徐勤茜，張澤宇，陶雪婷，趙梓伶，李子院,2，郝再彬,2，李海云,2,

（1.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林 541004；2.廣西高校食品安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004）

幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-葡糖糖胺以β-1,4 糖苷鍵連接而成的天然多糖和可再生多聚物，廣泛存在于自然界，如無(wú)脊椎動(dòng)物的外骨骼、蝦蟹的外殼、真菌的細(xì)胞壁、線蟲(chóng)卵殼等[1]。幾丁質(zhì)是一類重要的生物資源，但由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、高結(jié)晶度而難溶于水及大多數(shù)有機(jī)溶劑[2?3]，其應(yīng)用受到很大限制而造成巨大的資源浪費(fèi)。幾丁質(zhì)酶是一類能特異性催化幾丁質(zhì)水解的酶[4?6]，其水解產(chǎn)物如幾丁質(zhì)寡糖、N-乙酰氨基葡萄糖等產(chǎn)物[7]具有良好的溶解性、生物相容性以及多種生物活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)[8?10]、食品工業(yè)[11]、農(nóng)業(yè)[12?13]等領(lǐng)域。微生物是幾丁質(zhì)酶的主要來(lái)源，國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行了大量研究[14?17]。盡管如此，尋找產(chǎn)酶性能優(yōu)良的微生物菌株仍是當(dāng)前研究的主要方向之一[18]。

植物內(nèi)生菌是一類生活在健康植物組織內(nèi)部的，不引起宿主植物出現(xiàn)明顯病害癥狀的一類微生物[19]。在與宿主植物長(zhǎng)期共存的過(guò)程中，植物內(nèi)生菌被賦予多種獨(dú)特的生物活性，如能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)[20?22]、廣泛參與宿主次生代謝產(chǎn)物的合成與轉(zhuǎn)化[23?24]等。近年來(lái)，植物內(nèi)生菌的產(chǎn)酶特性及其在生物催化與生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的應(yīng)用也開(kāi)始受到人們的重視[25]。例如利用內(nèi)生菌產(chǎn)葡萄糖苷酶對(duì)虎杖苷[26?27]、人參皂苷[28]的生物轉(zhuǎn)化；Harwoko 等[29]從柳葉分離出的真菌能夠?qū)χ参镅苌念慄S酮進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)；陳智慧等[30]從花魔芋實(shí)生種子中篩選出一株具有良好的酶學(xué)性質(zhì)的產(chǎn)β-甘露聚糖酶內(nèi)生菌。

酸橙（Citrus aurantiumL.）又稱苦橙，其濃縮果汁含有豐富的黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎癥等多種生物活性[31]。目前尚未見(jiàn)有酸橙內(nèi)生菌的研究報(bào)道。為進(jìn)一步尋找產(chǎn)幾丁質(zhì)酶性能優(yōu)良、實(shí)用潛力大的微生物菌株，課題組前期對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酸橙內(nèi)生菌進(jìn)行了分離篩選，獲得一株產(chǎn)酶性能較好的Bacillus thuringiensisBt028 菌株。本文對(duì)該菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為后期幾丁質(zhì)酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、實(shí)際應(yīng)用等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸橙 采自桂林永福蘇橋鎮(zhèn)，新鮮酸橙果實(shí)；酸橙內(nèi)生菌Bacillus thuringiensisBt028 分離自酸橙果實(shí)，保存于桂林理工大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室；幾丁質(zhì)、3，5-二硝基水楊酸、β-D-N-乙酰氨基葡萄糖 分析純，購(gòu)于上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；硫酸鎂、硫酸亞鐵 分析純，購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠；蛋白胨、酵母粉、瓊脂磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、結(jié)晶亞硫酸鈉、磷酸分析純，購(gòu)于西隴化工股份有限公司；Bt 平板活化培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂15 g/L；幾丁質(zhì)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)10 g/L、酵母粉10 g/L、K2HPO40.7 g/L、KH2PO40.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7 H2O 0.01 g/L，pH 7.0。

LRH-150-Z 振蕩培養(yǎng)箱 珠江留關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；BX30R 立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；CJ-ISFS 醫(yī)療設(shè)備超工作臺(tái) 天津市泰斯特儀器有限公司；VIS-7220N 可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器有限公司；HH-S2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；ZXRD-B5110 鼓風(fēng)干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體幾丁質(zhì)的制備 將幾丁質(zhì)粉碎過(guò)100 目篩即得細(xì)粉幾丁質(zhì)，參考文獻(xiàn)方法[32]，稱取25 g 細(xì)粉幾丁質(zhì)，加250 mL 85%磷酸，30 ℃反應(yīng)1 d，然后加蒸餾水使膠體沉淀后，反復(fù)水洗直至中性。用0.02 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH=6.0）調(diào)整終溶度至10%，4 ℃保存。

1.2.2 培養(yǎng)條件對(duì)Bt028 菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響斜面保存的Bacillus thuringiensisBt028 經(jīng)平板培養(yǎng)活化24 h 后，挑取一環(huán)接入100 mL 幾丁質(zhì)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中（250 mL 三角瓶），在溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min 的搖床上振蕩培養(yǎng)24 h，即為種子液，此時(shí)為菌株生長(zhǎng)時(shí)間。將種子液按照3%的接種量接入到裝有100 mL pH7.0 的幾丁質(zhì)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)48 h，此時(shí)為菌株產(chǎn)酶時(shí)間。發(fā)酵液在4 ℃、12000 r/min 條件下離心10 min，收集上清液即為粗酶液，4 ℃冰箱儲(chǔ)存，用于幾丁質(zhì)酶酶活的測(cè)定。

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 按上述搖瓶培養(yǎng)方法，分別考察碳源種類（粉末幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)、淀粉、乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖）、碳源濃度（0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、氮源種類（酵母浸粉、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉）、氮源濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%、3%）、初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、培養(yǎng)溫度（20、25、30、35、40、45 ℃）、接種量（0.5%、1%、2%、3%、4%）、裝液量（50、75、100、125、150 mL/250 mL）、搖床轉(zhuǎn)速（100、120、140、160、180、200 r/min）、生長(zhǎng)時(shí)間（12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h）、產(chǎn)酶時(shí)間（12、24、36、48、60、72、84、96 h）等因素對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響，以碳源種類為第一因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，其他條件為碳源濃度1%、氮源種類蛋白胨、氮源濃度1.0%、初始pH7.0、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量3%、裝液量100 mL/250 mL、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min）、生長(zhǎng)時(shí)間48 h、后續(xù)因素的實(shí)驗(yàn)均在前一因素實(shí)驗(yàn)的較優(yōu)結(jié)果上進(jìn)行。

1.2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇3 個(gè)對(duì)酶活影響較顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design-Expert 進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共計(jì)17 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)選取的因素和水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素和水平編碼值Table 1 Test factors and level coding values

1.2.3 幾丁質(zhì)酶酶活的測(cè)定 參考戴德慧等[33]方法并加以改進(jìn)，分別吸取5 mmol/Lβ-D-N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 于1、2、3、4、5 號(hào)試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1 mL，再加入1 mL DNS試劑，混勻后沸水浴中煮沸5 min，冷卻后用蒸餾水稀釋至10 mL，以1 號(hào)試管為對(duì)照，測(cè)定540 nm 波長(zhǎng)處吸光度，以A540為縱坐標(biāo)、β-D-N-乙酰氨基葡萄糖濃度C（mmol/L）為橫坐標(biāo)繪制β-D-N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A540=0.0074C-0.03（R2=0.9987）。

粗酶液酶活測(cè)定[33]：取0.5 mL 粗酶液與0.5 mL含1.0%膠體幾丁質(zhì)的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH7.0）混合，50 ℃保溫20 min 后，沸水浴10 min，冷卻后加入1 mL DNS 試劑，在沸水中煮沸5 min 后用蒸餾水稀釋至10 mL，以粗酶液加磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH7.0）為對(duì)照，按上法測(cè)定β-D-N-乙酰氨基葡萄糖濃度，并計(jì)算幾丁質(zhì)酶酶活。

幾丁質(zhì)酶酶活單位定義為：在50 ℃，pH=7.0 的條件下，每分鐘催化幾丁質(zhì)生成相當(dāng)于l μmolβ-DN-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次，利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)并進(jìn)行結(jié)果分析，采用SPSS 軟件分析數(shù)據(jù)的顯著性，利用Origin 以及Excel 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析并進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對(duì)Bt028 菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響

2.1.1 不同碳源對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響本實(shí)驗(yàn)研究了7 種不同碳源對(duì)菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響，由圖1 可知，采用這7 種碳源發(fā)酵培養(yǎng)基所獲得的幾丁質(zhì)酶酶活有著很明顯的差異。其中以幾丁質(zhì)作為碳源時(shí)，菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的活力遠(yuǎn)高于其他碳源；同濃度的膠體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的性能又優(yōu)于粉末幾丁質(zhì)，其余5 種碳源培養(yǎng)基所得到的發(fā)酵液酶活明顯不如前者，故表明膠體幾丁質(zhì)是誘導(dǎo)Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳碳源。

圖1 碳源種類對(duì)幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.1 Effects of carbon sources on synthesis of chitinase注：不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）；圖2~圖11 同。

2.1.2 膠體幾丁質(zhì)濃度對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 以膠體幾丁質(zhì)為碳源，考察其濃度對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響。圖2 結(jié)果顯示，隨著膠體幾丁質(zhì)濃度的增加酶活力逐漸上升，在濃度為1%時(shí)達(dá)到最高，與其他膠體幾丁質(zhì)濃度下幾丁質(zhì)酶活性存在顯著性差異（P＜0.05）。在此基礎(chǔ)上增加培養(yǎng)基中幾丁質(zhì)的濃度，產(chǎn)酶能力反而下降。這說(shuō)明Bt028不僅對(duì)碳源的種類有著專一的要求，而且對(duì)碳源的濃度也比較嚴(yán)格，在膠體幾丁質(zhì)濃度小于0.5%的條件下，產(chǎn)酶能力迅速降低。當(dāng)膠體幾丁質(zhì)濃度高于1%，隨著其濃度的增加，酶活不斷降低。幾丁質(zhì)含有的大量羥基和氨基具有很強(qiáng)的吸附能力[34]，當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)酶會(huì)被吸附在幾丁質(zhì)上從而降低了離心后上清液的酶活。

圖2 膠體幾丁質(zhì)濃度對(duì)幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.2 Effect of colloidal chitin concentration on the synthesis of chitinase

2.1.3 氮源種類對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響細(xì)菌可利用的氮源可分為有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮。將Bt028菌種液接種于含不同氮源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，測(cè)定幾丁質(zhì)酶活，結(jié)果如圖3 所示，添加的幾種有機(jī)氮源酵母浸粉、蛋白胨、酵母粉均能提高產(chǎn)酶能力，其中酵母粉的效果最明顯，銨鹽、硝酸鹽等無(wú)機(jī)氮源則使產(chǎn)酶能力有不同程度下降，故酵母粉這種有機(jī)氮源更容易被利用，從而提高產(chǎn)酶能力。從酶活的大小來(lái)看，有機(jī)氮（酵母浸粉、蛋白胨、酵母粉）明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮（硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉），表明菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶合成對(duì)氮源的種類具有選擇性。

圖3 氮源種類對(duì)幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on chitinase synthesis

2.1.4 酵母粉濃度對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 以酵母粉為氮源，考察其濃度對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響，結(jié)果如圖4 所示。結(jié)果表明，當(dāng)酵母粉濃度為1%時(shí)，菌株Bt028 發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶酶活最高。當(dāng)?shù)礉舛雀哂?%時(shí)，隨著底物濃度的升高使得溶液的粘稠度增加，影響酶的作用，因此酶活迅速降低，故酵母粉濃度以1%為最佳。

圖4 酵母粉濃度對(duì)幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.4 Effect of yeast powder concentration on chitinase synthesis

2.1.5 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 微生物各項(xiàng)生命活動(dòng)都與酶反應(yīng)息息相關(guān)，pH直接影響各種酶活力，在最適pH 條件下，才可能發(fā)揮最佳酶活。將Bt028 菌株接種于初始pH 不同的產(chǎn)酶培養(yǎng)液中，測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)培養(yǎng)基pH 為5.5 時(shí)，與pH7.0 時(shí)酶活相比，幾丁質(zhì)酶酶活顯著降低（P＜0.05）；當(dāng)pH 大于5.5 時(shí)，酶活不斷提高，pH 為7.0 時(shí)，幾丁質(zhì)酶酶活最高，且與其他pH 下幾丁質(zhì)酶活存在顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表明菌株Bt028 產(chǎn)酶最佳的初始pH 為7.0，該菌株適合在中性環(huán)境下生長(zhǎng)代謝。

圖5 初始pH 對(duì)幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.5 Effect of initial pH on chitinase synthesis

2.1.6 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響發(fā)酵溫度主要影響細(xì)胞產(chǎn)生酶的活力，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低酶活；只有發(fā)酵溫度適宜時(shí)，菌株才會(huì)最大限度利用培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。將Bt028 菌株接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別在不同溫度下培養(yǎng)，測(cè)定酶活力。結(jié)果見(jiàn)圖6，當(dāng)培養(yǎng)溫度為20~30 ℃時(shí)，酶活隨溫度的升高而增加；當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)，酶活開(kāi)始急劇下降。因此，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到30 ℃左右時(shí)，菌株生長(zhǎng)代謝所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性最高，且與其他幾個(gè)溫度下幾丁質(zhì)酶酶活顯著性差異（P＜0.05）。

圖6 溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.6 Effect of temperature on chitinase synthesis

2.1.7 接種量對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 如圖7 所示，當(dāng)接種3%菌種液時(shí)，酶活力最高為10.11 U/mL；在接種量低于3%時(shí)，隨著接種量的升高，幾丁質(zhì)酶活不斷提升；當(dāng)接種量大于3%時(shí)酶活下降，是由于接種量過(guò)大導(dǎo)致瓶?jī)?nèi)菌株大量繁殖，過(guò)快消耗瓶?jī)?nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，導(dǎo)致菌體停止合成分泌幾丁質(zhì)酶甚至死亡，使酶活降低，因此最佳接種量為3%。

圖7 接種量對(duì)幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on chitinase synthesis

2.1.8 裝液量對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 圖8表明，當(dāng)裝液量為50~100 mL/250 mL時(shí)，菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酶活緩慢上升，到100 mL/250 mL達(dá)到最高，這是因?yàn)檠b液量較少，發(fā)酵液中溶氧量充足；但當(dāng)裝液量超過(guò)100 mL/250 mL 時(shí)，搖瓶?jī)?nèi)溶氧不足，從而使菌株代謝受到抑制，發(fā)酵液活性反而降低，由此說(shuō)明最適裝液量為100 mL/250 mL。

圖8 裝液量對(duì)幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.8 Effect of liquid loading on chitinase synthesis

2.1.9 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響搖床轉(zhuǎn)速影響到發(fā)酵液中氧氣的溶解量以及底物、產(chǎn)物的傳質(zhì)過(guò)程。如圖9 所示，搖床轉(zhuǎn)速在150~200 r/min 范圍內(nèi)，酶活力呈現(xiàn)先升高后減小，在轉(zhuǎn)速達(dá)到180 r/min 時(shí)，測(cè)得的酶活力達(dá)到最高。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在100~150 r/min 時(shí)，酶活力隨著轉(zhuǎn)速的增加不斷升高，轉(zhuǎn)速低導(dǎo)致培養(yǎng)液中的溶氧率太低，而高轉(zhuǎn)速提供的通氣量能較好地滿足菌體生成的需求；當(dāng)轉(zhuǎn)速高于180 r/min 時(shí)，雖然培養(yǎng)液中的通氣量得到提升，但過(guò)高的振蕩速率會(huì)菌體產(chǎn)生影響，不利于菌體和底物的接觸，影響了菌株的生長(zhǎng)，從而使得菌株產(chǎn)酶能力的降低，故Bt028 的最優(yōu)搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.9 Effect of table speed on chitinase synthesis

2.1.10 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株Bt028 生長(zhǎng)和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 圖10（a）為條件優(yōu)化后的菌株生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明培養(yǎng)36 h 內(nèi)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體濃度迅速提高并達(dá)到最大值；在36~72 h，由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝產(chǎn)物積累等不利因素的影響，細(xì)菌繁殖速度漸趨下降，故菌體生長(zhǎng)曲線在36~72 h 時(shí)逐漸下降，在72 h 后趨于穩(wěn)定。菌株Bt028 培養(yǎng)過(guò)程中酶活隨時(shí)間的變化如圖10（b）所示。在前36 h，Bt028 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，該時(shí)期主要是菌株利用營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行繁殖生長(zhǎng)，幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量較少；在36~48 h期間，隨著菌體的快速增殖以及培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的減少，菌株開(kāi)始迅速分泌幾丁質(zhì)酶并在48 h 左右達(dá)到最大，之后酶活力開(kāi)始下降并趨于穩(wěn)定。因此菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)時(shí)間確定為48 h。

圖10 Bt028 生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線Fig.10 Growth curve and enzyme production curve of Bt028注：a 為Bt028 生長(zhǎng)曲線；b 為Bt028 產(chǎn)酶曲線。

2.2 菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 回歸模型建立及方差分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)中對(duì)菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶影響相對(duì)較大的3 個(gè)因素：膠體幾丁質(zhì)的濃度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH 對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。以膠體幾丁質(zhì)濃度（A）、培養(yǎng)溫度（B）、培養(yǎng)基初始pH（C）3 因素為自變量，以幾丁質(zhì)酶活力為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3 因素3 水平共17 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，分為12 個(gè)析因點(diǎn)和5 個(gè)零點(diǎn)。試驗(yàn)因素水平選取見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

該響應(yīng)面模型的顯著性檢驗(yàn)和方差分析結(jié)果（見(jiàn)表3）顯示，該回歸模型的P值＜0.01，而失擬項(xiàng)的P值>0.05，證明模型建立成功；從表中P值可以看出其自變量B 對(duì)響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.05），自變量A、C、BC、A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），AB、AC 影響不顯著（P>0.05）；回歸系數(shù)R2=99.65%大于90%，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9921>0.9，表明模型相關(guān)度很好；本試驗(yàn)的變異系數(shù)為1.03%，說(shuō)明模型擬合較好；本模型精密度為45.594>4.0，說(shuō)明膠體幾丁質(zhì)含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH 對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力影響的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，此模型可用來(lái)分析和預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。各因素對(duì)蘇云金芽孢桿菌Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酶活力影響的二次回歸模型編碼方程為：

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

酶活力(U/mL)=10.40?0.33A?0.18B+0.43C+0.09 AB+0.09AC+0.23BC?0.45A2?1.34B2?1.072C2。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析 對(duì)各因素對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的交互影響進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見(jiàn)圖11~圖13。響應(yīng)面圖表明了實(shí)驗(yàn)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，由圖11~圖13 可以看出，三個(gè)因素兩兩之間的交互作用響應(yīng)面曲面均呈凸起趨勢(shì)，說(shuō)明存在最大響應(yīng)值。運(yùn)用Design-Expert12.0 軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)最佳發(fā)酵條件為膠體幾丁質(zhì)0.839%、培養(yǎng)溫度29.615 ℃、培養(yǎng)基初始pH6.9155，幾丁質(zhì)酶活力理論值為10.50 U/mL。

圖11 膠體幾丁質(zhì)濃度和溫度交互作用對(duì)幾丁質(zhì)酶活影響的曲面圖及等高線Fig.11 Response surface polt and contour polt showing the effects of interactions of colloidal chitin concentration and temperature on chitinase activity

圖12 溫度和pH 交互作用對(duì)幾丁質(zhì)酶活影響的曲面圖及等高線Fig.12 Response surface polt and contour polt showing the effects of interactions of temperature and pH on chitinase activity

圖13 膠體幾丁質(zhì)濃度和pH 交互作用對(duì)酶活力影響的曲面圖及等高線Fig.13 Response surface polt and contour polt showing the effects of interactions of colloidal chitin concentration and pH on chitinase activity

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 在考慮到實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作的基礎(chǔ)上，對(duì)模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，將軟件分析得出的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)整：膠體幾丁質(zhì)0.8%、酵母粉1%、發(fā)酵溫度30 ℃、初始pH6.9、轉(zhuǎn)速為180 r/min、裝液量100 mL/250 mL、接種量3%、發(fā)酵時(shí)間48 h，3 次平行實(shí)驗(yàn)所得幾丁質(zhì)酶的平均酶活為10.48±0.28 U/mL，與理論值10.50 U/mL 接近，表明響應(yīng)面法所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)最終確定了Bt028 產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)基組成為：膠體幾丁質(zhì)0.8%、酵母粉1%；最適產(chǎn)酶條件為初始pH 為6.9、接種量3%、裝樣量100 mL/250 mL、溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h。在此條件下，該菌株酶活最高可達(dá)到10.48 U/mL，較篩選時(shí)的3.56 U/mL 提高了1.94 倍。通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，本文篩選的Bt028 菌株從培養(yǎng)24 h 后開(kāi)始大量產(chǎn)酶，在48 h 時(shí)達(dá)到最大值，說(shuō)明該菌株有良好的產(chǎn)酶性能，具有較高的產(chǎn)酶效率，應(yīng)用潛力較大，為幾丁質(zhì)酶的生產(chǎn)應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。本文僅對(duì)該菌株的實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究，對(duì)于該菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的工業(yè)生產(chǎn)工藝、酶的分離純化、酶的催化特性及其在食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用等還有待于進(jìn)一步深入研究。