余先球，費小明，王麗霞，雷芳，陸雯萍，曹江，湯郁

費城染色體陽性(Ph+)的B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)多見于成年人，其發(fā)生率隨著年齡的增大而相應(yīng)提高。盡管隨著酪氨酸激酶抑制劑如伊馬替尼、達(dá)沙替尼的出現(xiàn)，Ph+B-ALL的預(yù)后較以往有了較大的改善，但較高的復(fù)發(fā)率與對治療的耐藥仍然是臨床面臨的挑戰(zhàn)。對于復(fù)發(fā)的Ph+B-ALL患者，異基因造血干細(xì)胞移植(HSCT)是重要的挽救治療方法，但是仍有相當(dāng)高比例的患者在HSCT后復(fù)發(fā)，對于這類移植后復(fù)發(fā)的患者治療非常困難。

以B淋巴細(xì)胞表面抗原CD19作為靶點的嵌合抗原受體T 細(xì)胞( chimeric antigen receptor T cells，CAR T細(xì)胞)自臨床應(yīng)用以來，被證實對難治/復(fù)發(fā)B-ALL有很高的治療有效率。目前臨床多采用患者自體的T淋巴細(xì)胞來制備CAR T細(xì)胞；而對于接受異基因HSCT后復(fù)發(fā)的患者，則一般采集供者T淋巴細(xì)胞來制備CAR T細(xì)胞。本文報道1例Ph+B-ALL患者在第1次復(fù)發(fā)后，經(jīng)自體CD19靶向CAR T細(xì)胞挽救治療后達(dá)分子生物學(xué)緩解，并橋接半相合HSCT，移植后患者再復(fù)發(fā)，用采集于患者來源的淋巴細(xì)胞，再次制備與第1次完全相同構(gòu)建的CAR T細(xì)胞，成功挽救移植后復(fù)發(fā)的病例。

1 病例資料

1.1 CAR T細(xì)胞治療前診療過程 患者男性，45歲。2015年10月因“乏力、發(fā)熱、皮膚出血”起病。骨髓涂片示原幼淋細(xì)胞比例95%，免疫分型示B細(xì)胞-ALL，染色體核型分析費城染色體陽性，融合基因BCR-ABL-190陽性，診斷Ph+B-ALL。給予伊馬替尼聯(lián)合VDCP方案誘導(dǎo)化療后獲 CR，兩療程化療后BCR-ABL-190轉(zhuǎn)陰。緩解后繼續(xù)口服TKI并接受MA、CAM、HD-MTX等方案鞏固/強(qiáng)化治療，并接受伊馬替尼+6-MP+MTX、間斷COATD方案維持治療，期間定期復(fù)查骨髓BCR-ABL-190融合基因均陰性，長期口服伊馬替尼維持治療。2019年7月患者ALL復(fù)發(fā)，骨髓原幼淋細(xì)胞比例85%，免疫表型 CD19 90%陽性，融合基因BCR-ABL-190/ABL：84.106%，ABL激酶突變未檢出。予利妥昔單抗+HyperCVAD方案的A、B方案各一療程誘導(dǎo)化療后，復(fù)查骨髓示原幼淋4%，BCR-ABL-190/ABL：23.038%。

1.2 淋巴細(xì)胞采集及CD19-CAR-T制備 經(jīng)科室討論并由患者簽署知情同意書后，患者納入CD19靶向CAR T治療復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞惡性腫瘤臨床試驗(倫理審查批件號：XYFY2017- KL014-01)?；颊咴谕炀然熐耙研凶泽w外周血淋巴細(xì)胞單采，體外制備自體人源化CD19靶向CAR T細(xì)胞，以4-1BB和CD28作為共刺激分子，制作的詳細(xì)過程參考文獻(xiàn)[1]。

1.3 CAR T細(xì)胞治療過程 患者在-5天始接受FC方案( 氟達(dá)拉濱25 mg/m2×3 d; 環(huán)磷酰胺250 mg/m2×3 d)預(yù)處理。第0天單次劑量輸注制備的CD19靶向CAR T細(xì)胞，回輸CAR T細(xì)胞總數(shù)為1×106/kg體質(zhì)量。

1.4 CAR-T回輸后CRS診斷及分級 將患者接受CAR-T治療后并發(fā)的CRS參照文獻(xiàn)[2]分成1～5級。臟器損害判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行，并給予對應(yīng)處理。

1.5 親緣半相合異基因造血干細(xì)胞移植治療 患者在第1次CD19靶向CAR T細(xì)胞治療緩解后口服伊馬替尼維持治療，CAR T后+157天橋接親緣半相合移植(子供父，O供O)，預(yù)處理方案：阿糖胞苷 4g/m2，-10、-9天；白消安 0.8 mg/kg q6h，-8、-7、-6天；環(huán)磷酰胺 1.8g /m2，-5、-4天；司莫司汀250 mg/m2，-3天。GVHD預(yù)防參照GIAC體系，并且在移植后+3及+4天給予小劑量的PTCY(環(huán)磷酰胺14.5 mg/kg體質(zhì)量)。

1.6 干細(xì)胞移植后治療 患者接受半相合移植后按流程撤減免疫抑制劑，在+4月起接受達(dá)沙替尼口服治療，期間有皮膚慢性GVHD，加用糖皮質(zhì)激素治療后病情控制。

1.7 移植后復(fù)發(fā)治療 單倍體移植后+386天患者復(fù)查骨髓示：骨髓增生活躍，粒系增生，紅系減低，可見1.5%原幼淋，全片可見4個巨核細(xì)胞。染色體核型分析：46，XY, t(9;22)(q34;q11)[1]/46XY[11]；融合基因BCR-ABL-190/ABL: 14.4462%，嵌合度STR降至88.7%，提示疾病復(fù)發(fā)。予單采患者外周血淋巴細(xì)胞，體外制備與之前CAR T相同構(gòu)建的CD19靶向CAR T細(xì)胞，制備過程同前。淋巴細(xì)胞單采后予小劑量地西他濱(10 mg/d ×5 d)治療，1月后復(fù)查骨髓涂片：見21%原幼淋；融合基因BCR-ABL-190/ABL:75.616%；染色體檢查：46，XY,t(9;22)(q34;q11)[5] /46XY[15]。此時CD19靶向CAR T細(xì)胞制備成功，予FC方案(劑量用法同前)去T細(xì)胞后回輸患者細(xì)胞來源CD19靶向CAR T細(xì)胞。輸注前后未行GVHD預(yù)防。

2 結(jié)果

2.1 CAR-T治療療效 患者移植前接受自體CD19靶向CAR T治療獲分子生物學(xué)完全緩解，MRD持續(xù)陰性近半年并橋接半相合干細(xì)胞移植。移植后復(fù)發(fā)狀態(tài)下再次接受自體細(xì)胞來源CD19靶向CAR T細(xì)胞治療后21天復(fù)查血常規(guī)：白細(xì)胞計數(shù)1.3×109/L，中性粒細(xì)胞計數(shù)0.5×109/L，血紅蛋白82 g/L，血小板計數(shù)61×109/L；骨髓細(xì)胞形態(tài)檢查：此部位骨髓增生極度減低，粒系以成熟階段為主，紅系增生，巨核細(xì)胞未見；染色體核型分析：46，XY[8]；融合基因BCR-ABL-190/ABL:0。第2次CAR T細(xì)胞治療后55 d復(fù)查血常規(guī)：白細(xì)胞計數(shù)3.9×109/L，中性粒細(xì)胞計數(shù)1.5×109/L，血紅蛋白93 g/L，血小板計數(shù)126×109/L；骨髓細(xì)胞形態(tài)檢查：增生明顯活躍，原幼淋0.5%，粒、巨兩系增生，紅系增生明顯；染色體核型：46 XY[20]；BCR-ABL-190：陰性；白血病免疫分型示未見免疫表型異常；ABL激酶突變陰性；嵌合度STR：98.5%。

2.2 CAR T細(xì)胞治療不良反應(yīng) 患者移植前接受自體CAR T細(xì)胞治療沒有觀察到細(xì)胞因子釋放綜合征( CRS) 。移植后自體細(xì)胞來源CD19靶向CAR T治療后第10天出現(xiàn)發(fā)熱，同時伴有鐵蛋白及IL-6水平明顯上升，CRS 1級。予對癥退熱，接受2個劑量的妥珠單抗治療后癥狀緩解，無CRES不良反應(yīng)。2次CAR T細(xì)胞治療情況及不良反應(yīng)詳見表1。

表1 2次CAR T治療情況及治療相關(guān)不良反應(yīng)

2.3 半相合干細(xì)胞移植后接受自體CAR T細(xì)胞GVHD情況 半相合血干細(xì)胞移植后再次接受自體細(xì)胞來源CD19靶向CAR T細(xì)胞治療過程中未行GVHD預(yù)防，回輸CAR T細(xì)胞后隨診3月，未發(fā)生GVHD，慢性GVHD仍需更長隨診觀察時間。

3 討論

成人Ph+B-ALL作為ALL的一個特殊亞型，對傳統(tǒng)化療反應(yīng)極差，絕大多數(shù)患者在診斷3年內(nèi)死于原發(fā)疾病。雖然隨著TKI的出現(xiàn)，尤其是新一代TKI普那替尼的運(yùn)用，TKI+化療的治療模式明顯地改善了Ph+B-ALL的預(yù)后，但疾病的復(fù)發(fā)率仍然較高，對于復(fù)發(fā)ALL患者，異基因HSCT是公認(rèn)的以治愈為目的的挽救治療。而復(fù)發(fā)患者如果移植前不能達(dá)到緩解，或者微小殘留病變(MRD)陽性，均對異基因HSCT的結(jié)果有不利的影響。經(jīng)TKI治療的Ph+B-ALL復(fù)發(fā)后，可對白血病細(xì)胞的ABL激酸突變位點測序檢測，如果發(fā)現(xiàn)已知位點的突變，則可根據(jù)突變位點類型進(jìn)行TKI的選擇，有利于提高挽救治療的成功率。但本例患者在第1次復(fù)發(fā)后，并沒有發(fā)現(xiàn)ABL突變位點，雖然更換了二代TKI達(dá)沙替尼+化療治療，患者并沒有達(dá)到分子生物學(xué)完全緩解，如果此時進(jìn)行HSCT則移植效果很差。

對于這種化療和靶向藥均耐藥的Ph+B-ALL復(fù)發(fā)病例，CAR T細(xì)胞具有不同于傳統(tǒng)化療藥物和TKI的白血病細(xì)胞殺傷機(jī)制，它可以靶向特異性抗原并殺滅體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，作為新型免疫療法在復(fù)發(fā)難治性B-ALL取得了較高的緩解率，有效率達(dá)70%～90%[4-5]，被認(rèn)為是最有前景的腫瘤治療方式之一。本病例在第1次復(fù)發(fā)后，經(jīng)自體CD19靶向CAR T細(xì)胞治療后，成功地達(dá)到了MRD陰性的完全緩解，使本例患者獲得了HSCT的機(jī)會?；颊咴诘?次CAR T細(xì)胞治療后，并沒有出現(xiàn)CRS等不良反應(yīng)，考慮與患者當(dāng)時體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷較低有關(guān)。因為既往有研究認(rèn)為，CRS的發(fā)生率及嚴(yán)重程度，與患者接受CAR T細(xì)胞治療時的腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)。

異基因HSCT移植后，雖然移植物抗腫瘤(GVT)效應(yīng)有利于白血病的控制，但是移植后復(fù)發(fā)仍是主要死因。異基因造血干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)患者生存期常不足6個月[6]。雖然本例患者在移植后達(dá)到了供者細(xì)胞的完全嵌合，再加上達(dá)沙替尼維持治療，并且進(jìn)行MRD水平密切監(jiān)測，但是其在移植后1年仍然復(fù)發(fā)，這提示患者體內(nèi)極少數(shù)的Ph+白血病細(xì)胞仍然可以導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。移植后復(fù)發(fā)挽救治療方法通常包括撤減免疫抑制劑、干擾素、再誘導(dǎo)化療、供者淋巴細(xì)胞輸注(DLI)及2次干細(xì)胞移植等，但這些治療方法療效有限，同時撤減免疫抑制、DLI可能誘發(fā)嚴(yán)重GVHD[7]。Kochenderfer等[8]首次報道了供者來源CD19靶向CAR T細(xì)胞在治療allo-HSCT后復(fù)發(fā)B細(xì)胞腫瘤患者中取得較好的療效。Chen等[9]研究顯示，移植后復(fù)發(fā)ALL患者接受CD19靶向CAR T細(xì)胞治療后CR率達(dá)85.7%(30/34)。Zhang等[10]對32例allo-HSCT后復(fù)發(fā)的B-ALL患者進(jìn)行CAR-T治療，輸注30天時緩解率為87.5%(28例CR，其中27例為MRD陰性)。但是通常情況下，經(jīng)過CD19靶向CAR T細(xì)胞治療過的B-ALL患者，在CAR T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)時，CD19靶向CAR T細(xì)胞再次治療往往無效。無效的機(jī)制包括白血病細(xì)胞表面CD19抗原的丟失、機(jī)體的免疫耐受等。本病例在移植后復(fù)發(fā)時，白血病細(xì)胞表面CD19抗原并沒有丟失，其后再次給予相同構(gòu)建的CD19靶向CAR T細(xì)胞治療，患者又一次獲得MRD陰性的完全緩解。對于這種在異基因移植前后，2次接受CD19靶向CAR T細(xì)胞挽救治療，并獲得成功的病例既往鮮有報道。這1病例的經(jīng)驗提示，對于CD19陽性復(fù)發(fā)的B-ALL，即使患者既往接受過CD19靶向CAR T細(xì)胞治療，如果距上次治療時間在1年以上且沒有發(fā)生免疫逃逸，CD19靶向CAR T細(xì)胞仍然可能有效。

對于接受異基因HSCT后復(fù)發(fā)的B-ALL的患者，如果需進(jìn)行CAR T細(xì)胞治療，多數(shù)選擇單采供者的淋巴細(xì)胞來制備CAR T細(xì)胞。采用供者細(xì)胞有多種優(yōu)點：(1)供者本身健康，不像疾病復(fù)發(fā)的患者存在體能狀態(tài)、合并癥等限制，可以隨時進(jìn)行細(xì)胞采集；(2)患者經(jīng)過反復(fù)化療T淋巴細(xì)胞功能可能存在各種缺陷，影響CAR T細(xì)胞的效果；(3)采用供者細(xì)胞更能保證采集到足夠數(shù)量的淋巴細(xì)胞。但是，采用供者細(xì)胞最大的缺點是有誘發(fā)GVHD的風(fēng)險。Chen等[11]在對6例半相合移植后復(fù)發(fā)的B-ALL回輸供者來源CAR T細(xì)胞挽救治療時，其中3例發(fā)生了Ⅱ-Ⅲ度的急性GVHD。Anwer等[12]一項薈萃分析中納入7項研究中72例接受異基因移植后復(fù)發(fā)的血液腫瘤患者，復(fù)發(fā)后接受供者來源CAR T的治療，其中有5例(6.9%)誘發(fā)了GVHD。如果從HSCT患者體內(nèi)采集淋巴細(xì)胞，雖然存在上述缺點，但是從理論上講，制備的CAR T細(xì)胞回輸后，引起GVHD的風(fēng)險要遠(yuǎn)小于來自供者的CAR T細(xì)胞。同時有研究[13]報道顯示，移植后復(fù)發(fā)患者接受CAR T細(xì)胞治療時采用的CAR T細(xì)胞來源影響CAR T細(xì)胞治療后OS及LFS，其中患者細(xì)胞來源組(17例)和供者細(xì)胞來源組(11例)的1年OS率分別為(87.5% vs 36.4%)(P=0.006)，1年LFS率分別為(81.3% vs 36.4%)(P=0.017)。Hu等[14]報告接受異基因造血干細(xì)胞移植后供者CAR T在體內(nèi)擴(kuò)增能力低于自體CAR T細(xì)胞。不同于自體CAR T細(xì)胞只靠CAR起作用，供者CAR T通過CAR和T細(xì)胞受體(TCR)起作用，而兩個系統(tǒng)可能存在相互作用而影響CAR T細(xì)胞的擴(kuò)增[15-16]。本例患者移植復(fù)發(fā)后采用患者來源T細(xì)胞制備的CD19靶向CAR T細(xì)胞挽救治療后再次讓患者達(dá)分子生學(xué)緩解，雖然出現(xiàn)了I度的CRS反應(yīng)，但臨床并沒有觀察到GVHD。第2次CAR T細(xì)胞治療后出現(xiàn)CRS，這可能與此時患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷要高于第1次CAR T細(xì)胞治療時有關(guān)。由此可見，異基因造血干細(xì)胞移植后患者來源的T細(xì)胞制備的CAR T細(xì)胞存在一定的療效和副反應(yīng)的優(yōu)勢。

綜上所述，這1病例的經(jīng)驗提示：移植前接受過CD19靶向CAR T細(xì)胞治療的Ph+B-ALL，移植后復(fù)發(fā)時再次接受同一構(gòu)建的CD19靶向CAR T細(xì)胞治療仍然可能有效；對于半相合移植后復(fù)發(fā)患者，采用患者來源的淋巴細(xì)胞制備CAR T細(xì)胞進(jìn)行挽救治療，是一個可行且低GVHD風(fēng)險的挽救治療方法。