金亮子 吳芳芳 鄧偉 奎秀瑩 罕園園孫曉梅仝品芬李娜王喜軍代解杰*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,昆明 650118;2.昆明醫(yī)科大學(xué),昆明 650500;3.廣西壯族藥用植物園,西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程中心,南寧 530023)

流行性感冒簡稱流感,是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流感病毒是一種正黏病毒科負(fù)鏈RNA 病毒,包含8 個(gè)具有負(fù)極性的單鏈RNA 分子。該科的5 個(gè)屬包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、索戈托病毒和伊薩病毒(傳染性鮭魚貧血病毒)[1]。甲型流感病毒感染最為常見和嚴(yán)重,它在短時(shí)間內(nèi)迅速傳播并影響大地理區(qū)域的人口,在1918 年至1919 年的流感大流行期間,估計(jì)有三分之一的世界人口、受到感染并患有臨床癥狀明顯的疾病[2]。

流感病毒不斷變異,流感大流行隨時(shí)可能爆發(fā),合適的動物模型可以研究流感感染特性及傳播特性,為流感的防控、藥物篩選及疫苗的研究提供工作基礎(chǔ)。動物模型用于模擬復(fù)雜的生物現(xiàn)象和人類疾病特征,多年來,動物模型已成功用于疾病機(jī)理、藥物發(fā)現(xiàn)、靶點(diǎn)驗(yàn)證和臨床前試驗(yàn)[3]。流感動物模型提高了我們對疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)理和病理生理學(xué)的理解,是闡明流感發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵[4]。小鼠和雪貂常用于流感病毒研究,但也有一定的局限性[5]。小鼠體型較小,不易觀察到疾病的表現(xiàn),許多流感毒株需要提前適應(yīng)才能成功感染小鼠[6]。雪貂模型由于價(jià)格高、大小不均、抗體反應(yīng)性差[7],有必要尋求新的流感動物模型,開展疾病的發(fā)生機(jī)制研究具有重要的科學(xué)意義。樹鼩與靈長類動物的親緣關(guān)系比與嚙齒類動物的親緣關(guān)系更近,具有體型小、易于繁殖、成本低等優(yōu)點(diǎn),成為研究人類疾病的理想對象[8]。從傳染病的角度來看,樹鼩容易感染人類病原體,并表現(xiàn)出類似于人類感染的臨床癥狀[9]。因此,本研究通過流感病毒感染樹鼩,探討流感病毒在不同組織中的病毒動力學(xué)及其在各組織中的分布規(guī)律,為其疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物研發(fā)提供一種有科學(xué)價(jià)值新的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

H1N1 流感病毒血清抗體陰性、3～3.5 歲普通級樹鼩(中緬樹鼩滇西亞種)24 只,雌雄各半,體重105～150 g。來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心【SCXK(滇) K2018-0002】,飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心負(fù)壓獨(dú)立通風(fēng)樹鼩籠具(IVC)中【SYXK(滇)K2018-0002】,飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在20～25℃,濕度控制在40%～70%,人工光照每天12 h,換氣次數(shù)每小時(shí)大于15 次。所有操作均符合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所倫理要求(編號:DWSP202004001)。

1.1.2 細(xì)胞

犬腎上皮細(xì)胞(MDCK 細(xì)胞)購于北納生物。

1.1.3 病毒及感染途徑

H1N1 A/Puerto Rico/8/1934(A/PR/8)流感病毒株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所劉龍丁教授惠贈。經(jīng)普通級雞胚增殖后收集病毒尿囊液,病毒滴度為1 × 106.8TCID50/0.1 mL,-80℃冰箱儲存?zhèn)溆?實(shí)驗(yàn)均在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心BSL-2(生物安全I(xiàn)I 級)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

保定樹鼩待穩(wěn)定5 min 后,用每只600 μL/(1 ×106.8TCID50/0.1 mL)病毒液通過滴鼻的方式感染樹鼩。

1.1.4 主要試劑與儀器

PBS(Hyclone,美國),病毒RNA 提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen,德國),One Step Prime Script TM RT-PCR Kit(TaKaRa,日本),4%多聚甲醛固定液(美倫生物,中國),普通級1%雞紅細(xì)胞,血凝板(Nunc,丹麥),臺式高速離心機(jī)(Hitachi,CT15RE,日本),實(shí)時(shí)定量熒光PCR 儀(BIO-RAD,CFX-96,美國),生物安全柜(Forma,A/B3,美國),切片機(jī)(徠卡,中國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

樹鼩隨機(jī)分為空白組(B 組)和模型組(M 組),每組12 只,感染后觀察10 d。M 組用H1N1 A/PR/8/34 滴鼻方式感染樹鼩,B 組用PBS 滴鼻處理樹鼩。

1.2.2 體溫的測定

每天上午8:30 保定樹鼩后保持5～10 min,待動物穩(wěn)定后測定肛溫。

1.2.3 病毒載量的測定

每天采樹鼩的鼻拭子、咽拭子,用尾靜脈采血法采集外周血樣0.3 mL,使用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-PCR)絕對定量測定法研究了甲型H1N1 A/PR8/34 流感病毒在感染后1～10 d 的病毒載量的變化情況[10],引物及探針序列見表1。

表1 H1N1 A/PR8/34 引物序列Table 1 H1N1 A/PR8/34 primer sequence

1.2.4 特異性抗體檢測

分別測定感染后2、4、7 和10 d 血清樣品。首先標(biāo)記96 孔微量滴定板,然后用高碘酸鉀(KIO4)處理血清以去除非特異性凝集原。每孔加入25 μL生理鹽水,第1 個(gè)空孔加入25 μL 處理過的血清樣品,稀釋至最后一孔,丟棄最后一孔的最后25 μL。每孔(1 ∶1)加入等體積(25 μL)含有4 個(gè)血凝單位病毒的生理鹽水,最后加入1%雞紅細(xì)胞懸液50 μL。小心地敲擊滴定板的4 個(gè)側(cè)面進(jìn)行混合。在室溫下放置30 min 后讀取抗體滴度[11]。

1.2.5 病理學(xué)檢測

腹腔注射0.4 mL(3%戊巴比妥鈉)安樂死樹鼩,采集鼻甲、咽、氣管和肺組織,4%多聚甲醛固定液固定,石蠟包埋切片,HE 染色鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)。兩組間的數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),組間比較采用方差分析,組間比較用單因素方差分析。P＜0.05 為具有顯著性差異。GraphPad Prism 7.0 用于繪圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩的體征及溫度變化

所有樹鼩0 d 的臨床體征均正常,感染后1～7 d,M 組樹鼩出現(xiàn)活動遲緩、被毛蓬亂、食欲減退和鼻咽分泌物增加等的臨床體征,并在9 d 逐漸消失。M 組樹鼩在接種流感病毒株后體溫有所升高,2 d到達(dá)最高為39.2℃。與B 組相比,M 組溫度顯著性升高(P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

圖1 H1N1 病毒感染樹鼩后的體溫變化Note.Compared with group B,*P ＜0.05.Figure 1 Body temperature of tree shrews infected with H1N1 virus

2.2 樹鼩體內(nèi)的流感病毒復(fù)制

感染后1～10 d 收集樹鼩咽拭子、鼻拭子和血液樣品。鼻拭子中的病毒載量在1～2 d 達(dá)到峰值后開始下降,10 d 略有增加。咽拭子和鼻拭子的病毒載量趨勢大致相同。血液中的病毒載量在3 d 開始出現(xiàn),5 d 到達(dá)最高,且可持續(xù)至10 d(見圖2)。

圖2 H1N1 感染樹鼩后鼻拭子、咽拭子和血清中的病毒載量變化情況Figure 2 Changes on viral load in nasal swabs,pharyngeal swabs and serum of tree shrews infected with H1N1 virus

感染后2 d 鼻甲、咽部、氣管和肺部組織可檢測到病毒載量(約1 × 102～3copies/mL),一直持續(xù)到10,5 d 有明顯的峰值,以肺組織病毒載量表達(dá)最高(見圖3)。

圖3 H1N1 病毒感染樹鼩后不同時(shí)間鼻甲、咽、氣管和肺組織的病毒載量變化Figure 3 Changes of viral load in turbinate,pharynx,trachea and lung tissues during different time after infection with H1N1 virus infection in tree shrews

2.3 血清病毒載量及特異性抗體

感染后3 d 血液中可檢測病毒到載量,在5 d 達(dá)到峰值。感染后2 d 開始產(chǎn)生血清抗體,并一直呈上升趨勢,表明病毒感染樹鼩后在體內(nèi)可復(fù)制,呈持續(xù)性感染狀態(tài)后不斷產(chǎn)生血清抗體(見圖4)。

圖4 血液中病毒載量及抗體水平Figure 4 Viral load and antibody levels in blood

2.4 樹鼩組織的病理變化

在感染后3、5 和10 d 取鼻甲、咽、氣管和肺組織進(jìn)行病理檢查(見圖5)。病理結(jié)果顯示,B 組樹鼩的鼻甲、咽、氣管和肺組織未見明顯病理改變(圖5a,5b,5c,5d)。M 組樹鼩的鼻甲3 d 有一定程度的損傷(圖5e),5 d 和10 d 沒有明顯的病理改變(圖5i,5m)。3、5 d 咽組織上皮細(xì)胞壞死、脫落(圖5f,5j),10 d 未見明顯病理改變(圖5n)。感染后3、5、10 d 氣管組織均出現(xiàn)上皮細(xì)胞壞死和脫落(圖5g,5k,5o),隨著感染天數(shù)的增加,損傷逐漸加重。3 d肺組織無明顯病理變化(圖5h),5 d 肺泡壁出現(xiàn)小面積增厚(圖5l),伴有少量的炎性細(xì)胞浸潤,10 d肺泡壁大面積增厚(圖5p),伴有少量的炎性細(xì)胞浸潤。

圖5 H1N1 感染樹鼩后不同時(shí)間點(diǎn)鼻甲、咽、氣管和肺組織的病理變化Figure 5 Pathological changes of turbinate,pharynx,trachea and lung tissues of tree shrews infected with H1N1 during different time

組織病理結(jié)果提示,流感病毒經(jīng)上呼吸道感染先損害鼻甲和咽,并逐漸蔓延至氣管和肺,最后導(dǎo)致肺部感染,引起肺組織的病理實(shí)質(zhì)性改變。

3 討論

抗流感病毒藥物和疫苗的研發(fā)都需要合適的動物模型。理想的流感動物模型,需要比較全面的模擬流感疾病的臨床表現(xiàn)及病理變化[12]。目前常用于建立流感模型的動物有雪貂、小鼠和非人靈長類等。雪貂和人類在肺生理學(xué)、細(xì)胞受體分布和感染臨床癥狀方面有相似之處[13],并且易感,主要用于傳播力方面的研究及致病機(jī)制研究,但個(gè)體差異較大,價(jià)格較貴,商品化試劑少。小鼠成本較低,但小鼠個(gè)體較小,不易觀察到疾病的表現(xiàn),并且許多流感毒株需要提前經(jīng)過適應(yīng)之后,才能成功感染小鼠。恒河猴、食蟹猴等其他非人靈長類動物不易操作,價(jià)格昂貴,存在一定的倫理方面的制約[14]。本研究選擇樹鼩來建立流感動物模型,在動物出現(xiàn)流感樣的臨床癥狀、血清病毒復(fù)制及抗體和病理變化上進(jìn)行有益的探索。樹鼩是一種小型的非靈長類哺乳動物,樹鼩與人類在生理學(xué)、分類學(xué)、基因組學(xué)及免疫學(xué)等生理生化特性方面的相似性高于常用的雪貂、小鼠等實(shí)驗(yàn)動物。我們的研究結(jié)果表明,H1N1 A/PR8/34 流感病毒在樹鼩呼吸道能夠有效復(fù)制,在下呼吸道表現(xiàn)出典型的流感癥狀和病理變化,如急性支氣管炎和肺炎[15]。

人流感的臨床癥狀主要以流涕、咳嗽、肌肉酸痛等為主要表現(xiàn)[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)流感病毒感染樹鼩后,樹鼩表現(xiàn)主要以鼻腔分泌物增加、流涕為主,也存在被毛蓬亂及精神萎靡;恒河猴及食蟹猴等非人靈長類動物模型臨床表現(xiàn)為流涕,打噴嚏,還有呼吸困難等癥狀[17];小鼠模型表現(xiàn)反應(yīng)遲鈍,豎毛,弓背,食欲減退甚至出現(xiàn)死亡;雪貂模型出現(xiàn)厭食、體重減輕、昏睡等癥狀[18]。相比而言,樹鼩模型表現(xiàn)的臨床癥狀與非人靈長類動物甚至人的表現(xiàn)和程度更為相似。

病毒載量及抗體可以反映病毒復(fù)制與自我防御機(jī)制之間的相互作用[19],高峰通常出現(xiàn)在出現(xiàn)癥狀時(shí)[20]。樹鼩感染流感病毒后,鼻、咽拭子在1 d和2 d 達(dá)到高峰,可以達(dá)到1 × 108copise/mL,這與人類感染流感病毒后出現(xiàn)的病毒載量高峰相似[21],與恒河猴感染流感病毒的趨勢相似但有些許不同。恒河猴感染流感病毒后,在1 d 和2 d 達(dá)到高峰,5 d和6 d 再次上升[22]。小鼠感染流感病毒后肺部可能出現(xiàn)肺炎癥狀[23],病毒載量也可以檢測到,但未發(fā)現(xiàn)與人類相似的峰值[24],并且小鼠的臨床癥狀與人類不相似,更容易死亡[25],這是由于小鼠呼吸道中的受體分布及蛋白質(zhì)的相互作用與人類不同所導(dǎo)致的[26]。這從另一個(gè)方面反映出樹鼩作為流感動物模型比大鼠和小鼠更接近靈長類動物。根據(jù)臨床的回顧性研究,病毒載量可以在人呼吸道中長期存在[27],這和我們的結(jié)果相一致,在10 d 依然可以鼻甲、咽、氣管及肺中檢測到流感的病毒載量。H1N1 流感病毒的主要感染為氣管支氣管炎,大量病毒附著于氣管和支氣管[28]。因此,我們還檢測了鼻甲、氣管、咽和肺組織中的病毒載量。發(fā)現(xiàn)2 d 即可在鼻甲、氣管、咽組織中測出病毒載量,5 d 達(dá)到峰值,最高可達(dá)到1 × 109copise/mL,各組織病毒載量趨勢一致。說明病毒在次日開始復(fù)制,并逐漸擴(kuò)散至下呼吸道。流感病毒通過直接病毒感染或免疫系統(tǒng)反應(yīng)造成的損害影響呼吸道[29]。肺組織病毒載量在5 d 達(dá)到高峰,同時(shí)出現(xiàn)病理損傷。表明流感病毒隨著時(shí)間的推移逐漸從上呼吸道傳播到下呼吸道,感染組織器官。之后,病毒載量緩慢下降,因?yàn)榱鞲胁《究梢愿腥痉蝺?nèi)皮細(xì)胞并造成損傷,但提示不能在肺內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)一步復(fù)制[30]。而小鼠肺的病毒載量高峰則在3 d[31]。10 d 各組織中病毒載量仍可以檢測到,有動物實(shí)驗(yàn)表明,肺中的病毒載量一般要25 d 才能完全清除[32]。

從病理結(jié)果可以看出,樹鼩感染流感病毒3 d后,首先在鼻甲中進(jìn)行復(fù)制并產(chǎn)生損傷,然后是咽部,隨著時(shí)間的推移,病毒逐漸擴(kuò)散并在肺組織中復(fù)制,氣管損傷持續(xù)存在,肺泡出現(xiàn)彌漫性的增厚,說明存在炎性病變,這與感染病人的尸檢報(bào)告一致,人感染后可出現(xiàn)氣管和支氣管炎[33],支氣管壁的上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞脫落和壞死,肺出現(xiàn)了彌漫性間質(zhì)性肺炎[34]。樹鼩感染流感病毒表現(xiàn)的癥狀和人類似的癥狀是由于受體分布和人類似[5],可能更能模擬人感染流感病毒的病理變化情況。

在之前的報(bào)道中,流感病毒可以在沒有適應(yīng)的情況下感染樹鼩[5],這說明有新的流感病毒流行的時(shí)候,樹鼩可以作為一種快速替代模型。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明,甲型流感可以感染樹鼩并引起肺炎。樹鼩的癥狀與人類高度相似,有體溫升高、流涕等臨床癥狀[35]。在鼻咽拭子中,可以連續(xù)檢測血液和組織中的病毒載量,并誘導(dǎo)血清中特異性抗體的形成。樹鼩能較好地模擬流感病毒感染后的病毒復(fù)制和病理變化,是很好的流感動物模型。樹鼩的優(yōu)勢是存在與人類相似的唾液酸受體,基因組與人類相似。流感病毒無需適應(yīng)即可感染樹鼩。飼養(yǎng)方便、體型小、價(jià)格低也是樹鼩的優(yōu)點(diǎn)。本研究建立的樹鼩感染模型在臨床表現(xiàn)、病毒復(fù)制和病理變化等方面均能滿足H1N1 流感病毒疾病模型的建模要求,此模型可以對開展甲型流感病毒的作用機(jī)制、藥物評價(jià)及疫苗學(xué)研究有較好的參考意義。