范小龍，朱正偉，吳婉琴，胡 瑋，黃 坤，江 豐

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430075）

TBHQ 即叔丁基對苯二酚，是一種合成的且國家允許使用于食品的酚類抗氧化劑，在植物油中最大允許限量為0.2 g/kg[1]，其發(fā)揮抗氧化作用機制是可以提供活性氫與油脂氧化產(chǎn)生的自由基結(jié)合，使自由基轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的化合物，阻斷自由基鏈式反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減緩油脂的氧化和變質(zhì)：AH+R·→RH+A· ；AH+ROO· →ROOH+A· （AH 代表抗氧化劑）[2?3]。近年來TBHQ 成為了油脂和富含油脂食品中常用的抗氧化劑，但TBHQ 分子量小，易揮發(fā)，在加熱條件下，揮發(fā)損耗較快，且在發(fā)揮抗氧化的過程中會通過一系列復(fù)雜的氧化還原反應(yīng)生成相應(yīng)的轉(zhuǎn)化物[4?7]。其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物種類研究較少，目前已有文獻報道叔丁基對苯醌（TQ）[8]是TBHQ 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物之一，該化合物在油脂儲存過程中會伴隨TBHQ 的損耗不斷產(chǎn)生。且毒理學表明[9]TQ 的毒性遠大于TBHQ，其他種類的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物未曾報道。

TBHQ、TQ 常用的檢測方法有比色法、薄層色譜法[10]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[11?13]、高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）[14?17]、氣質(zhì)聯(lián)用法（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）[18?19]、液質(zhì)聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS）[20?21]

等。其中，薄層色譜法和比色法在定性、定量方面存在不準確問題。高效液相色譜法存在靈敏度差，定性不足等問題。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其高靈敏度、高選擇性及定量定性準確等特性，已廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)獸藥殘留及添加劑的檢測中[22?23]。氣相色譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對前處理要求高，方法相對復(fù)雜但抗干擾能力較好。植物油的化學成分復(fù)雜，基質(zhì)干擾嚴重，常用的前處理方法有液液萃取法[24?25]、固相萃取柱法[26]。并且TBHQ、TQ 沸點較低，分子量小比較適合采用氣相色譜法[27?28]，同時鑒于轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的含量較低，最后確定了采用氣質(zhì)聯(lián)用法對TBHQ、TQ 及其他降解產(chǎn)物進行測定研究。因此，本文采用氣質(zhì)聯(lián)用法對TBHQ 降解產(chǎn)物產(chǎn)生的過程及新的產(chǎn)物的確證進行初步的研究，并建立TBHQ 降解產(chǎn)物的氣質(zhì)聯(lián)用儀測定的方法，旨在為TBHQ 在加熱中的使用及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在油脂中的安全研究提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標準品：TBHQ（CAS：1948-33-0） 純度≥98%，購 自 德 國Dr.Ehrenstorfer 公 司；TQ（CAS：3602-55-9） 純度≥98.3%，購自美國chromadex 公司；2,5-二叔丁基-1,4-苯醌（TBK）（CAS：2460-77-7）

純度≥99%，購自英國Alfa Aesar 公司；TBHQ 食品級添加劑 浙江一諾生物科技有限公司；乙腈、甲醇、正己烷 色譜純，均購自德國Merck 公司；植物油：大豆油、花生油、菜籽油、玉米油、葵花籽油 購自超市。

7890B-7000D 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電子轟擊離子源（EI））、7697A 頂空進樣器 美國Agilent Technologies 公司；XS204 型電子分析天平、ME2002E 型電子分析天平 梅特勒—托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；Allegra X-15R 型高速離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；UF160 型烘箱 德國Memmert 公司；RK1031 型快速溶劑蒸發(fā)儀 英國GenVac 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 普通植物油：稱取樣品2 g（精確至0.001 g），加入5 mL 乙腈飽和的正己烷，渦旋1 min 使樣品充分混勻，再加入10 mL 正己烷飽和的乙腈，混勻1 min，4000 r/min 離心5 min，取乙腈層，轉(zhuǎn)入濃縮瓶中，重復(fù)提取一次，合并乙腈層，在40 ℃水浴，100 mbar 下減壓濃縮至近干，準確加入2.00 mL甲醇溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，供分析。

1.2.2 模擬植物油油炸、煎炒時樣品前處理

1.2.2.1 加熱溫度的選擇 稱取不含抗氧化劑的植物油20 g（精確至0.001 g）至燒杯中，共21 組，每3 組為同一溫度，各組稱取食品級添加劑TBHQ 4.0 mg（使油脂中TBHQ 含量為0.2 g/kg），充分混勻，置于烘箱中，共考察了25、80、100、120、150、180、200 ℃ 7 個溫度，均加熱10 h 后按照 1.2.1 處理樣品，稀釋至合適的濃度，測定樣品中TBHQ 的含量，計算TBHQ 損耗率，并計算平均值，常溫組25 ℃僅常溫放置10 h 不做加熱處理。

1.2.2.2 加熱時間的選擇 稱取不含抗氧化劑的植物油20 g（精確至0.001 g）至燒杯中，共30 組，每3 組為同一加熱時長，各組稱取食品級添加劑TBHQ 4.0 mg（使油脂中TBHQ 含量為0.2 g/kg），充分混勻，置于烘箱中，共考察了0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 10 個加熱時間，均在180 ℃下加熱后按照 1.2.1 項下處理樣品，稀釋至合適的濃度，測定樣品中TBHQ 的含量，計算TBHQ 損耗率，并計算平均值。

1.2.3 TBHQ、TQ、TBK 的測定前處理優(yōu)化

1.2.3.1 甲醇直接提取 樣品直接經(jīng)過甲醇溶解，定容至合適體積，過0.22 μm 有機系濾膜，上機測定。

1.2.3.2 液-液萃取提取 樣品參考了SN/T 1050-2014《出口油脂中抗氧化劑的測定》中前處理方法[29]：稱取2 g（精確至0.001 g）樣品經(jīng)過乙腈飽和的正己烷溶解，正己烷飽和的乙腈分別提取兩次，合并乙腈層后在40 ℃水浴，100 mbar 下減壓濃縮至近干，用甲醇定容2.00 mL，過0.22 μm 有機系濾膜，上機測定。

1.2.3.3 固相萃取柱提取 樣品參考了GB 5009.32-2016《食品中9 種抗氧化劑的測定第三法》中前處理的方法[30]：稱取2 g（精確至0.001 g）樣品經(jīng)過乙腈飽和的正己烷溶解，正己烷飽和的乙腈分別提取兩次，合并乙腈層，C18固相萃取柱（2000 mg/12 mL）中裝入約2 g 的無水硫酸鈉，用5 mL 甲醇活化萃取柱，再以5 mL 乙腈平衡萃取柱，棄去流出液，將乙腈層溶液傾入柱中，棄去流出液，再以5 mL 乙腈和甲醇的混合溶液（2:1，體積比）洗脫，收集所有洗脫液于試管中，40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加2 mL 乙腈定容，過0.22 μm 有機系濾膜，上機測定。

1.2.4 標準溶液的配制 稱取TBHQ 10.0 mg、TQ 10.0 mg、TBK 10.0 mg 分別至3 個10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即為標準儲備液。精密吸取TBHQ 儲備液100 μL、TBK 儲備液100 μL、TQ 儲備液500 μL 至100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即為標準使用液，則TBHQ 濃度為1 μg/mL、TBK 1 μg/mL、TQ 5 μg/mL。

1.2.5 儀器條件

1.2.5.1 GC 條件 色譜柱Agilent HP-5MS UI 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He；載氣流速1.0 mL/min；進樣口溫度230 ℃；分流方式：不分流；柱溫（程序升溫）：初始溫度40 ℃，保持1 min，以15 ℃/min 升溫至205 ℃，然后以20 ℃/min 升溫至280 ℃，保持2 min；進樣量1 μL。

1.2.5.2 MS 條件 電子轟擊離子源（EI）；電離電壓：70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲時間5 min；選擇離子監(jiān)測（SIM）模式下TBHQ 定量離子為m/z 123，定性離子為m/z 166、151，TQ 定量離子為m/z 121，定性離子為m/z 164、149，TBK 定量離子為m/z 205，定性離子為m/z 220、177。

TBHQ 損耗率計算

式中，ρ代表TBHQ 損耗率（損耗包括揮發(fā)部分及自身轉(zhuǎn)化部分），C1代表加熱前TBHQ 含量（g/kg），C2代表加熱后TBHQ 含量（g/kg）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)由MS Quantitative Analysis 分析，數(shù)據(jù)匯總后，經(jīng)過Microsoft Office Excel 進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬植物油油炸、煎炒時TBHQ 降解產(chǎn)物產(chǎn)生條件

2.1.1 加熱溫度的確定 考察了25、80、100、120、150、180、200 ℃ 7 個溫度，并加熱10 h 后，按照樣品前處理要求處理樣品，上機測定，統(tǒng)計、分析數(shù)據(jù)，最終得到TBHQ 損耗率與加熱溫度的關(guān)系圖，結(jié)果見圖1。由圖1 可知，TBHQ 的損耗率隨著溫度的升高而逐漸增加，在加熱溫度為180~200 ℃時TBHQ的損耗率接近60%，這可能與高溫加速TBHQ 反應(yīng)，更多的TBHQ 被氧化有關(guān)。在日常生活中，油炸及煎炒時植物油的溫度在200 ℃左右，并結(jié)合在180 ℃時TBHQ 的損耗率為57.87%，且有研究表明TQ 在180 ℃時生成的量最高，200 ℃時TQ 含量明顯減少[31]，因此確定加熱溫度為180 ℃。

圖1 不同的加熱溫度對TBHQ 損耗的影響Fig.1 Effects of different heating temperatures on TBHQ loss

2.1.2 加熱時間的確定 考察了0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 10 個加熱時間，并在180 ℃下加熱后，按照樣品前處理要求處理樣品，上機測定，統(tǒng)計、分析數(shù)據(jù)，最終得到TBHQ 損耗率與加熱時間的關(guān)系圖，結(jié)果見圖2。由圖2 可知，隨著加熱時間的增加，TBHQ 損耗也不斷升高，這可能是由于TBHQ 自身揮發(fā)及自身降解轉(zhuǎn)化造成的，在加熱時間小于10 h時，TBHQ 損耗率逐漸提高，且提高速率較快，在10 h之后，損耗率提高速率逐漸趨于平穩(wěn)，考慮時間及經(jīng)濟效益最終確定加熱時長為10 h。

圖2 不同的加熱時間對TBHQ 損耗的影響Fig.2 Effects of different heating time on TBHQ loss

2.2 植物油加熱中TBHQ 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TBK 的確證及TBHQ 抗氧化機理初步分析

TQ 是目前TBHQ 已知、確定的降解產(chǎn)物，是由TBHQ 加熱后產(chǎn)生的。本實驗在測定TQ 的含量時，將180 ℃加熱處理后的TBHQ 樣品，經(jīng)氣相質(zhì)譜全掃定性，在與TQ 色譜峰相差不遠的保留時間處，始終存在一個色譜峰，雖然響應(yīng)沒有TQ 高，但峰形，保留時間較穩(wěn)定，見圖3-曲線B，并且空白樣品中沒有出現(xiàn)此峰，見圖3-曲線A，因此考慮此峰可能為一個新的轉(zhuǎn)化物，嘗試查看其碎片離子，見圖4，并通過美國國家標準與技術(shù)研究所NIST（National Institute of Standards and Technology）數(shù)據(jù)庫匹配，匹配到的化合物為2,5-二叔丁基-1,4-苯醌（匹配分數(shù)為85.3%）。同時通過對照品的保留時間及碎片離子再次確證，見圖3-曲線C，最后確認該化合物即為2,5-二叔丁基-1,4-苯醌（TBK），3 種化合物標準品的色譜圖見圖5。

圖3 不同樣品全掃圖與TBK 標準品全掃圖對比Fig.3 Differences between full scanchromatograms of different samples and TBK standard注：曲線A:空白樣品全掃圖；曲線B：含TBHQ 的樣品加熱處理后質(zhì)譜全掃圖；曲線C：2,5-二叔丁基-1,4-苯醌對照品質(zhì)譜全掃圖。

圖4 2,5-二叔丁基-1,4-苯醌（TBK）質(zhì)譜碎片離子圖Fig.4 Fragment ion diagram of 2,5-di-tert-butyl-1,4-benzoquinone

圖5 3 種化合物對照品的GC-MS 總離子流圖Fig.5 Total ion chromatograms of three compounds

TBHQ 在油脂中的抗氧化機理與其它酚類抗氧化劑抗氧化機理相同，在高溫或有氧條件下TBHQ 失去質(zhì)子并參與油脂中脂肪酸氧化的自由基反應(yīng)，具體氧化過程如下：TBHQ 具有兩個酚羥基，TBHQ 失去一個質(zhì)子成為一酚氧離子，由單電子氧化變成酚氧自由基，從另一個羥基中質(zhì)子離解得到半醌陰離子自由基，第二個單電子再氧化得到2-叔丁基苯醌。苯醌的共振穩(wěn)定化作用，導(dǎo)致TBHQ 朝氧化生成醌的方向進行。TBHQ 也可能在+C（CH3）3攻擊下轉(zhuǎn)化成2,5-二叔丁基-1,4-苯酚[32?33]，然后苯酚失去質(zhì)子產(chǎn)生TBK，TQ 與TBK 形成示意圖見圖6。

圖6 TBHQ 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物形成示意圖Fig.6 Flow chart of TBHQ transform product formation

2.3 TBHQ、TQ、TBK 的測定

2.3.1 樣品前處理的優(yōu)化 考察了甲醇直接提取樣品、液-液萃取提取樣品、固相萃取柱提取凈化樣品3 種不同的提取方式，以TBHQ、TQ 及TBK 回收率為指標選擇合適的前處理方式。按照相應(yīng)的前處理條件處理樣品，上機測定，統(tǒng)計、分析數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1，結(jié)果表明：甲醇直接提取樣品上機測定的方法，由于基質(zhì)干擾較大，雜質(zhì)對目標物干擾較強，三個目標化合物回收率均較低；液-液萃取的方法與固相萃取柱提取凈化樣品的方法，三個目標化合物回收率均在85.35%~95.43%之間，回收率較好，表明這兩種方法均可以減小雜質(zhì)的干擾，可以作為三種化合物的前處理方法，但考慮到用固相萃取柱的方法操作會復(fù)雜于液-液萃取的方法，而且固相萃取的方法用時較長，最后選擇了液-液萃取的方法作為三種化合物測定的前處理方法。

表1 3 種化合物的不同前處理條件下平均回收率（n=6）Table 1 Average recoveries of three compounds under different pretreatment conditions (n=6)

2.3.2 方法學考察

2.3.2.1 線性范圍和定量限 選擇空白樣品，采用逐步定量的添加標準溶液方式，按照前處理方法步驟處理并上機測定，至定量離子定性離子信噪比均大于10 時添加濃度即為定量限。由定量限濃度來計算配制合適的混標使用液濃度，用甲醇稀釋，以目標物定量離子的峰面積y 為縱坐標，以質(zhì)量濃度x（ng/mL）為橫坐標繪制標準曲線并進行線性擬合，得到線性回歸方程，結(jié)果見表2，三種化合物在各自濃度范圍內(nèi)線性良好（R2>0.995），且3 種化合物定量限TBHQ和TBK 為10 μg/kg，TQ 為50 μg/kg 均低于國家標準GB 5009.32-2016 中規(guī)定的相關(guān)化合物定量限要求（TBHQ 定量限為0.5 mg/kg）[30]。

表2 3 種化合物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限Table 2 Calibration equations, linear ranges, related coefficients and limits of quantitation of three compounds

2.3.2.2 回收率和精密度 于空白基質(zhì)中分別添加1 倍定量限10 μg/kg、2 倍定量限20 μg/kg、10 倍定量限100 μg/kg 三個水平的TBHQ、TBK 標準溶液；分別添加1 倍定量限50 μg/kg、2 倍定量限100 μg/kg、10 倍定量限500 μg/kg 三個水平的TQ 標準溶液做回收率實驗，每個添加水平重復(fù)測定6 次。方法的精密度用6 次平行測定的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示。結(jié)果表明，3 種化合物平均回收率為83.40%~107.71%，相對標準偏差為1.40%~8.50%，回收率良好，符合一般含量測定的要求，且相對標準偏差均小于10%，表明本方法穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表3。

表3 3 種化合物在空白基質(zhì)中的平均回收率及精密度（n=6）Table 3 Average recoveries and RSDs of three compounds in blank matrix (n=6)

2.4 實際樣品的測定與分析

在市場上購買菜籽油5 批，花生油5 批，大豆油5 批，玉米油5 批，葵花籽油5 批，同一品種的油均來自不同的廠家。按照本方法測定，其中在一批標有TBHQ 的大豆油中檢測出TBHQ 含量為0.061 g/kg，TQ 含量為0.005 g/kg，2,5-二叔丁基-1,4-苯醌未檢出；一批標有TBHQ 的花生油中檢測出TBHQ 含量為0.096 g/kg，TQ 含量為0.011 g/kg，2,5-二叔丁基-1,4-苯醌未檢出。這兩批植物油生產(chǎn)日期距離取樣測定時的時間相差18 個月，這也表明，即使常溫儲存，TBHQ 也會轉(zhuǎn)化為TQ，但均未檢測出2,5-二叔丁基-1,4-苯醌，可能2,5-二叔丁基-1,4-苯醌需要高溫加熱才會產(chǎn)生，因此將上述測定出含有TBHQ 的大豆油、花生油模擬日常生活中煎炸時的油，200 ℃，加熱1 h 后，放置，冷卻至室溫，按照本方法測定3 種化合物，結(jié)果見表4，兩批油脂經(jīng)加熱后均產(chǎn)生TBK，這也驗證了本實驗TBK 產(chǎn)生的條件：高溫；同時也表明不同的油脂樣品TBK 生成量不一樣，這可能和油脂不飽和脂肪酸含量有關(guān)[34?35]。

表4 實際樣品中三種化合物的含量測定Table 4 Determination of three compounds in different samples

3 結(jié)論

在研究TBHQ 已知的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TQ 時，通過氣相質(zhì)譜全掃發(fā)現(xiàn)一個新的轉(zhuǎn)化物2,5-二叔丁基-1,4-苯醌，并用本方法測定市場購買的植物油，確定了添加TBHQ 的植物油，經(jīng)過一定時間的存放，該植物油中TBHQ 會降解成TQ，但不會降解產(chǎn)生2,5-二叔丁基-1,4-苯醌，這可能與植物油使用的溫度有關(guān)，經(jīng)過加熱處理該植物油，最終也檢測出TBHQ 另外一種降解產(chǎn)物物2,5-二叔丁基-1,4-苯醌，同時TQ 含量升高。結(jié)果表明含有TBHQ 的植物油在常溫放置時容易轉(zhuǎn)化成TQ，在煎、炸等高溫處理的過程中易轉(zhuǎn)化成2,5-二叔丁基-1,4-苯醌，更易轉(zhuǎn)化成TQ。本文通過氣質(zhì)聯(lián)用法，發(fā)現(xiàn)并確證了TBHQ 的兩種降解產(chǎn)物，并建立了植物油中TBHQ 及其兩種降解產(chǎn)物測定的方法，并通過實際樣品的驗證，表明該方法，操作簡單，靈敏度高，可以為植物油監(jiān)管提供技術(shù)支撐。但是，由于TBHQ 新的降解產(chǎn)物2,5-二叔丁基-1,4-苯醌研究較少，其毒性目前也沒有相關(guān)報道，后期可以對2,5-二叔丁基-1,4-苯醌毒性展開研究，為植物油的使用安全性提供更多有力的數(shù)據(jù)。