陶睿智 ,顧任鈞 ,夏雅雯 ,韓鴻寬 ,陸可沁 ,陸茵 ,孫廣志*

(1.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室,南京中醫(yī)藥大學(xué),南京 210000;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,南京中醫(yī)藥大學(xué),南京 210000)

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是以上腹痛、上腹脹滿、早飽、噯氣、食欲不振、惡心、嘔吐等為主要癥狀[1],排除器質(zhì)性疾病后的一組臨床綜合征,是臨床最常見的功能性胃腸疾病之一[2]。該疾病人群患病率在全球范圍內(nèi)變化很大,西方國家的總體患病率較高(10%～40%),亞洲的患病率較低(5%～30%)[3]。FD 作為一種慢性疾病,在病程上具有周期性和波動性的特點[4]。羅馬IV 將FD診斷標(biāo)準(zhǔn)總結(jié)為:在過去3 個月中每周至少有3 d伴有消化不良癥狀,發(fā)病在6 個月以上,并且不能通過排便而得到緩解[5-7]。

動物模型已被廣泛用于確定FD 的病理機制的研究,世界各地的研究人員尚未開發(fā)出針對FD 特定的模型和藥物[8]。FD 在病程上有持續(xù)時間的特征[5-7],造模的成功時間與效果的持續(xù)時間對于實驗者操作以及模型合理性都有重要參考價值,但目前缺少全面概括現(xiàn)有模型持續(xù)效果的文章。檢索國內(nèi)外文獻,通過分析近幾年發(fā)表的FD 的造模方法,從作用機制影響效果的長短將其大致分為持續(xù)型和臨時型兩類[9],這兩類模型在導(dǎo)致FD 的機制上有著不同特點。由于FD 的發(fā)病機制尚未完全明確,內(nèi)臟高敏感[10]、胃順應(yīng)性降低[11]、胃排空延緩[12]目前被認(rèn)為是FD 的關(guān)鍵病理機制,焦慮也是FD 患者的常見心理狀態(tài)[13]。臨時型FD 模型主要通過急性壓力刺激、藥物臨時干預(yù)來達到短暫的胃腸動力障礙、內(nèi)臟敏感性增加以及腸道炎癥等;持續(xù)型FD 模型主要通過長期慢性刺激、長期藥物干預(yù)以及長期多因素干預(yù)的方法造成動物胃腸動力障礙、內(nèi)臟敏感性增高以及胃腸激素紊亂等來模擬FD 的癥狀。

本文希望從持續(xù)效果來進行FD 動物模型的分類與整理,以期對FD 的研究提供幫助。

1 臨時型FD 模型

1.1 浸水壓力應(yīng)激

Lee 等[14]選取16～18 周的SD 大鼠(250～300 g),用浸水約束壓力進行造模。該課題組設(shè)置了2 h 壓力組和4 h 壓力組,大鼠身體被固定在鐵籠內(nèi),除了頭部以外身體浸沒在水中(19 ± 1)℃,分別持續(xù)2 h 和4 h。處死大鼠后測定大鼠十二指腸組織中occludin 和ZO-1 蛋白和mRNA 水平以評價炎癥,血漿中ACTH 和皮質(zhì)醇的水平以評價應(yīng)激狀態(tài)。與空白組相比,4 h 組occludin 和ZO-1 蛋白及mRNA 水平明顯降低,ACTH 及皮質(zhì)醇水平明顯升高。該模型通過應(yīng)激改變腸上皮通透性來誘導(dǎo)炎癥,從而模擬FD 的原發(fā)部位之一即十二指腸區(qū)域的病理變化。

1.2 酸化刺激

Shin 等[15]選擇ICR 小鼠21～26 g,在末次給藥30 min 后,腹腔注射溶于生理鹽水的0.6%的醋酸(10 mL/kg)來進行造模,同時灌胃給予5%伊文斯蘭溶液(0.1 mL/kg),30 min 后處死小鼠來測定小腸推進率,與正常組相比推進率明顯降低。Mine等[16]給予大鼠結(jié)腸注射0.6%的醋酸,造成其內(nèi)臟運動反應(yīng)(visceromotor response,VMR)明顯增加,從而制備SD 大鼠內(nèi)臟高敏感性FD 動物模型;Kim等[17]選取成年雄性ICR 小鼠,在末次給藥30 min后,腹腔注射0.5%的醋酸,30 min 后處死,觀察小腸推進率明顯降低。Chen 等[18]選取成年SD 大鼠,利用手術(shù)結(jié)腸滴注4%醋酸(1 mL)來進行炎癥后腸易激綜合征模型的制備,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該模型能使大鼠的胃腸動力明顯紊亂該類模型造模時間短且效果明顯,能短暫引起胃內(nèi)壓升高,模擬FD 模型。

1.3 順鉑注射

畢娉娉等[19]選取KM 小鼠,腹腔注射順鉑2 mg/kg,連續(xù)4 d 進行造模。檢測相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)小鼠胃排空延緩對照組為 64.03%,而模型組為93.86%。同時,小腸推進顯著增加,對照組為56.07%,模型組為73.18%。張廣龍等[20]利用順鉑注射液進行造模,在首次給藥60 min 后,給予成年SD 大鼠腹腔注射順鉑注射液(6 mg/kg),于4 d 后處死,測定胃中的殘留量,結(jié)果顯示模型組胃殘留率(87.9%)明顯高于對照組(44.8%)。Shin 等[15]同樣通過腹腔注射給予ICR 小鼠5 mg/kg 的順鉑注射液來延緩小鼠胃排空,使小鼠胃動力下降。

1.4 受體阻斷劑/激動劑注射

1.4.1 阻斷M 受體

Chang 等[21]選取成年KM 小鼠,通過末次給藥1 h 后,腹腔注射阿托品注射液(1.5 mg/kg)來復(fù)制胃腸動力障礙模型。測定胃排空率以及激素變化來評價小鼠胃腸動力的變化;放射免疫法測試大鼠胃腸激素在體內(nèi)血漿、胃竇、十二指腸、下丘腦含量的變化。結(jié)果表明,阿托品組胃排空能力降低,小腸推進率降低,胃泌素含量下降,血管活性腸肽含量升高,造模成功。Zhang 等[22]選取8 周齡SD 大鼠,腹腔注射1 mg/kg 的阿托品,15 min 后觀察胃慢波頻率,發(fā)現(xiàn)其頻率紊亂。

1.4.2 阻斷阿片受體

He 等[23]選取KM 小鼠進行慢性便秘(STC)造模,灌胃給予小鼠10.0 mg/kg 洛哌丁胺每天2 次,持續(xù)10 d。對排便頻率、濕便重、干便重進行評估。Shin 等[15]通過腹腔注射給予ICR 小鼠5 mg/kg 的洛哌丁胺來延緩小鼠胃排空(空白組為50.2%,模型組為34.9%),造成胃腸動力障礙。

1.4.3 激動α2 腎上腺素受體

Mine 等[16]利用可樂定(0.03 mg/kg)給予ddY小鼠皮下注射來進行FD 動物模型的造模,能夠引起內(nèi)臟運動反應(yīng)增加,改變干濕便重;鄒璇[24]選取200 g 左右的成年SD 雄性大鼠,在末次給藥后30 min,給予模型組以及給藥組皮下注射100 μg/kg 可樂定(CD)進行造模并30 min 后對模型進行評價,其胃順應(yīng)性及胃排空率均下降。

1.4.4 激動多巴胺受體

Kanemasa 等[25]選取6 周成年Wistar 大鼠,末次給藥15 min 后,皮下注射3 mg/kg 或口服20 mg/kg 嗎啡來模擬胃腸動力障礙模型,60 min 處死后測定小腸推進,發(fā)現(xiàn)同對照組相比明顯降低;同樣,Mine 等[16]利用嗎啡(1 mg/kg)皮下注射復(fù)制ddY小鼠FD 模型,能夠造成內(nèi)臟運動反應(yīng)增加。

2 持續(xù)型模型

2.1 長期高脂飲食

Zhou 等[26]選取雄性SD 大鼠(100～150 g),空白組給予普通飲食(11.3%大卡的脂肪),模型組給予高脂飲食(58%大卡的脂肪),給予2 周后,處死動物并測定胃排空率,發(fā)現(xiàn)高脂飲食大鼠排空率降低了26%。

2.2 慢性壓力應(yīng)激

Liang 等[27]選取雄性Wistar 大鼠(180～220 g),通過夾尾使大鼠焦慮和緊張,持續(xù)30 min 后,讓大鼠以適當(dāng)速度在特定跑步機上跑步10 min,使大鼠疲勞。每日4 次,連續(xù)10 d。測定胃排空率、小腸推進率以及血清MTL、VIP 等水平,發(fā)現(xiàn)胃排空率和小腸推進率明顯降低,MTL 較對照組明顯降低,VIP水平明顯升高。大鼠胃腸蠕動減慢,出現(xiàn)運動障礙,符合FD 的特征。譚樹慧等[28]通過對SD 大鼠每次隨機采用慢性應(yīng)激束縛、食物剝奪、過度疲勞等刺激方式復(fù)制FD 動物模型,相鄰2 d 采用不同的慢性刺激方式,連續(xù)刺激21 d。此法認(rèn)為大鼠長期受到不規(guī)律的慢性刺激,長期處于應(yīng)激狀態(tài)下,出現(xiàn)FD 癥狀。范夢男等[29]采用改良郭氏夾尾刺激法聯(lián)合張氏不規(guī)則喂食法復(fù)制雄性SD 大鼠FD 模型。將使用紗布包裹的夾鉗連續(xù)不斷地夾大鼠尾巴末端1/3 處,每次夾尾刺激持續(xù)30 min,每天1 次,以此激怒大鼠并使其互相廝打,連續(xù)21 d。王璟等[30]、王敏等[31]采用了夾尾激怒加不規(guī)律飲食法造模。此法相對緩和,每日夾尾次數(shù)下降,通過長期的夾尾刺激引起大鼠內(nèi)臟敏感性增加,貼合臨床FD 的癥狀。

2.3 c-Kit 單克隆抗體注射

陳峭等[32]選取SD 大鼠,腹腔注射抗c-Kit 單克隆抗體(ACK2)各100 μg,2 d 1 次,連續(xù)5 次。2 周后取材前給予大鼠半固體糊,30 min 后測定胃殘留率、小腸推進率以及Cajal 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,模型組胃殘留率顯著增加,小腸推進率顯著減少,Cajal 間質(zhì)細(xì)胞呈凋亡樣改變,從而造成小鼠持續(xù)胃腸動力障礙。

2.4 碘乙酰胺灌胃

呂林等[33]采用碘乙酰胺灌胃結(jié)合改良小平臺法。選取10 只SD 幼鼠,給予0.1%蔗糖碘乙酰胺溶液灌胃(0.2 mL/d),連續(xù)灌胃6 d。出生后第43天,給予改良小平臺法處理,造成小鼠勞倦,每日持續(xù)14 h,連續(xù)14 d。檢測抓力、胃排空率、小腸推進率、胃體縱行肌和胃竇環(huán)形肌條收縮力均降低;吳震宇等[34]選取9 只10 日齡SD 大鼠,給予每天0.2 mL 灌胃,持續(xù)6 d。灌胃結(jié)束后各組大鼠正常飼養(yǎng)至7 周齡,7 周齡起以郭氏夾尾刺激至8 周齡。檢測大鼠胃敏感性及順應(yīng)性、胃排空率等指標(biāo)均降低。同樣Zhang 等[22]通過選取10 日齡SD 大鼠灌胃給與2%蔗糖的0.1%碘乙酰胺溶液(每天0.2 mL)進行FD 的造模,能夠減慢大鼠胃排空,造成胃慢波頻率紊亂。

2.5 三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)注射

Winston 等[35]選取10 日齡雄性SD 大鼠,從其肛門向結(jié)腸中插入2 cm 導(dǎo)管,腸內(nèi)注射0.2 mL 用10%乙醇溶解的三硝基苯磺酸(130 mg/kg),將動物以朝下的姿勢保持約2 min,并保持肛門閉合1 min,以防止TNBS 溶液泄漏來誘導(dǎo)新生兒動物結(jié)腸炎。給予液體營養(yǎng)餐并進行大鼠飽腹感和胃排空檢測,結(jié)果表明模型大鼠與空白組相比進食量減少且胃排空延遲。該方法選取10 日齡動物造成其幼年損傷,引發(fā)炎癥及內(nèi)臟高敏感,持續(xù)效果時間長。

2.6 新型序貫應(yīng)激法

景富春等[36]運用新生幼崽胃刺激法和母嬰分離法2 種方法并結(jié)合束縛應(yīng)激法刺激幼齡動物,造成焦慮,從而建立持續(xù)型胃高敏感大鼠模型。該課題組選取1 日齡SD 大鼠,自出生后第2 天起,每天與母鼠分離3 h,至3 周結(jié)束。同時幼鼠于出生后第10 天起給予0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液灌胃(每只0.2 mL),持續(xù)6 d,并于第8 周進行束縛應(yīng)激實驗,持續(xù)90 min 后放回原籠,持續(xù)7 d。分別于灌胃后第2～6、18、56 天進行稱重,進行礦場試驗、胃排空試驗,評價胃黏膜炎癥反應(yīng)等。結(jié)果表明,模型組大鼠體重低于空白組,胃排空率降低,大鼠在中央格停留時間、穿行格數(shù)、直立次數(shù)明顯減少,符合焦慮樣FD 模型。

3 總結(jié)

本文通過對近年來FD 動物模型的整理(見表1),初步根據(jù)造模時間和持續(xù)效果時間的長短將FD動物模型分為臨時型和持續(xù)型?？偨Y(jié)發(fā)現(xiàn)臨時型造模方法主要有急性刺激、藥物干預(yù)等。其中浸水約束壓力主要利用急性壓力會破壞腸道穩(wěn)態(tài),短暫引起十二指腸和胃運動障礙[14],通過增加黏膜GDNF 擴增ISC 和EC 細(xì)胞分化誘導(dǎo)內(nèi)臟超敏反應(yīng)[37];酸化刺激導(dǎo)致胃排空延遲,胃腸功能調(diào)節(jié)障礙以及內(nèi)臟超敏感[38];順鉑等化療藥物可作用于延髓嘔吐中樞,并直接損傷胃黏膜從而引起嘔吐惡心等胃腸道毒副反應(yīng)[39];阿托品、洛哌丁胺、可樂定、多巴胺可分別阻斷胃腸道平滑肌的受體如M 受體[40]或阿片受體[41]以及激動α2 腎上腺素受體[16]、多巴胺受體[42]來松弛平滑肌從而造成胃腸動力障礙,模擬FD 的癥狀。該方法持續(xù)效果較短,藥物代謝之后,胃腸動力恢復(fù),具有起效快,造模簡單的優(yōu)點,可以基本模擬FD 臨床上腹痛及燒灼或便秘等癥狀。該模型以胃排空率、小腸推進率降低及胃腸激素紊亂為指標(biāo),多選用成年動物。

持續(xù)型造模方法主要有慢性刺激、藥物干預(yù)、母嬰分離、不規(guī)則喂食等。其中慢性高脂飲食通過上調(diào)胃肌層神經(jīng)叢中膽汁酸受體TGR5 和nNOS,影響胃腸激素水平如GLP-1 的表達來延緩胃排空[26];持續(xù)壓力通過影響胃腸動力以及激素的分泌,造成持續(xù)性的胃腸敏感性增加、功能障礙和消化不良[43];體內(nèi)注射c-Kit 單克隆抗體(ACK2),可以造成腸道動力基本單位Cajal 間質(zhì)細(xì)胞損傷[44-45],從而導(dǎo)致小腸的異常運動[46];碘乙酰胺通過誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧、胃腸黏膜損傷從而引起動物焦慮和抑郁[47],造成動物胃腸道固有損傷及炎癥反應(yīng);三硝基苯磺酸通過引起Th1 型炎癥反應(yīng)[48]來造成胃腸動力障礙。該模型可以基本模擬FD 臨床上焦慮、早飽、食欲不振等癥狀[49-50],以動物體重下降,進食量減少,胃排空率及小腸推進率下降、胃腸激素紊亂為評價指標(biāo),既可選用成年動物,也可選用幼年動物。

臨時型造模模型成功時間多在當(dāng)天,在模擬癥狀方面效果明顯,適用于針對某一癥狀的動物實驗研究,其持續(xù)效果也相對短暫,多利用當(dāng)天進行模型評價。但臨時型往往難以從整體上反應(yīng)FD 的病證[51],其在效果上還有待改進。如今腦-腸軸以及腸道菌群的研究成為熱點[52],壓力已被證明對于腦-腸軸具有深刻影響,是多種慢性消化系統(tǒng)疾病和腸道型炎癥疾病的誘因[53],神經(jīng)胃腸病學(xué)與FD 存在著密切聯(lián)系[54]。臨床上FD 大多病程遷延,大約50%患有FD 的人有持續(xù)性癥狀[4],其與患者的社會心理狀態(tài)以及壓力影響有關(guān)。采用持續(xù)型方法進行FD 造模雖然造模時間長,但可以基本模擬病人焦慮以及壓抑的特點,表現(xiàn)出FD 作為慢性消化道疾病的癥狀,與臨床具有更高的吻合度。

表1 FD 動物模型匯總表Table 1 Summary of FD animal models

續(xù)表1

現(xiàn)今FD 的病因病機還不完全明確,并沒有一個模型能夠完全模擬FD 的癥狀,臨床與模型間的“溝塹”客觀存在,這需要科研工作者從臨床出發(fā),進行更進一步的研究。發(fā)病部位及機制上,應(yīng)聚焦于上消化道。胃以及十二指腸的功能紊亂是FD 病理生理學(xué)的基礎(chǔ),對FD 中胃及十二指腸病理學(xué)的細(xì)致認(rèn)識有助于我們發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物和治療靶點;動物模型的選擇和探究上,應(yīng)當(dāng)分型論治,先明確功能性消化不良的亞型及其區(qū)別,尋找穩(wěn)定可靠具有代表性且的動物模型。