高杰 夏聰聰 張亞莉 姚雷清 席雨燕鄒宇佳王令*白亮劉恩岐

(1.陜西理工大學生物科學與工程學院,陜西 漢中 723001;2.西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院,西安 710061)

糖代謝紊亂、胰島素抵抗(insulin resistance,IR)與多種代謝綜合征如2 型糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化等心血管代謝性疾病存在著密切的相關關系,嚴重危害人類健康和生活質(zhì)量[1-3]。迄今為止,由于糖代謝紊亂、胰島素抵抗病因復雜,發(fā)病機制與病理過程尚未完全闡明,故仍缺乏有效的預防與治療策略。慢性炎癥是誘導胰島素抵抗病理過程的關鍵因素[4-5]。已有研究表明,脂肪過多積累引起的炎癥和脂質(zhì)代謝異?？蓪е路逝窒嚓P胰島素抵抗的發(fā)生。肥胖小鼠實驗研究表明,巨噬細胞浸潤脂肪組織,分泌產(chǎn)生TNF-α、IL-6 和MCP-1 等炎癥細胞因子,使機體處于低度炎性反應狀態(tài)[4]。提示巨噬細胞相關的炎癥活動可能參與胰島素抵抗的發(fā)生。

轉(zhuǎn)錄輔激活子MED1 是Mediator 復合物的核心成員,是多種核受體和轉(zhuǎn)錄因子的關鍵輔激活子,調(diào)控機體各種生物學過程,如生殖、發(fā)育、分化和代謝等[6]。Chen 等[7]研究表明,骨骼肌MED1 特異性敲除之后,小鼠葡萄糖耐受性提高以及胰島素敏感性增強,并且能夠抵抗高脂飲食誘導的肥胖。前期研究發(fā)現(xiàn),肝MED1 具有調(diào)控胰島素敏感性的作用[8];同時進一步研究顯示,巨噬細胞MED1 的表達顯著影響機體炎癥反應程度[9]。據(jù)此,我們猜想MED1 通過巨噬細胞參與糖代謝及胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。為探討巨噬細胞MED1 調(diào)控胰島素抵抗發(fā)生的作用,本研究通過構建肥胖模型,在不同時期分析MED1ΔMac小鼠血糖水平和胰島素抗性,為預防和治療胰島素抵抗及代謝綜合征提供了理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

MED1fl/fl小鼠由美國西北大學Feinberg 醫(yī)學院Janardan K.Reddy 教授贈送,通過與巨噬細胞特異性Cre(Lyz2-Cre)小鼠(購買自美國Jackson 實驗室) 雜交,獲得 MED1ΔMac和同窩野生型對 照MED1fl/fl小鼠【SCXK(陜)2018-001】。選取9 只MED1fl/fl和7 只MED1△MacSPF 級雄性小鼠,8 周齡,體重約為21 g。飼養(yǎng)期間,全部動物均在西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心【SYXK(陜)2020-005】無特定病原菌(specific pathogen free,SPF)屏障設施內(nèi)飼養(yǎng),各組小鼠自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定,溫度控制在22～25℃。所有操作均符合西安交通大學醫(yī)學部實驗動物管理法規(guī)定(審批號:IACUC 2017581)。

1.1.2 主要試劑與儀器

200 mg/mL 葡萄糖溶液(G8270-100G),60%Kcal 高脂飼料(D12492),胰島素注射液(KVGY574),TG(198021)、TC(192061)試劑盒,4%甲醛(ISO014),hematoxylin(G1005-1),eosin(G1005-2)。

血糖儀(Ascensia Diabetes Cares Holdings AG,Contour plus one,印度尼西亞),毛細管離心機(凱達,TG12 M,中國),全波長酶標儀(TECAN,Infinite M200 Pro,瑞士),萊卡切片機(LEIKA,RM2235,德國),正置光學顯微鏡(尼康,Nikon Eclipse E100,日本)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實驗干預

動物分為兩組:MED1fl/fl對照組和MED1△Mac敲除組。分別給予高脂飲食(HFD)飼喂0、4、8、12、16和20 周,動態(tài)監(jiān)測體重、血糖和胰島素抗性。

1.2.2 葡萄糖耐受性試驗(glucose tolerance test,GTT)和胰島素耐受性試驗(insulin tolerance test,ITT)

GTT 實驗:小鼠禁食16 h 腹腔注射葡萄糖(2 g/kg),尾部取血,運用血糖儀分別于注射后0、30、60、90 和120 min 測定血糖水平。

ITT 實驗:小鼠禁食4 h,腹腔注射胰島素(0.75 U/kg),尾部取血,運用血糖儀分別于注射后0、30、60、90 和120 min 測定血糖水平。

1.2.3 血漿與肝TG、TC 測定分析

禁食4 h,毛細管采集尾部血樣,3000 r/min 離心15 min,收集血漿,測定血漿TG、TC 含量。

1.2.4 組織病理學檢測

高脂飲食飼喂結(jié)束后,取小鼠肝和白色脂肪組織,4%甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,制作石蠟切片(4 μm),HE 染色后,10 × 20 倍鏡下觀察肝、脂肪細胞形態(tài),用Image J 軟件分析脂肪細胞大小。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 巨噬細胞MED1 敲除(MED1ΔMac)小鼠模型構建

為了確定MED1 在胰島素抵抗發(fā)生中的調(diào)控作用,我們構建了MED1ΔMac模型鼠。具體構建過程為:將8 周齡左右MED1fl/fl小鼠與Lyz2-Cre 小鼠進行交配,獲得MED1fl/+/Lyz2-Cre+/-雜合小鼠,此小鼠再與MED1fl/+/Lyz2-Cre-/-小鼠雜交,篩選獲得MED1ΔMac小鼠。以子代小鼠尾巴基因組DNA 為模板,運用loxP 引物進行PCR 擴增,獲得的1.8 kb 片段代表篩選出的小鼠均帶有兩個loxP 位點,2.0 kb片段代表野生型小鼠,若同時出現(xiàn)1.8 kb 和2.0 kb條帶,則代表雜合小鼠。運用Cre 引物進行擴增獲得700 bp 的片段,表明篩選出的小鼠是Cre 陽性(+)(圖1A)。如果小鼠攜帶fl/fl 位點,同時Cre 陽性,則表明巨噬細胞 MED1 基因被敲除,即MED1ΔMac小鼠。為進一步確定巨噬細胞MED1 的敲除效率,我們分別從mRNA 水平檢測MED1 的表達。分離培養(yǎng)MED1fl/fl和MED1ΔMac小鼠腹腔巨噬細胞,提取總RNA,RT-PCR 結(jié)果表明,與MED1fl/fl小鼠相比,MED1ΔMac小鼠巨噬細胞中MED1 mRNA 表達水平顯著降低(P＜0.05)(圖1B)。以上實驗結(jié)果表明,MED1ΔMac小鼠模型構建成功,為后續(xù)功能學實驗研究奠定了堅實的基礎。

圖1 巨噬細胞MED1 敲除小鼠基因型鑒定Note.A.PCR Genotyping of MED1fl/fl and MED1ΔMacmice using Lyz2-cre and loxP primer (+.Lyz2-cre positive mice.fl/fl.Double loxP locus mice.fl/+.Single loxP locus mice.+/+.loxP free mice).B.Statistical analysis of expression of MED1 in peritoneal macrophage by RT-PCR.Compare with MED1fl/flmice,*P ＜0.05.Figure 1 Genotyping of macrophage-specific MED1 knockout mice

2.2 巨噬細胞MED1 參與血糖調(diào)控,但不影響胰島素抗性

選用8 周齡MED1fl/fl和MED1ΔMac雄性小鼠為模型,分別給予高脂飲食0、4、8、12、16 和20 周,誘導小鼠肥胖發(fā)生。在高脂飲食飼喂的不同時期,動態(tài)檢測體重、TG、TC 和血糖水平。從圖2 可以看出,高脂飲食飼喂后,與MED1fl/fl小鼠相比,MED1ΔMac小鼠體重有升高的趨勢,但無顯著性差異,且兩組小鼠血漿TC 和TG 無差異。兩組小鼠血糖在高脂飲食飼喂的0、4、8、12 和16 周均無明顯差異,但在20 周時,MED1ΔMac小鼠血糖顯著升高(P＜0.01)(圖2),而且,MED1ΔMac小鼠肝重量、皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪均有增加趨勢(圖3)。然而,進一步葡萄糖耐受性試驗和胰島素耐受性試驗表明,兩組小鼠的葡萄耐受性和胰島素敏感性無明顯差異(圖4)。

圖2 高脂飲食誘導下巨噬細胞MED1 缺失小鼠體重、血糖和TC、TG 變化Note.MED1fl/fl.Wild-type mice.MED1△Mac.MED1 knockout mice.Compared with MED1fl/fl mice,**P ＜0.01.Figure 2 Changes in body weight,blood glucose,TC and TG of macrophage-specific MED1 knockout mice induced by HFD

圖3 HFD 飼喂20 周后巨噬細胞MED1 缺失小鼠肝和脂肪重量Figure 3 Liver and fat weight of macrophage-specific MED1 knockout mice after 20 weeks of HFD feeding

圖4 HFD 飼喂20 周后巨噬細胞MED1 缺失小鼠GTT 和ITT 測定Figure 4 Determination of GTT and ITT of macrophage-specific MED1 knockout mice after 20 weeks of HFD feeding

2.3 巨噬細胞MED1 缺失促進肝脂肪變性、內(nèi)臟脂肪細胞擴張

為評估巨噬細胞MED1 缺失對肝脂肪變性的作用,在HFD 20 周后處理小鼠,肝石蠟切片進行HE染色,結(jié)果表明,喂食HFD 的MED1fl/fl小鼠的肝細胞被大的細胞質(zhì)脂質(zhì)液滴擴張,而這種效應在喂食HFD 的MED1ΔMac小鼠中更為明顯(見圖5)。

圖5 小鼠肝切片HE 染色Figure 5 HE staining of mouse liver tissue

同時為了評估巨噬細胞MED1 敲除對脂肪組織炎性細胞浸潤的影響,我們在皮下脂肪組織(sWAT)、內(nèi)臟脂肪組織(gWAT)石蠟切片進行HE染色,研究結(jié)果表明,無論是皮下脂肪組織還是內(nèi)臟脂肪組織,喂食HFD 的MED1ΔMac小鼠與其對照組相比有巨噬細胞積累但并未看到明顯巨噬細胞浸潤(圖6A),而MED1ΔMac小鼠內(nèi)臟脂肪細胞面積更大,小鼠皮下脂肪細胞大小未見明顯差異(圖6B)。

圖6 HFD 飼喂20 周后MED1fl/fl和MED1△Mac小鼠內(nèi)臟、皮下脂肪HE 染色及脂肪細胞大小分布Note.A.HE staining of fat tissue.B.Adipocyte area frequency.Figure 6 HE staining of fat tissue and adipocyte size distribution in MED1 fl/fl and MED1△Mac mice after 20 weeks of HFD feeding

3 討論

近年來,肥胖是導致胰島素抵抗的主要危險因素,肥胖與脂肪細胞功能紊亂、巨噬細胞浸潤和輕度炎癥有關。脂肪組織合成并分泌多種生物活性分子,即脂肪因子和細胞因子,它們影響脂質(zhì)和葡萄糖的代謝。有研究表明,胰島素抵抗程度會由于血清脂肪酸代謝作用的不同而變化[10]。根據(jù)資料顯示,具有生物活性的脂質(zhì)分子:長鏈?；o酶A、神經(jīng)酰胺和二酰甘油,這些脂質(zhì)在脂肪細胞中的積累可能與胰島素抵抗的發(fā)生有關[11]。目前認為,巨噬細胞在誘導胰島素抵抗病理過程中扮演重要角色。巨噬細胞是一種具有高度可塑性和異質(zhì)性的細胞群體,在體內(nèi)外不同微環(huán)境細胞因子和微生物產(chǎn)物的影響下可表現(xiàn)出不同的表型和功能。根據(jù)活化狀態(tài)和功能不同,主要分為M1 型和M2 型[12]。M1 和M2 型巨噬細胞在肥胖誘導胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展中分別起到促進和抑制的作用。M1 型巨噬細胞浸潤脂肪組織,促炎癥反應因子如TNF-α、IL-6 等釋放增多,使機體所處于的低度慢性炎癥狀態(tài),通過胰島素干擾信號傳導通路引起肝、骨骼肌及脂肪組織的胰島素抵抗。

MED1 是轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合物的關鍵輔激活因子,其調(diào)控多個基因表達,亦是組織中脂質(zhì)和能量代謝的關鍵調(diào)控者。本課題組前期發(fā)現(xiàn)肝MED1 特異性敲除(MED1ΔLiv)小鼠能夠抵抗高脂飲食和PPARγ誘導的脂肪肝形成,增強胰島素敏感性。有研究報道骨骼肌MED1 特異敲除小鼠葡萄糖耐受性和胰島素敏感性均增強,能夠抵抗高脂飲食誘導的肥胖[7]。而本研究中,我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞MED1 特異性敲除小鼠對胰島素的敏感性并沒有增強,可能是MED1 在不同細胞的功能差異引起,具體機制還需進一步研究解析。

MED1 是PPARs 的關鍵輔激活子,PPARα 激動劑能減緩NAFLD 大鼠脂質(zhì)代謝失調(diào),具有適度的胰島素增敏作用[13]。Jia 等[14]研究發(fā)現(xiàn),與PPARα缺失表型相似,肝實質(zhì)細胞MED1 缺失導致脂肪酸氧化代謝相關基因的表達受到嚴重阻滯。肝MED1缺失能夠減弱糖皮質(zhì)激素受體激活劑誘導的肝細胞脂肪變性[15]。在本研究中,我們試圖確定巨噬細胞MED1 缺失是否影響胰島素抵抗,在巨噬細胞MED1 缺失時,通過生理狀態(tài)下肥胖導致的慢性炎癥來探究對胰島素抵抗的影響。通過HFD 飼喂,巨噬細胞MED1 缺失小鼠更能表現(xiàn)出肥胖、血漿膽固醇和甘油三酯水平的升高,葡萄糖耐量和胰島素耐量的受損,盡管兩組之間的差異并不顯著,但仍可提示巨噬細胞MED1 缺失在胰島素抵抗中發(fā)揮的作用,而結(jié)果不顯著可能與生理狀態(tài)下肥胖導致的免疫細胞募集較慢產(chǎn)生的慢性炎癥有關,因此可能沒有較多的巨噬細胞浸潤,我們可以嘗試用注射脂多糖誘發(fā)小鼠快速炎癥反應來觀察巨噬細胞MED1 缺失后對靶組織的作用;而對于靶組織而言,在HFD喂養(yǎng)下主要表現(xiàn)為肥胖和巨噬細胞浸潤,這點在肝組織中較為明顯,因此,當巨噬細胞MED1 缺失后,可能促進了胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。

本研究以巨噬細胞MED1 特異性敲除小鼠為動物模型,發(fā)現(xiàn)巨噬細胞缺失MED1 引起HFD 誘導的血糖水平升高,肝脂肪變性和脂肪細胞增大,但無顯著胰島素抵抗,為后續(xù)MED1 功能解析和巨噬細胞介導的肥胖性炎癥研究提供參考。