼠實驗分組 健康雄性昆明小鼠60 只，每個小鼠體重18~22 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機分為空白組、模型組、陽性對照組、莖粗多糖低劑量組、莖粗多糖中劑量組、莖粗多糖高劑量組，共計6 組，每組10 只小鼠。其中空白組藥物為生理鹽水，模型組不做藥物處理，陽性對照組是3 mg/kg 的醋酸地塞米松，莖粗多糖低劑量組為100 mg/kg 的莖粗多糖，莖粗多糖中劑量組為200 mg/kg 的莖粗多糖，莖粗多糖高劑量組為400 mg/kg 的莖粗多糖。各組實驗動物每天10 時灌胃給藥1 次，每只0.2 mL，連續(xù)給藥10 d。空白組除外，其他小組末次灌胃后30 min，右后足皮下注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的角叉菜膠0.03 mL 致炎，所有小鼠均建模成功。4 h 后處死小鼠，踝關(guān)節(jié)處剪下兩后足稱重。

1.2.5.2 小鼠足腫脹度和腫脹抑制率 腫脹度計算公式如下：

式中，S 是腫脹度（mg），m腫脹組是除空白組外其余組足重（mg），m空白組是空白組足重（mg）。

腫脹抑制率計算公式如下：

式中，I 是腫脹抑制率（%），S模型組是模型組的腫脹度，S給藥組是給藥組腫脹度。

1.2.5.3 觀察小鼠足腫脹情況 取小鼠足墊組織塊1 cm×1 cm，用10%中性甲醛溶液固定48 h 以上。取固定好的小鼠足墊組織塊流水沖洗8 h，將清洗好的組織塊依次經(jīng)過50%（2 h）、60%（2 h）、75%（2 h）、85%（2 h）、95%（2 h）、無水乙醇（0.5 h）各濃度乙醇逐級脫水。將脫水好的組織用無水乙醇二甲苯（1:1）透明，透明后的小鼠足墊組織使用軟蠟透蠟、硬蠟包埋，隨后進(jìn)行修塊、切片，厚度為5 μm，貼片、烤片，待用。

將貼好的小鼠足墊切片進(jìn)行脫蠟、過渡、梯度乙醇水化、蘇木素染色、藍(lán)化、洗滌、伊紅染色、梯度乙醇水化、透明、封片等一系列常規(guī)蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-eosin Staining，HE）染色處理后，利用光學(xué)顯微鏡對小鼠足墊組織切片進(jìn)行觀察和顯微照相。

1.2.5.4 檢測小鼠血漿中IL-1β、IFN-γ、TNF-α炎癥因子的含量 末次給藥4 h 后，眼眶取血，血漿使用EDTA 作為抗凝劑，收集后30 min 內(nèi)，在1000×g，2~8 ℃下離心15 min。按照ELISA 試劑盒使用說明進(jìn)行小鼠血漿中IL-1β、IFN-γ、TNF-α三種炎癥因子含量的檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 整理數(shù)據(jù)，并用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖含量及分子量的測定結(jié)果

參照GB/T 15672-2009 方法測定西藏梨果仙人掌莖粗多糖總糖含量，總糖校正曲線方程為y=0.0081x?0.0022（R2=0.9992）。測得其總糖含量為405.724 mg/g，與靳丹虹等[32]的總糖含量基本一致，與安徽仙人掌[33]莖總糖含量相當(dāng)。

表1 為西藏梨果仙人掌莖粗多糖凝膠滲透色譜相對峰表，由表可知，粗多糖的總糖Mp 峰位分子量為24915 Da。

表1 粗多糖凝膠滲透色譜相對峰表Table 1 Relative peak table of crude polysaccharide gel permeation chromatography

2.2 單糖組成及含量的測定結(jié)果

結(jié)合表2 可知在西藏梨果仙人掌莖粗多糖的單糖組成中：D-葡萄糖（Glc）含量最高，達(dá)44.066 mg/g，其次為L-阿拉伯糖（Ara）26.679 mg/g、D-半乳糖（Gal）17.815 mg/g、D-木糖（Xyl）6.650 mg/g、D-半乳糖醛酸（GalUA）6.361 mg/g、L-鼠李糖（Rham）含量為2.410 mg/g，其他按照含量從高到低依次為D-甘露糖（Man）、D-葡糖醛酸（GlcUA）、D-核糖（Rib）、L-巖藻糖（Fuc）、D-甘露糖醛酸、D-氨基葡萄糖（GlcN）、D-半乳糖胺（GalN），其中D-半乳糖胺（GalN）含量最低為0.004 mg/g。

表2 粗多糖各單糖組成Table 2 The monosaccharide composition of crude polysaccharide

2.3 粗多糖紅外光譜的分析

紅外光譜圖可以反映出高分子特有的基團(tuán)，在結(jié)構(gòu)分析中發(fā)揮著重要的作用[34]。圖1 為粗多糖紅外光譜圖，由圖可知，粗多糖在610.06、1047.88、1082.31、1416.78、1602.79、3393.49 cm?1附近有吸收峰。分析如下：經(jīng)過對粗多糖特征基團(tuán)的分析，發(fā)現(xiàn)其特征主要集中在兩個方面，一方面有較強的伸縮振動，表現(xiàn)為伯胺和仲胺的-NH 伸縮振動（3393.49 cm?1）、-C=C-伸縮振動（1602.79 cm?1）、CO 伸縮振動（1082.31 cm?1）；另一方面有較強的-OH彎曲振動（1416.78 cm?1）、C-O 不對稱收縮振動（1047.88 cm?1）和C-CO-C 面內(nèi)彎曲振動（610.06 cm?1），由紅外吸收圖譜可知，所提取的梨果仙人掌組分符合多糖結(jié)構(gòu)特征和官能團(tuán)特性[35]。

圖1 西藏梨果仙人掌莖粗多糖紅外掃描譜圖Fig.1 Infrared scanning spectra of crude polysaccharides fromAnthuriumof pear fruit in Tibet

2.4 不同劑量莖粗多糖對足腫脹度和腫脹抑制率的影響

如圖2 所示，空白組小鼠由于足部未注射角叉菜膠致炎，故空白組小鼠的足腫脹度為0。模型組小鼠的腫脹度為（0.054±0.023）mg（P＜0.01），與空白組相比，模型組小鼠出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)，致炎模型成功。陽性對照醋酸地塞米松組的平均腫脹度為0.011±0.008 mg（P＜0.01），說明醋酸地塞米松組在此模型中顯示了很好的抗炎作用。與模型組相比，粗多糖低、中、高劑量組足腫脹度均減小，腫脹抑制率增大。隨著藥物劑量從100~400 mg/kg 的不斷增加，足腫脹度不斷降低，足腫脹抑制率不斷增加，莖粗多糖高劑量組400 mg/kg 的足腫脹度和足腫脹抑制率與陽性對照醋酸地塞米松組最為接近。由此可見，西藏梨果仙人掌莖粗多糖在小鼠足腫脹炎癥模型中具有良好的抗炎作用。原因可能是仙人掌多糖通過抑制某些炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥和免疫反應(yīng)中多種功能細(xì)胞因子的表達(dá)，達(dá)到抑制炎癥的發(fā)生和發(fā)展的目的[36]。結(jié)果表明，西藏梨果仙人掌莖粗多糖在濃度100~400 mg/kg 范圍內(nèi)，抗炎效果隨著莖粗多糖濃度的增加而不斷增強。

圖2 小鼠足腫脹度和足腫脹抑制率Fig.2 Foot swelling degree and inhibition rate of foot swelling in mice注：**表示與空白組相比，P＜0.01，#、##分別表示與模型組相比，P＜0.05，P＜0.01，圖4~圖6 同。

2.5 HE 染色觀察仙人掌莖粗多糖濃度對足腫脹情況的影響

利用顯微鏡觀察小鼠足腫脹HE 染色切片，見圖3。

圖3 小鼠足腫脹HE 染色切片F(xiàn)ig.3 HE staining sections of mouse foot swelling

由圖3 可知：空白組小鼠的HE 染色細(xì)胞組織正常。由于注射角叉菜膠，小鼠自身產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，模型組切片細(xì)胞核稀疏、凌亂，細(xì)胞質(zhì)水腫變形，與空白組相比足部有明顯水腫和陽性中性粒細(xì)胞明顯減少，說明造模成功[37]。醋酸地塞米松組小鼠切片細(xì)胞水腫得到明顯改善，紫色中性粒細(xì)胞顯著增多。從莖粗多糖低、中、高三種劑量組小鼠的切片來看，足部炎性細(xì)胞浸潤程度隨著莖粗多糖濃度的升高而減少，中性粒細(xì)胞數(shù)量也隨著劑量的增加逐漸增多，且中性粒細(xì)胞明顯高于空白組，莖粗多糖高劑量組切片與陽性醋酸地塞米松組最為相似，局部細(xì)胞炎癥較模型組得到較大程度緩解。

2.6 仙人掌莖粗多糖濃度對IL-1β、IFN-γ、TNF-α炎癥因子的影響

由圖4 可知，模型組的IL-1β表達(dá)水平最高達(dá)到了395.759 pg/mL，空白組的IL-1β表達(dá)水平最低，為63.137 pg/mL。陽性對照醋酸地塞米松組、莖粗多糖高、中、低劑量組的IL-1β表達(dá)水平依次遞增，西藏仙人掌莖粗多糖劑量與IL-1β表達(dá)水平呈劑量依賴性，IL-1β的表達(dá)水平隨著莖粗多糖劑量的增加而降低。其中，莖粗多糖高劑量組的IL-1β表達(dá)水平與陽性對照醋酸地塞米松組的IL-1β表達(dá)水平最為接近。

圖4 IL-1β炎癥因子表達(dá)水平圖Fig.4 Expression level map of IL-1βinflammatory factors

由圖5 可知，空白組IFN-γ表達(dá)水平最低，其次是陽性對照醋酸地塞米松組、莖粗多糖高、中、低劑量組，模型組IFN-γ表達(dá)水平最高，為121.815 pg/mL。西藏梨果仙人掌莖粗多糖劑量與IFN-γ表達(dá)水平呈劑量依賴性，IFN-γ的表達(dá)水平隨著莖粗多糖劑量的增加而降低，莖粗多糖400 mg/kg 組的IFN-γ表達(dá)水平與陽性對照醋酸地塞米松組的IFN-γ表達(dá)水平最為接近。

圖5 IFN-γ炎癥因子表達(dá)水平圖Fig.5 Expression level map of IFN-γinflammatory factors

由圖6 可知，TNF-α表達(dá)水平隨著莖粗多糖劑量的增加而降低?？瞻捉M、陽性對照醋酸地塞米松組、莖粗多糖高、中、低劑量組的TNF-α表達(dá)水平依次遞增。西藏梨果仙人掌莖粗多糖劑量與TNF-α表達(dá)水平呈劑量依賴性。西藏梨果仙人掌莖粗多糖高劑量組的TNF-α表達(dá)水平與陽性對照醋酸地塞米松組的TNF-α表達(dá)水平最為接近。

圖6 TNF-α炎癥因子表達(dá)水平圖Fig.6 Expression level map of TNF-αinflammatory factors

綜上所述，西藏梨果仙人掌莖粗多糖具有良好的抗炎作用，這主要是仙人掌莖粗多糖通過抑制IL-1β、IFN-γ、TNF-α等多種炎癥因子的表達(dá)，也有可能是粗多糖促進(jìn)在炎癥和免疫反應(yīng)中具有多種功能細(xì)胞因子的表達(dá)來抑制炎癥的發(fā)生和發(fā)展。

3 結(jié)論

西藏梨果仙人掌莖粗多糖的總糖含量為405.72 mg/g，總糖Mn 數(shù)均分子量為14887 Da，Mw重均分子量為31278 Da。在其單糖組成方面，D-葡萄糖含量最高。對西藏梨果仙人掌莖粗多糖進(jìn)行特征基團(tuán)分析，發(fā)現(xiàn)其特征主要集中在伸縮振動和彎曲振動兩個方面，伸縮振動表現(xiàn)為伯胺和仲胺的-NH伸縮振動、-C=C-伸縮振動、C-O 伸縮振動；彎曲振動表現(xiàn)為-OH 彎曲振動、C-O 不對稱收縮振動和CCO-C 面內(nèi)彎曲振動。

通過分析炎癥細(xì)胞因子與機體炎癥之間的關(guān)系，并結(jié)合實驗結(jié)果可以看出：模型組小鼠血漿中的IL-1β、IFN-γ、TNF-α炎癥因子表達(dá)水平明顯高于其他組，空白組的炎癥因子表達(dá)水平明顯低于其他組。莖粗多糖高劑量組的IL-1β、IFN-γ、TNF-α炎癥因子表達(dá)水平與陽性對照醋酸地塞米松組表達(dá)水平最為接近，三種炎癥因子表達(dá)水平與西藏梨果仙人掌莖粗多糖呈劑量依賴性，表達(dá)水平隨著莖粗多糖濃度的升高而降低，說明西藏梨果仙人掌莖粗多糖具有良好的抗炎作用。綜上所述，西藏梨果仙人掌莖粗多糖含量較高，且具有較好的抗炎作用。因此，在之后的研究中可以對在西藏梨果仙人掌莖粗多糖作用下促進(jìn)的多功能細(xì)胞因子進(jìn)行深入研究，同時對比抑制炎癥因子和促進(jìn)功能細(xì)胞因子的表達(dá)水平情況，本實驗有助于為仙人掌的后續(xù)開發(fā)利用和深加工提供理論依據(jù)。