趙崢，周德平，褚長彬，王慶峰，吳淑杭

（上海市農業(yè)科學院生態(tài)環(huán)境保護研究所，上海 201403）

農業(yè)廢棄物的資源化循環(huán)利用是近年來國內外研究的熱點問題[1-2]。以果蔬廢棄物、畜禽糞便和秸稈等農業(yè)廢棄物為原材料，通過堆肥或發(fā)酵的方式實現其資源化循環(huán)利用，是目前處理農業(yè)廢棄物的主要手段[3-4]。水果廢棄物是一種潛力巨大的農業(yè)可再生資源，其水分含量高，同時富含各類多糖、纖維素以及營養(yǎng)元素，是用于發(fā)酵制備或提取各類增值產物的理想原材料[5]。例如，可利用水果廢棄物為原材料，在低溫條件下添加酵母菌進行發(fā)酵來制備果膠酶[6]；以香蕉廢棄物和柑橘皮等為主要原料，通過添加酵母菌促進發(fā)酵并優(yōu)化發(fā)酵參數，在制備生物酒精方面具有較大潛力[7-8]；而在添加真菌的條件下進行蘋果和葡萄廢棄物的混合發(fā)酵則可用于酚類抗氧化劑的制備[9]。此外，相關研究表明釀酒副產物葡萄皮渣也是一種重要的可再利用資源，將其在不同條件下進行二次發(fā)酵可用于花青素和琥珀酸等活性物質的提取[10-11]，以及生物炭和生物肥料等農業(yè)增值產品的制備[12]。然而，目前有關葡萄廢棄物的研究多集中于葡萄加工過程產生的葡萄皮渣的再利用，而關于葡萄生產過程中所產生的葡萄鮮果廢棄物再利用方面的研究則報道較少。

葡萄是上海郊區(qū)主要栽培的果樹樹種之一，種植面積約為5 267 hm2，約占上海果樹總種植面積的1/4[13]。前期調查表明，上海郊區(qū)葡萄生產過程中產生的廢果量較大，某些葡萄園中廢果率可超過當季葡萄總產量的30%，給果農造成了嚴重的經濟損失。這些葡萄殘次果多因惡劣的天氣條件（雨水較多）、病蟲害以及田間管理（疏花疏果等）而產生，由于達不到銷售標準，殘次果通常被直接丟棄在葡萄園中，這不僅是農業(yè)生產資源的浪費，同時也極易滋生病蟲害并導致傳播，進而影響葡萄的清潔高效生產[14]。葡萄生產因其較大的種植面積和較高的經濟效益，在上海現代都市農業(yè)中具有非常重要的地位。因此，探索一種環(huán)保高效的葡萄廢果資源化循環(huán)利用技術，是目前上海葡萄產業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟需解決的問題。

本研究以上海郊區(qū)規(guī)模化葡萄園產生的鮮葡萄廢果為原材料，通過添加原位分離的酵母菌進行厭氧發(fā)酵，同時分析含有葡萄皮和籽粒是否會對發(fā)酵過程及發(fā)酵產物活性物質成分組成產生影響，以為發(fā)酵產物的后續(xù)應用及相關產品研發(fā)提供基礎數據支撐，也為葡萄廢果的資源化循環(huán)利用提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 葡萄廢果

本研究所用的葡萄廢果原材料由上海馬陸葡萄主題公園提供。馬陸葡萄主題公園位于上海葡萄主產區(qū)——嘉定區(qū)，是上海郊區(qū)最具代表性的葡萄規(guī)?；a基地。該葡萄園每年夏天由于達不到銷售標準而產生的葡萄廢果約占葡萄總產量的20%～30%，這些葡萄廢果通常仍具有較好的品質，是進行葡萄廢果發(fā)酵的良好原材料。2018 年8 月在葡萄園收集葡萄廢果50 kg，帶回實驗室后剔除其中的枝干和雜物等，用水清洗干凈后手工捏碎，使其在發(fā)酵過程中更易于分解。

1.2 菌種

本研究以酵母菌作為啟動菌種來提高葡萄廢果的發(fā)酵效率，所接種的酵母菌分離自馬陸葡萄園中的葡萄廢果堆積點，經鑒定為魯氏酵母（CGMCC16260）。發(fā)酵前將魯氏酵母在平板上進行活化培養(yǎng)，挑取單菌落接種到YPD 肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)18 h，之后在37 ℃厭氧條件下再次傳代培養(yǎng)18 h，獲得菌種活力較高的魯氏酵母菌液備用。

1.3 實驗設計

在前期研究中發(fā)現，葡萄廢果經過2～3 個月的厭氧發(fā)酵后葡萄皮和籽粒較難被分解，因此，本研究共設置了兩種處理，用于考察不同葡萄廢果成分（是否含有葡萄皮和籽粒）對發(fā)酵過程及發(fā)酵產物的成分組成的影響。具體實驗處理為：T1 處理，發(fā)酵底物為前處理好的葡萄廢果全部成分，包含葡萄的果肉、皮和籽粒；T2 處理，剔除葡萄皮和葡萄籽，僅用葡萄果肉進行發(fā)酵；兩種處理均設置3 次重復，其他發(fā)酵條件相同。發(fā)酵的基本流程為：將1.5 kg 處理好的葡萄廢果放入6 L 發(fā)酵桶中；加入0.5 kg 紅糖作為微生物的碳源；向發(fā)酵桶中補充蒸餾水至5 L；調整發(fā)酵體系的pH 值至4.50；將200 mL 酵母菌培養(yǎng)液接種到發(fā)酵桶中，攪拌均勻后開始發(fā)酵。發(fā)酵桶蓋上裝有單向排氣閥，以便于發(fā)酵過程中產生氣體的排出，同時保證厭氧的發(fā)酵環(huán)境。發(fā)酵第一周，每日打開1 次發(fā)酵桶蓋，攪拌均勻以促進排氣，防止發(fā)酵桶中產氣過剩發(fā)生爆裂；一周后每周打開1 次發(fā)酵桶蓋進行攪拌，直至發(fā)酵結束（約2個月）。

1.4 發(fā)酵產物成分分析

在發(fā)酵過程中，每周測定發(fā)酵體系的pH 值和電導率（EC）值，其中pH值用pH計（Mettler Toledo FE20）測定，EC值用EC計（MettleR Toledo FE30）測定。發(fā)酵結束后，測定發(fā)酵產物中游離氨基酸、主要陰陽離子以及其他有效物質的含量。其中，游離氨基酸含量采用全自動高速氨基酸分析儀測定（日本，Hitachi）；主要陰陽離子含量采用離子色譜儀測定（德國，Thermo Fisher）；有效氮含量采用堿性水解擴散法測定；總酚含量采用福林比色法測定；總酸含量采用酸堿滴定法測定。發(fā)酵前，對底物的相關指標進行測定，用于分析發(fā)酵前后的性狀差異。T1和T2處理發(fā)酵前的總游離氨基酸含量分別為85.32μg·mL-1和103.87μg·mL-1，有效氮含量分別為85.41 mg·L-1和78.33 mg·L-1，總酚含量分別為405.51 mg·L-1和397.98 mg·L-1，總酸含量分別為86.12 g·kg-1和73.45 g·kg-1。

1.5 數據分析

兩處理之間的顯著性差異檢驗采用t檢驗在0.05水平進行（SPSS Statistics 23）；圖表采用Origin 9.0繪制。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中pH值和EC值的動態(tài)變化

pH 值是影響發(fā)酵過程的關鍵因素，同時也是反映發(fā)酵活躍程度的重要指標。不同葡萄廢果成分發(fā)酵過程中pH 值的動態(tài)變化如圖1 所示，兩種處理的pH 值動態(tài)變化規(guī)律基本一致，均在第1 周急劇下降，然后緩慢升高，在第6周后趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵前2周，兩種處理的pH 值較為接近，第2 周后含有葡萄皮和葡萄籽的T1 處理的pH 值明顯低于僅含葡萄果肉的T2處理。在發(fā)酵第4周，T1和T2處理的pH 值分別為3.81 和4.10，而 在 第8 周，二者分別穩(wěn)定在3.95 和4.12。與pH 值的變化規(guī)律不同，葡萄廢果發(fā)酵過程中EC 值的動態(tài)變化呈現出先升高后降低的趨勢（圖2），在整個發(fā)酵過程中，T1 和T2 處理EC 值的差異較小。在發(fā)酵的第2 周，T1 和T2 處理的EC 值達到峰值，分別為5.22 mS·cm-1和4.91 mS·cm-1，之后急劇下降，從第3 周開始分別穩(wěn)定在3.50 mS·cm-1和3.28 mS·cm-1左右。

圖1 葡萄廢果發(fā)酵過程pH值的動態(tài)變化Figure 1 Dynamic variations of pH value during the fermentation process of grape waste

圖2 葡萄廢果發(fā)酵過程EC值的動態(tài)變化Figure 2 Dynamic variations of EC value during the fermentation process of grape waste

2.2 發(fā)酵產物中游離氨基酸的含量

游離氨基酸是葡萄廢果發(fā)酵產物中主要的活性成分之一，同時也是后續(xù)開發(fā)功能性肥料產品的核心指標。發(fā)酵產物中16 種游離氨基酸的含量如圖3 所示，去除葡萄皮和籽粒后葡萄廢果發(fā)酵產物中游離氨基酸的含量有明顯提升，與T1 處理相比，T2 處理在13 類游離氨基酸的含量上具有優(yōu)勢，包括Asp、Thr、Glu、Gly、Val、Cys、Met、Ile、Leu、Phe、g-ABA、Orn 和Lys，其中9類氨基酸含量具有顯著差異（P＜0.05）。T1處理僅在Ser、Ala和Tyr 3類游離氨基酸的含量上具有優(yōu)勢，其中Ser 的含量顯著高于T2 處理（P＜0.05）。從總游離氨基酸的含量來看，T2 處理比T1 處理高出40.64%；與發(fā)酵前相比，T1 處理的總游離氨基酸含量提升了226.05%，T2處理則提升了276.66%。

圖3 不同葡萄廢果成分發(fā)酵產物中游離氨基酸的含量Figure 3 Free amino acids contents in the fermented products with different grape parts

2.3 發(fā)酵產物中主要離子的含量

無機鹽離子是植物營養(yǎng)元素的重要來源，發(fā)酵產物中各類離子的含量是決定發(fā)酵產物可再利用價值的關鍵。葡萄廢果發(fā)酵產物中5 種陽離子的含量如圖4 所示，可以看出發(fā)酵產物中K+的含量最高，達992.41～1 083.33 mg·L-1，而NH+4的含量最低，為10.75～18.89 mg·L-1，兩種處理之間5種陽離子的含量均無顯著差異（P＞0.05）。兩種處理之間5種陰離子的含量如圖5 所示，葡萄廢果發(fā)酵產物中Cl-的含量最高，為543.46～577.82 mg·L-1，而NO-3的含量最低，為23.01～26.30 mg·L-1。兩種處理之間僅在F-的含量上有顯著差 異，T1 處理（283.43 mg·L-1）顯 著高 于T2 處 理（184.99 mg·L-1）（P＜0.05）。

圖4 不同葡萄廢果成分發(fā)酵產物中陽離子的含量Figure 4 Positive ions contents in the fermented products with different grape parts

圖5 不同葡萄廢果成分發(fā)酵產物中陰離子的含量Figure 5 Negative ions contents in the fermented products with different grape parts

2.4 發(fā)酵產物中總有效氮、總酚和總酸的含量

葡萄廢果發(fā)酵產物中總有效氮、總酚和總酸的含量結果見圖6，不同葡萄廢果成分的處理在發(fā)酵產物總有效氮的含量上沒有顯著差異，T1 和T2 處理的總有效氮含量較發(fā)酵前分別提高了31.13%和40.75%。T2 處理的發(fā)酵產物中總酚和總酸的含量均顯著低于T1 處理（P＜0.05），與發(fā)酵前相比，T1 處理的總酚和總酸含量分別提高了25.56%和3.08%，而T2 處理則比發(fā)酵前分別降低了10.46%和5.69%。

圖6 不同葡萄廢果成分發(fā)酵產物中總有效氮、總酚和總酸的含量Figure 6 Total available nitrogen，total phenol and total acids contents in the fermented products with different grape parts

3 討論

在厭氧條件下，通過添加有益菌（酵母菌或乳酸菌等）或功能微生物將果蔬及其廢棄物進行發(fā)酵，提高發(fā)酵產物中有效成分和活性物質的含量，并在不同的領域進行應用，是目前提高果蔬廢棄物再利用價值的有效手段[15]。本研究以上海郊區(qū)規(guī)?；咸褕@中產生的葡萄殘次果為原材料，添加原位分離的酵母菌在厭氧條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵產物中具有豐富的游離氨基酸、營養(yǎng)元素、有效氮及酚類物質，有較高的再利用價值，可作為液體肥料在農業(yè)生產過程中施用，是一種葡萄廢果資源化循環(huán)利用的潛在途徑。諸多研究表明，水果廢棄物具有特殊的理化性狀，是通過發(fā)酵進行資源化循環(huán)利用的良好原材料。葛瑞宏等[16]以桂圓作為原材料，通過添加保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌等制備的桂圓發(fā)酵產物具有良好的抗氧化活性；李杰等[17]以核桃青皮和果蔬廢棄物為原材料制備的發(fā)酵產物中含有豐富的超氧化物歧化酶、礦物質元素、多酚和黃酮類物質；董銀卯等[18]以火龍果為原材料制備的發(fā)酵產物具有很強的抗氧化能力，同時也含有一定的超氧化物歧化酶、淀粉酶和脂肪酶；馮昕煒等[19]利用釀酒副產物葡萄渣為原料，通過添加酵母菌進行二次發(fā)酵，制備的產物中粗蛋白、磷和鈣等營養(yǎng)成分含量大幅度增加，有效提高了葡萄渣的再利用價值。此外，藍莓、蘋果和葡萄等也是厭氧發(fā)酵的良好原材料，有研究表明這些水果廢棄物的發(fā)酵產物中含有豐富的有機酸，如琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸和酒石酸等，具有較高的可再利用價值[20-22]。

不同底物成分是影響果蔬廢棄物發(fā)酵產物活性物質成分組成以及進一步應用的關鍵因素[23-25]。本研究設置的兩種實驗處理中，含有葡萄皮和葡萄籽的T1處理發(fā)酵過程的pH值更低，這與發(fā)酵產物中T1處理有更高的總酸含量相符。而去除葡萄皮和葡萄籽的T2 處理發(fā)酵產物中總酚含量降低，這可能與葡萄皮和葡萄籽的主要成分有關，葡萄皮的主要成分為花青素，同時其也含有豐富的白藜蘆醇（酚類）[26]，而葡萄籽則以油脂類和蛋白質為主，同時也有一定量的酚類、不飽和脂肪酸以及黃酮類物質[27-28]，因此，去除葡萄皮和葡萄籽后勢必會導致發(fā)酵產物中總酚含量的降低。與此相反，T2處理的發(fā)酵產物在9種游離氨基酸和總游離氨基酸含量上表現出了顯著優(yōu)勢，可能是由于葡萄的果肉比果皮和籽粒更易于分解，經有益微生物的分解代謝作用后，更多的氨基酸以游離態(tài)的形式被釋放到了發(fā)酵產物中，從而有效提高了游離氨基酸的含量。

此外，葡萄廢果發(fā)酵產物中還含有豐富的礦物質元素離子，例如Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH+4、NO-3、PO3-4等，這些均是植物生長過程中所需的重要營養(yǎng)元素，因此，將葡萄廢果經厭氧發(fā)酵制成肥料產品也具有良好的應用前景，這也是本研究的最終目的。相關研究表明，葡萄酒糟中含有豐富的氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素，經二次堆積漚制后在葡萄園中施用，不僅能改善土壤結構、產生良好的肥效，同時對促進葡萄生長和提高果實品質也有明顯作用[29]。葡萄酒糟中也含有豐富的中微量元素，因此可作為功能性產品進行開發(fā)利用，作為農業(yè)常規(guī)施肥的輔助手段補充土壤中微量元素的虧缺。葡萄酒糟經二次發(fā)酵后制成的有機肥或有機無機復混肥，在經濟作物和大田作物中施用均表現出了良好的效果，優(yōu)于傳統復合肥和有機肥，在改善農作物產量和品質的同時也具有一定的改土培肥效果[30-31]。然而，這些研究多以葡萄酒渣為原材料進行相關肥料產品的開發(fā)和應用，目前以新鮮葡萄廢果為原料進行發(fā)酵研究并制備相關肥料產品的報道較少。本研究也僅對葡萄廢果發(fā)酵產物的成分進行了初步分析，為發(fā)酵產物的進一步應用和相關產品研發(fā)提供了一定的數據基礎，發(fā)酵產物在農業(yè)生產中的實際應用效果還有待進一步驗證。

4 結論

（1）添加酵母菌可顯著提高葡萄廢果厭氧發(fā)酵產物中活性物質的含量，與發(fā)酵前相比總游離氨基酸含量提高了226.05%～276.66%，總有效氮含量提高了31.13%～40.75%。

（2）不同葡萄廢果成分對發(fā)酵過程中pH 值的動態(tài)變化有一定影響，但對EC值的變化沒有明顯影響。

（3）去除葡萄皮和籽粒有利于發(fā)酵產物中游離氨基酸的積累，其中9 類游離氨基酸具有顯著優(yōu)勢，但F-、總酚和總酸的含量顯著降低。