談江瑩，陳紫婷，秦佳斌，王伊琳，吳 茜

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430068）

食品加工中發(fā)生美拉德反應(yīng)所形成的潛在危害安全物質(zhì)如丙烯酰胺（acrylamide, AA）、雜環(huán)胺（heterocyclic amines, HAs）和晚期糖化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products, AGEs）等[1]已受到廣泛關(guān)注。AGEs 是經(jīng)過美拉德反應(yīng)中期、后期階段形成的一類復(fù)雜化合物的總稱，其形成和積累與衰老和糖尿病等多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。如AGEs與糖化終產(chǎn)物受體結(jié)合，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)[2]；KATARíNA 等[3]已發(fā)現(xiàn)，過多地攝入熱加工的食品會導(dǎo)致糖尿病，并誘發(fā)炎癥，增強(qiáng)氧化應(yīng)激，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生。此外，一系列的動物研究發(fā)現(xiàn)，老鼠食用富含AGEs 的食物會引起尿蛋白增加[4]和腎臟損傷等一系列問題。這些發(fā)現(xiàn)表明，飲食中AGEs 可能被認(rèn)為是威脅人類健康的慢性危險因素。因此，有必要了解食物中飲食AGEs 的情況。

調(diào)控烘焙食品中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物AGEs 的傳統(tǒng)方法非常依賴于產(chǎn)品及加工參數(shù)（如溫度）、成分（如前體含量、pH 和含水量）等，這些因素的變化或抑制劑的添加都會影響食品的質(zhì)量[5]。然而，近幾年發(fā)現(xiàn)一種潛在的治療方法，通過使用各種天然抗氧化劑，清除美拉德反應(yīng)中形成AGEs 的自由基，達(dá)到抑制AGEs 生成的目的。目前發(fā)現(xiàn)可用于食品加工的AGEs抑制劑主要包括黃酮類、酚酸等多酚類物質(zhì)[6]。許多酚類化合物在模擬生理條件下具有抗糖化作用，如蓮原花青素（LSPC）。蓮原花青素是從蓮科植物蓮的成熟花托中分離的天然多酚類化合物，主要由（+）-兒茶素、（?）-表兒茶素和B 型原花青素二聚體、三聚體、四聚體組成[7]。LSPC 是國際公認(rèn)的最有效的天然抗氧化劑，分子結(jié)構(gòu)中的多元羥基賦予蓮原花青素優(yōu)良的抗氧化活性和與酶的結(jié)合能力[8]，并使其在體內(nèi)發(fā)揮降血糖[9]、抗腫瘤[10]、抗炎[11]、抗衰老[12]、預(yù)防心血管疾病[13]和抑制AGEs 的生成[14]的作用。

迄今為止，很少有研究全面評價酚類化合物與AGEs 之間的抑制關(guān)系及感官品質(zhì)的影響。華夫餅作為一種熱加工食品，其中含有大量的糖類、蛋白質(zhì)及脂類，在熱加工過程中會發(fā)生劇烈的美拉德反應(yīng)從而生成AGEs。因此，本研究以添加不同LSPC 濃度的華夫餅為研究對象，探究LSPC 對華夫餅中AGEs 抑制和感官品質(zhì)的影響，為深入研究LSPC 對食品熱加工過程中AGEs 抑制作用及感官品質(zhì)影響提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蓮原花青素粗提物 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院天然產(chǎn)物實驗室提供，經(jīng)AB-8 大孔吸附樹脂進(jìn)一步純化后，以葡萄籽原花青素為對照，采用鹽酸-正丁醇法測得其原花青素含量為98.87%（w/w）；面粉、白砂糖、黃油、玉米淀粉 安琪酵母股份有限公司；雞蛋 正大集團(tuán)；德亞全脂純牛奶 品渥食品股份有限公司；甲醇 色譜純，瑞典Oceanpak 試劑公司；甲酸 色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；其他試劑均為分析純或色譜純，均來自上海麥克林生化科技有限公司。

ME3002/02 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CT15RE 離心機(jī)、F7000 熒光酶標(biāo)儀 日本日立公司；XW-80A 微型渦旋混合儀 上海瀘西分析儀器廠有限公司；UV-1601 紫外可分光光度計 北京瑞麗分析儀器有限公司；RF5301 熒光分光光度計 日本島津公司；HH-8CJ 數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；FE20 型pH 計 瑞士Mettler-Toledo；RE-111 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀瑞士Buchi 公司；1260 型高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司；LSPCX 固體萃取柱、Eclipse Plus C18色譜柱 Agela 科技公司；PEN3 便攜式電子鼻系統(tǒng) 德國Airsense 公司；7890A/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；SPME 手動進(jìn)樣萃取頭 美國Supelco 公司；TA-XY2i 型質(zhì)構(gòu)儀 美國Stable Micro System 有限公司；CM3500d反射分光光度計 日本大阪的柯尼卡美能達(dá)傳感公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 華夫餅的制備 根據(jù)楊軍等[15]的方法略有改動。所有華夫餅都用相同的原料制備。首先，分離兩個雞蛋的蛋清蛋黃，在蛋黃中加入65 g 面粉，40 g 黃油，90 mL 牛奶，5 g 玉米淀粉后混合成蛋黃漿液；在蛋清中分三次加入25 g 白砂糖，攪拌至硬性發(fā)泡。將攪拌好的蛋白霜分兩次加入蛋黃漿液，以切拌方式攪拌均勻，在模具中分別倒入20 g 華夫餅漿液。按表1 分別將不同濃度LSPC 溶于1.5 mL 去離子水中攪拌均勻。然后將樣品在170 ℃下烘焙20 min。

表1 LSPC 添加量Table 1 Content of LSPC

1.2.2 熒光AGEs 抑制率的測定 根據(jù)ZHANG 等[16]的方法略有改動，用去離子水提取模型華夫餅（250 mg），并用4.75 mL Carrez 溶液澄清（吐溫?20，0.05% v/v；SDS，1% w/v；β-巰基乙醇，5% v/v；Tris-HCl，50 mmol/L，pH7.4），超聲（300 W，37 ℃，30 min），離心（3000 r/min，10 min，25 ℃）并過濾（100 μL）。使用酶標(biāo)儀在355/405 nm 的激發(fā)/發(fā)射波長下測定熒光AGEs。不包含LSPC 的反應(yīng)溶液用作對照組。抑制率的計算公式為：

式中，F(xiàn)對照表示對照組熒光AGEs 強(qiáng)度，F(xiàn)樣品表示樣品組熒光AGEs 強(qiáng)度。

1.2.3 羧甲基賴氨酸含量（Nε-（Carboxymethyl）lysine，CML）的測定

1.2.3.1 樣品處理 根據(jù)GENGJU 等[17]的方法略有改動。在4 ℃下，將2 mL 0.2 mol/L 硼氫化鈉（pH13~14）添加到模型華夫餅樣品（500 mg）中12 h。使用4 mL 氯仿/甲醇（2:1，v/v）溶液對反應(yīng)溶液進(jìn)行脫脂，然后離心（在?4 ℃下15000 r/min）1 h。隨后，將鹽酸混合至終濃度為6 mol/L，并將樣品在110 ℃下水解24 h。將最終的CML 萃取液濃縮，直到用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥，然后溶解在4 mL 硼酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH9.4）中，然后進(jìn)行最終的膜過濾（尼龍，0.45 mL）。根據(jù)SUN 等[18]的方法，對CML 處理測量方法進(jìn)行了適當(dāng)修改，將樣品（15 μL）注入Eclipse Plus C18色譜柱。

1.2.3.2 液相條件 流動相A：含0.2%甲酸的水溶液。流動相B：純甲醇，流速0.2 mL/min。梯度洗脫條件為0~0.5 min 10%B，0.5~4.0 min 10%~60%B。特征離子碎片m/z 84 和m/z 130 處的片段用于定性CML（m/z 205）。用CML 標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)曲線對樣品中CML 含量定量。通過MassHunter Data 和MassHunter Qualitative 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3.3 CML 抑制率計算 CML 的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=2×106x+56683，R2=0.9928。

式中，x 表示CML 濃度，μg/mL；y 表示CML 的峰面積。

式中，X樣品表示LSPC-1、LSPC-2、LSPC-3、LSPC-4 樣品組CML 濃度，μg/mL；X對照表示LSPC-0 樣品組CML 濃度，μg/mL。

1.2.4 總酚含量的測定 參照LI 等[19]的方法略有改動，提取華夫餅中總酚。樣品溶于50%乙醇溶液（1:1，v/v），超聲溶解（37 ℃，1 h），離心（25 ℃，3000 r/min，5 min），分離固液相，保留上清液，取樣液（1.5 mL）與福林酚試劑（1.5 mL）混合靜置3 min，再加入碳酸鈉溶液（15%，1 mL），靜置30 min，離心后（25 ℃，3500 r/min，3 min），收集上清液，以15%碳酸鈉溶液為空白，測定760 nm 處的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0336x+0.0901，R2=0.9288。

式中，x 表示總酚含量（mg），y 表示760 nm 下測得的吸光值。

1.2.5 正丁醇-鹽酸法測定蓮原花青素消耗率 將華夫餅粉末（500 mg）與25 mL 甲醇混合，超聲處理（37 ℃，30 min），離心后（3000 r/min，5 min，25 ℃）過濾（1 mL）。取上清液，將其轉(zhuǎn)移至帶塞子的10 mL試管中，依次添加0.2 mL 硫酸鐵銨溶液和6 mL 正丁醇-鹽酸溶液，并充分搖勻。將反應(yīng)溶液在95~97 ℃的水浴中濃縮回流40 min 后，迅速用冷水冷卻，并在546 nm 波長處測量吸光度?；谖舛群蜐舛戎g的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計算殘留的LSPC的量。用甲醇代替樣品作為空白對照。消耗率的計算公式為：

式中，F(xiàn)對照表示對照組LSPC 含量（mg），F(xiàn)樣品表示樣品組LSPC 含量（mg）。

1.2.6 抗氧化活性測定

1.2.6.1 DPPH 自由基清除率 根據(jù)SING 等[20]的方法略有修改，估算了每種華夫餅提取物的DPPH自由基清除能力。將華夫餅粉末（200 mg）與10 mL去離子水混合，超聲處理（37 ℃，60 min），離心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并過濾（1 mL）。在試管中將酚提取物樣品（0.2 mL）或0.2 mL 去離子水（空白）與3.8 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合。將DPPH-乙醇溶液替換為乙醇溶液作為對照或調(diào)零。將樣品在室溫下黑暗中靜置2 h 后在517 nm 下測量吸光度。

式中，A樣品表示樣品組吸光值，A對照表示對照組吸光值，A空白表示空白組吸光值。

1.2.6.2 ABTS 自由基清除率 根據(jù)THAIPONG 等[21]的方法略有修改。將華夫餅粉末（200 mg）與10 mL去離子水混合，超聲（37 ℃，60 min），離心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并過濾。儲備溶液包括2.6 mmol/L 過硫酸鉀溶液和7.4 mmol/L ABTS 溶液。然后通過將兩種儲備溶液等量混合并在室溫下于黑暗中反應(yīng)12 h 來制備工作溶液。通過使用分光光度計將21 mL去離子水與1 mL ABTS+溶液混合來稀釋溶液，以在734 nm 處獲得0.70±0.02 單位的吸光度。每次測定前制備新鮮的ABTS+溶液。使酚提取物（100 μL）與400 μL 的ABTS+溶液反應(yīng)。用乙醇溶液代替酚提取物樣品作為空白。然后使用酶標(biāo)儀在734 nm處測定吸光度。

式中，A樣品表示樣品組吸光值，A空白表示空白組吸光值。

1.2.6.3 FRAP 鐵離子還原能力 使用ERDOGANORHAN 等[22]的方法略有修改測試了還原鐵的能力。將華夫餅粉末（200 mg）與10 mL 去離子水混合，超聲（37 ℃，60 min），離心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并過濾（1 mL）。在試管中將酚提取物樣品（100 μL）與300 μL 去離子水混合。然后加入3 mL 工作液（100 mL 乙酸鈉緩沖液，10 mL 10 mmol/L TPTZ溶液和10 mL 20 mmol/L FeCl3溶液）。用去離子水代替工作液作為對照。用去離子水代替酚提取物樣品作為空白。劇烈搖動混合物后，將樣品在37 ℃水浴鍋中加熱4 min。將200 μL 反應(yīng)溶液加入到酶標(biāo)儀中，并在593 nm 處測量吸光度。

式中，A樣品表示樣品組吸光值，A對照表示對照組吸光值，A空白表示空白組吸光值。

1.2.6.4 羥自由基清除率 根據(jù)LI 等[23]的方法略有修改，對每種華夫餅提取物的羥自由基清除能力進(jìn)行了估算。將模型華夫餅（200 mg）與10 mL 去離子水混合，超聲（37 ℃，60 min），離心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并過濾（2 mL）。在試管中將酚提取物樣品（1.5 mL）或1.5 mL 去離子水（空白）與1.5 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合。然后，加入1.5 mL H2O2（8.8 mmol/L）和1.5 mL FeSO4（9 mmol/L）。用去離子水代替FeSO4溶液作為對照。去離子水用于調(diào)零。充分混合后，將樣品在37 ℃的水浴箱中加熱10 min。將200 μL 反應(yīng)溶液加入到酶標(biāo)儀中，并在510 nm處測量吸光度。

式中，A樣品表示樣品組吸光值，A對照表示對照組吸光值，A空白表示空白組吸光值。

1.2.7 水分的測定

1.2.7.1 水分含量的測定 使用水分含量儀（200 mg，105 ℃）測定樣品的水分含量。

1.2.7.2 水分活度的測定 使用便攜式水分活度儀在25 ℃下測定水分活度。

1.2.7.3 低場核磁的測定 根據(jù)CAO 等[24]描述的方法稍作調(diào)整進(jìn)行 NMR 測量。將樣品放入15 mm×200 mm 的核磁管中，并置于LF-NMR 分析儀中。該測試是在100 kHz 的諧振頻率下進(jìn)行的。橫向（T2）弛豫是通過Carr-Purcell-Meiboom-Gill 脈沖序列獲得的，該序列具有4 個掃描和12000 個回波。兩次連續(xù)掃描之間的重復(fù)時間為3 s，脈沖之間的τ 值為250 μs，分別為90°和180°。T2 分布是通過MultiExp Inv 分析軟件獲得的。整個過程在20 ℃下進(jìn)行三次重復(fù)。

1.2.8 pH 測定 將華夫餅粉末（250 mg）與25 mL水混合并渦旋3 min。將混合物在室溫下保持1 h 以分離固相和液相。小心除去上清液層后，使用pH 計測定pH。

1.2.9 華夫餅質(zhì)構(gòu)分析 根據(jù)王麗莎等[25]的方法稍加改動，測量華夫餅質(zhì)構(gòu)。采用紋理分析儀的P/36R圓柱探頭，按樣品標(biāo)記順序進(jìn)行測量。測量前探針離樣品越近越好。壓縮實驗參數(shù)設(shè)置如下：工作模式為TPA 方案；探針誘導(dǎo)5 g；測量前后中速度為5 mm/s；目標(biāo)模式應(yīng)變?yōu)?0%；數(shù)據(jù)采集點為500 pps，記錄硬度、彈性、凝聚力、膠粘性、咀嚼性和回彈性等紋理參數(shù)。

1.2.10 色度測定 根據(jù)谷滿屯等[26]的方法稍加改進(jìn)測量華夫餅色度。華夫餅的顏色用CM-3500d 反射分光光度計進(jìn)行測量，結(jié)果用CIE Lab 色彩系統(tǒng)表示。在華夫餅表面的不同區(qū)域?qū)*（紅色），b*（黃色）和L*（亮度）參數(shù)進(jìn)行了三個獨(dú)立的測量。根據(jù)等式計算E值。用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)白板CRA43（L*=93.80；a*=0.3156；b*=0.3319）校準(zhǔn)設(shè)備。

1.2.11 電子鼻分析 根據(jù)賈洪鋒等[27]的方法稍作調(diào)整，測量華夫餅電子鼻。稱量1 g 華夫餅粉末，將其放入20 mL 樣品瓶中，添加適量10%生理鹽水以完全潤濕樣品，密封樣品瓶，在37 ℃水浴中加熱30 min。使用PEN3 電子鼻進(jìn)行風(fēng)味檢測。電子鼻測試條件：樣品測試時間200 s，采樣間隔1 s，清潔時間120 s，復(fù)位時間10 s，內(nèi)部流速300 mL/min，樣品流速300 mL/min。對所有樣品重復(fù)測量3 次。使用PEN3 電子鼻頭隨附的數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)執(zhí)行主成分分析。

1.2.12 華夫餅揮發(fā)性成分GC-MS 測定

1.2.12.1 樣品預(yù)處理 根據(jù)LU 等[28]的方法稍加改進(jìn)測量華夫餅氣質(zhì)。稱量1 g 華夫餅粉末到20 mL頂空微萃取樣品瓶中，放入轉(zhuǎn)子中，添加1 g 氯化鈉粉末以促進(jìn)風(fēng)味成分揮發(fā)，蓋上蓋子，插入萃取頭以固定。在磁力攪拌下于60 ℃的恒溫水浴中平衡30 min 后，向下推光纖頭繼續(xù)萃取10 min，清理光纖頭，拔下萃取頭的插頭，然后插入氣相色譜儀的入口。

1.2.12.2 GC 條 件 HP-5MS 毛 細(xì) 管 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣（He）流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；入口溫度250 ℃；升溫程序：柱初始溫度在40 ℃保持2 min，以4 ℃/min 升至160 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min 升至250 ℃，保持5 min。

1.2.12.3 MS 條件 電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；GC-MS 界面溫度280 ℃；四極溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 30~550。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 21 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以±s 表示，通過一元方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行多個組間平均數(shù)的比較，如果組間存在顯著性差異（P＜0.05），則采用Duncan 檢驗進(jìn)行組間多重比較。利用Origin 8.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮原花青素對華夫餅熒光AGEs 抑制率和CML抑制率的影響

目前已發(fā)現(xiàn)的AGEs 有20 種，依據(jù)熒光特性可分為熒光AGEs 和非熒光AGEs，其中，CML 是非熒光AGEs 的重要代表[29]。一方面CML 能與蛋白質(zhì)產(chǎn)生交聯(lián)，進(jìn)而改變一些基質(zhì)蛋白分子的正常功能，另一方面，CML 還能與特異受體結(jié)合，通過生理反應(yīng)來改變蛋白質(zhì)和細(xì)胞功能，從而導(dǎo)致機(jī)體的病理變化[30]。由圖1a 二級質(zhì)譜圖所示，84 m/z 的主離子碎片可以確定LSPC-3 華夫餅樣品中存在確定CML，由圖1b 提取離子流色譜圖所示，可以定量LSPC-3 華夫餅樣品中CML 峰面積，從而計算CML 含量。

圖1 LSPC-3 華夫餅的二級質(zhì)譜圖和提取離子流色譜圖Fig.1 Secondary mass spectrometry and extract ion chromatograpy of LSPC-3 waffle

如圖2 所示，添加不同濃度LSPC 華夫餅中，熒光AGEs 抑制率和CML 抑制率都隨LSPC 濃度的增加而呈上升趨勢，呈現(xiàn)劑量依賴性（熒光AGEs 抑制率的R2=0.993，CML 抑制率的R2=0.997）且有顯著性影響（P＜0.05）。其中，LSPC-4 樣品的熒光AGEs抑制率和CML 抑制率最高，分別為（40.53%±1.43%）、（72.08%±0.79%）。這表明隨華夫餅中LSPC 濃度的增加，LSPC 與華夫餅中蛋白質(zhì)、糖類等發(fā)生作用，因此，美拉德反應(yīng)物一定程度上有所減少，生成的熒光AGEs 含量和CML 含量都相應(yīng)減少，熒光AGEs 抑制率和CML 抑制率增高。同時，LSPC 作為天然抗氧化劑具有抗氧化作用，可以有效抑制美拉德反應(yīng)中的氧化反應(yīng)，從而抑制美拉德反應(yīng)中有害AGEs 的生成。由此可見，在一定濃度范圍內(nèi)，LSPC 濃度越高，其對熒光AGEs 和CML 抑制作用越強(qiáng)，在食品中添加一定濃度的LSPC 可以有效抑制AGEs 的生成。

圖2 不同濃度LSPC 對華夫餅中AGEs 及CML 的抑制率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of LSPC on inhibition rate of AGEs and CML in waffles注：不同小寫字母代表AGEs 抑制率差異顯著（P＜0.05）；不同大寫字母表示CML 抑制率差異顯著（P＜0.05）。

2.2 蓮原花青素對華夫餅總酚含量的影響

LSPC 是植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱[31]。如圖3 所示，添加不同濃度LSPC 華夫餅的總酚含量范圍為9.21~13.23 mg/g。在沒有添加LSPC 的LSPC-0 樣品中仍含有總酚，即華夫餅其本身含有某些種類的酚類物質(zhì)。在加入4.0 mg/g 的LSPC 后，總酚含量出現(xiàn)顯著性增加（P＜0.05）?？偡雍康脑黾又饕鞘Ｓ郘SPC 的量，盡管LSPC 絕大部分被消耗，但是存在一定的剩余。

圖3 不同濃度LSPC 對華夫餅中總酚含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of LSPC on total phenol content in waffles注：不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）；圖4、圖8 同。

2.3 蓮原花青素對華夫餅蓮原花青素消耗率的影響

如圖4 所示，添加不同濃度LSPC 華夫餅中，LSPC 消耗率隨LSPC 濃度增加而呈上升趨勢，呈現(xiàn)劑量依賴性（R2=0.998）且有顯著影響（P＜0.05）。其中，LSPC-4 樣品的消耗率為（88.82%±0.05%），表現(xiàn)最高。結(jié)合圖2 結(jié)論：LSPC 濃度增加，其對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物AGEs 和CML 的抑制效果增強(qiáng)，推測隨LSPC 濃度的增加，與美拉德反應(yīng)物作用的LSPC和抑制美拉德反應(yīng)中氧化反應(yīng)的LSPC 逐漸增加，因此，抑制美拉德反應(yīng)產(chǎn)物AGEs 和CML 生成的能力越強(qiáng)。但同時溫度對LSPC 影響較大，隨加熱時間的延長，LSPC 含量在不同程度上有所降低[32]。因此，LSPC 消耗的原因既可能是由于抑制美拉德反應(yīng)消耗，也可能是由于加熱過程中自身消耗或與其它組分相互作用。

圖4 不同濃度LSPC 對華夫餅中LSPC 消耗率的影響Fig.4 Effect of different concentrations of LSPC on consumption ratio of LSPC in waffles

2.4 蓮原花青素對華夫餅抗氧化活性的影響

糖化過程易產(chǎn)生AGEs，而自由基及氧化應(yīng)激能加速糖基化的進(jìn)程，因此，研究LSPC 對華夫餅中DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、FRAP 鐵離子還原能力以及羥自由基清除能力的影響。

如圖5 所示，在添加一定濃度范圍的LSPC 華夫餅中，DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、FRAP 鐵離子還原能力以及羥自由基清除能力基本呈上升趨勢。其中，最顯著的是DPPH 自由基清除能力，隨LSPC 濃度增加，其顯著增加（P＜0.05）。添加LSPC 后華夫餅的FRAP 鐵離子還原能力以及羥自由基清除能力與未添加LSPC 的華夫餅相比也有顯著差異（P＜0.05）。

圖5 不同濃度LSPC 對華夫餅中抗氧化性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of LSPC on antioxidant properties in waffles注：HRSA 指羥自由基清除率；不同小寫字母表示組間（同一抗氧化指標(biāo)）差異顯著（P＜0.05）。

綜上，抗氧化能力最強(qiáng)的為LSPC-4 樣品組，其總酚含量對應(yīng)也是最高的。這表明，總酚含量與抗氧化能力存在一定的關(guān)系且在本實驗研究呈現(xiàn)出正相關(guān)[33]。這也與其它研究結(jié)果一致：樣品中的DPPH 自由基的清除率與多酚含量呈正相關(guān)關(guān)系，而且關(guān)系極顯著。盡管多酚類物質(zhì)可能與蛋白質(zhì)消化產(chǎn)生肽相互作用，但仍具有較高的清除自由基的能力[34]。因此，多酚物質(zhì)的存在在一定程度上有利于提高華夫餅的抗氧化能力。

同時，抗氧化能力直接影響美拉德反應(yīng)中的氧化反應(yīng)。在實驗濃度范圍內(nèi)，LSPC 濃度越高，其抗氧化能力越強(qiáng)，從而抑制美拉德反應(yīng)中氧化反應(yīng)能力越強(qiáng)，抑制AGEs 生成的能力越強(qiáng)，即AGEs 抑制率越高，與上述實驗結(jié)論也相符。因此，可推測LSPC抑制AGEs 生成的部分機(jī)理可能與酚類物質(zhì)的抗氧化活性提高食品的抗氧化性有關(guān)。

2.5 蓮原花青素對華夫餅水分變化的影響

美拉德反應(yīng)是生成AGEs 的重要途徑，而水分含量、水分活度以及水分存在形式都有可能影響到美拉德反應(yīng)。因而，研究LSPC 的加入對華夫餅體系中水分含量、水分活度以及水分存在形式的影響。

如圖6 所示，添加不同濃度LSPC 后各華夫餅樣品組的水分活度無顯著差異（P>0.05）。這表明在實驗濃度范圍中，LSPC 不影響華夫餅中水分活度。其次，添加高濃度LSPC 的華夫餅樣品LSPC-3和LSPC-4，相較于未添加LSPC 或添加低濃度LSPC 的華夫餅，其水分含量有顯著性下降（P＜0.05）。由此推測，添加LSPC 后，水更易與小分子多酚類物質(zhì)結(jié)合，從而降低水分含量[35]。

圖6 不同濃度LSPC 對華夫餅中水分含量及水分活度的影響Fig.6 Effects of different concentrations of LSPC on water content and water activity in waffles注：不同小寫字母代表水分含量差異顯著（P＜0.05）；不同大寫字母表示水分活度差異顯著（P＜0.05）。

由NMR 原理可知，質(zhì)子所處的化學(xué)環(huán)境不同，其弛豫時間T2的長短便不相同，水分的自由度也不同[36?37]。弛豫時間T2越短表明水與物質(zhì)結(jié)合越緊密，說明質(zhì)子自由度越低，越難排出；弛豫時間T2越長說明質(zhì)子自由度越高，越容易排出，因此，弛豫時間T2可以間接反映水分的相態(tài)特征[38?39]。不同弛豫時間T2波峰所覆蓋的信號幅值，即弛豫時間T2區(qū)間的積分面積可表示各個區(qū)間氫質(zhì)子的相對含量，實現(xiàn)對不同相態(tài)水分的定量測定。弛豫時間T2的變化能夠反映水分子的流動性，因此可以了解添加不同含量LSPC 華夫餅中水分的遷移規(guī)律。

如圖7 所示，華夫餅的T2圖譜中包含多個峰，即說明華夫餅內(nèi)部含有多組分水，其中，0.1~10 ms區(qū)間內(nèi)的峰表示華夫餅中流動性最差的結(jié)合水，10~100 ms 區(qū)間內(nèi)的峰表示華夫餅中的不易流動水，而100~1000 ms 范圍內(nèi)的峰表示華夫餅中可以自由流動的自由水[40]。而且，不易流動水對應(yīng)的信號增幅最大，在實驗濃度范圍，其隨LSPC 濃度增加逐漸下降。這表明，在實驗濃度范圍內(nèi)，不易流動水含量隨LSPC 濃度增大而減少，這與圖6 所示高濃度LSPC華夫餅中水分含量有所下降相吻合。

圖7 不同濃度LSPC 對華夫餅弛豫時間的影響Fig.7 Effects of different concentrations of LSPC on low field NMR in waffles

由上述結(jié)果可知，添加LSPC 對華夫餅中水分活度并無影響，但華夫餅中不易流動水含量有所減少，同時水分含量也相應(yīng)減少。推測LSPC 可能通過影響華夫餅中水分的分布和遷移來影響水分含量，從而影響美拉德反應(yīng)過程以抑制AGEs 的生成。

2.6 蓮原花青素對華夫餅pH 的影響

pH 是美拉德反應(yīng)中的重要影響因素。如圖8所示，添加不同濃度LSPC 的華夫餅中，其pH 無顯著差異（P>0.05），均在7.95~8.00 之間，這與NAVARRO等[41]的研究結(jié)果一致。這表明，添加LSPC 并不影響華夫餅的pH，并非通過改變pH 來抑制美拉德反應(yīng)生成的AGEs。

圖8 不同濃度LSPC 對華夫餅pH 的影響Fig.8 Effects of different concentrations of LSPC on pH in waffles

2.7 蓮原花青素對華夫餅色度的影響

添加LSPC 后的華夫餅肉眼可見顏色有所變化，因此采用色度儀對其進(jìn)行更客觀測量。色度儀中L*表示華夫餅的明暗，L*越小，華夫餅越暗；a*表示華夫餅的紅綠，a*越大，華夫餅紅色越多；b*表示華夫餅的黃藍(lán)，b*越小，華夫餅越藍(lán)。如圖9 所示，在實驗濃度范圍內(nèi)，隨LSPC 的增加，華夫餅顏色更暗、更紅[42]、更藍(lán)，且顏色有顯著差異性（P＜0.05）。這種現(xiàn)象推測是LSPC 雖然會影響美拉德反應(yīng)所產(chǎn)生的褐變產(chǎn)物，從而對華夫餅外觀顏色有一定影響，但LSPC 本身顏色為紅褐色，顏色較深，加入后使華夫餅外觀顏色更偏紅，顏色加深，亮度減暗。

圖9 不同濃度LSPC 對華夫餅色度的影響Fig.9 Effects of different concentrations of LSPC on chroma in waffles注：不同小寫字母表示組間（同一色度指標(biāo)）差異顯著（P＜0.05）。

2.8 蓮原花青素對華夫餅質(zhì)構(gòu)的影響

如表2 所示，對硬度，添加1 mg/g 以上濃度LSPC 華夫餅硬度較未添加和添加0.50 mg/g 濃度LSPC 華夫餅有顯著性降低（P＜0.05），這表明添加較高濃度LSPC 能有效增加華夫餅的柔軟性；對彈性和凝聚性，添加4 mg/g 濃度LSPC 華夫餅有顯著性增加（P＜0.05），這表明高濃度LSPC 華夫餅彈性和凝聚性更好；對膠粘性、咀嚼性、回復(fù)性，添加LSPC 與未添加LSPC華夫餅無顯著性差異（P>0.05），這表明LSPC 對華夫餅的膠粘性、咀嚼性、回復(fù)性無影響。綜上，高濃度華夫餅硬度更小更柔軟，彈性和凝聚性更好，可以認(rèn)為高濃度LSPC 華夫餅品質(zhì)更好。

表2 不同濃度LSPC 華夫餅質(zhì)構(gòu)分析Table 2 Texture analysis of waffles with different concentrations of LSPC

2.9 蓮原花青素對華夫餅電子鼻PCA 的影響分析

電子鼻是一種利用傳感器對樣品中不同氣體成分進(jìn)行分析，能夠感知和識別氣味，進(jìn)行氣味檢測的智能系統(tǒng)，具有類似鼻子的功能[43]。本研究采用的PEN3 型電子鼻是一種金屬氧化物傳感器型的電子鼻，具有10 個金屬氧化物氣體傳感器陣列，如表3所示。

表3 PEN3 型電子鼻傳感器敏感物質(zhì)Table 3 Sensitive substances of PEN3 electronic nose sensor

主成分分析（principal component analysis，PCA）是將研究對象的復(fù)雜多指標(biāo)問題通過特定方式的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)化為簡單且較少數(shù)量綜合指標(biāo)的一種重要統(tǒng)計方法，這些綜合指標(biāo)之間既互不相關(guān)又能最大化提供研究對象原有指標(biāo)所反映的絕大部分信息，并能快速實現(xiàn)模式或關(guān)系的可視化識別。

如圖10 所示，PC1貢獻(xiàn)率為76.93%，PC2貢獻(xiàn)率為21.41%，總貢獻(xiàn)率達(dá)到98.34%，說明PCA 可用于區(qū)分不同含量LSPC 華夫餅的揮發(fā)性氣味。在相同的實驗條件下，不同添加量的LSPC 華夫餅區(qū)分度較明顯，0.5、1.0、2.0 和4.0 mg/g LSPC 華夫餅的氣味呈現(xiàn)一定的聚類現(xiàn)象，但仍能夠有效區(qū)分，且不同含量均在各自區(qū)域，不發(fā)生重疊，說明各組華夫餅之間均存在差異，具有一定的研究價值。電子鼻是一種快速區(qū)分不同揮發(fā)組分風(fēng)味差異的有效工具，但對于不同華夫餅之間風(fēng)味差異物質(zhì)的表征還有待通過固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)一步研究[44]。

圖10 不同濃度LSPC 對華夫餅電子鼻PCA 分析Fig.10 PCA analysis of waffle electronic nose with different concentrations of LSPC

2.10 蓮原花青素對華夫餅揮發(fā)成分氣質(zhì)的GC-MS影響分析

利用GC-MS 在添加不同LSPC 濃度華夫餅中共檢測出36 種揮發(fā)性化合物。如表4 所示，LSPC-0 樣品檢測出12 種揮發(fā)性化合物，其中，酚類物質(zhì)1 種，相對含量為42.66%；醛類物質(zhì)1 種，相對含量為6.86%。LSPC-1、LSPC-2、LSPC-3 和LSPC-4 分別檢測出15 種、7 種、8 種和15 種，均無酚類物質(zhì)和醛類物質(zhì)。這表明，隨LSPC 的添加，使酚類消耗更多，醛類相對含量減少。而醛類物質(zhì)是產(chǎn)生AGEs的前體物質(zhì)，間接說明華夫餅中AGEs 的減少，提高了華夫餅的質(zhì)量安全[45]。酯類化合物是酸、醇在高溫作用下生成的產(chǎn)物, 為華夫餅帶來果香氣和奶氣[46]，添加LSPC 后，酯類含量有一定程度地增加，提高了華夫餅的感官品質(zhì)。

表4 GC-MS 分析風(fēng)味物質(zhì)種類Table 4 Flavor substances analysis by GC-MS

3 結(jié)論

本研究通過添加不同濃度的LSPC 研究LSPC對華夫餅烘焙過程中美拉德反應(yīng)AGEs 的抑制作用及感官品質(zhì)的影響。實驗濃度范圍內(nèi)，隨LSPC 濃度增加，華夫餅中AGEs 的抑制作用及抗氧化作用呈增加趨勢，這表明LSPC 能有效抑制華夫餅中AGEs的形成。感官品質(zhì)上，隨LSPC 濃度的增加，華夫餅色澤逐漸呈棕色，提高食欲。質(zhì)構(gòu)分析表明華夫餅添加LSPC 后硬度下降，彈性和凝聚性增強(qiáng)，口感上更為軟綿香甜。電子鼻PCA 分析和GC-MS 分析結(jié)果顯示，不同LSPC 濃度華夫餅的風(fēng)味存在明顯差異，隨LSPC 濃度增加，酚類、醛類物質(zhì)含量減少，酯類物質(zhì)含量增加。綜上，將LSPC 添加至華夫餅中，不僅提高了華夫餅的抗氧化活性，抑制了美拉德反應(yīng)有害物質(zhì)AGEs 的生成，同時其感官品質(zhì)也有一定程度的提升，這使其可能成為一種未來大眾膳食中的營養(yǎng)選擇。