張銳虎 姚茹 史澤雅郭民霍怡彤侯佳楠陳朝陽*

(1.山西醫(yī)科大學實驗動物中心,太原 030001;2.山西省實驗動物與人類疾病動物模型重點實驗室,太原 030001)

氧化應(yīng)激與炎癥是造成許多疾病發(fā)生的重要原因,如急性肺損傷等[1]。因此,尋找同時具有抗炎與抗氧化作用的藥物將對此類疾病的治療具有積極作用。RAW264.7 細胞是小鼠巨噬細胞,巨噬細胞在一些炎性組織損傷中起關(guān)鍵作用,是一種主要的免疫效應(yīng)細胞[2]。LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分,會通過抑制Nrf2/HO-1 通路與激活NFκB、MAPK 通路刺激巨噬細胞ROS 含量的增加和炎癥介質(zhì)的生成[3]。近年來,許多傳統(tǒng)藥物的活性成分被提取用于疾病的研究[4],其中蓮心堿是一種二芐基四氫異喹啉類生物堿,從蓮子中分離得到,具有抗高血壓、抗心律失常、血管平滑肌等生物活性[5]。已報道蓮心堿對叔丁基過氧化氫誘導的人肝細胞HepG2 細胞系氧化應(yīng)激具有細胞保護作用[6],還可抑制大鼠灌注后炎性因子TNF-α 和IL-1的表達[7],但并未報道其抗氧化抗炎作用靶點,前期我們也在動物水平證明了蓮心堿通過抗氧化與抗炎作用對急性肺損傷具有顯著預防效果[8]。因此,本研究我們將在細胞水平對蓮心堿抗炎抗氧化作用及分子機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

RAW264.7 細胞購于上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器

蓮心堿(HPLC ≥98%)(北京中科質(zhì)檢生物有限公司,批號:2586-96-1,中國);脂多糖(Sigma 公司,美國);TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司,中國);CCK-8、NO、PGE2試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);ROS、GSH、MDA、SOD 試劑盒(南京建成生物工程研究所,中國);PrimeScriptTMRTMasterMix、SYBR PremixEX TaqⅡ(TaKaRa 公司,日本);一抗、二抗(CST 公司,美國);β-actin、COX-2、iNOS 引物由上海生工合成;化學發(fā)光成像儀(G-Box Chemixx9,Syngene 公司,英國);流式細胞儀(FACS-Calibur,BD 公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

RAW264.7 細胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(89%的DMEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%的100 IU/mL 青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中(37℃和5% CO2)。

1.2.2 CCK-8 毒性檢測

將RAW264.7 細胞接種到96 孔板(5 × 104個細胞/孔)中,培養(yǎng)24 h 后,加入100 μL 不同濃度(0、0.25、0.5、1、2、4、8 和16 μmol/L)的蓮心堿。24 h后,倒掉培養(yǎng)基,每孔加入10 μL 的CCK-8 和100 μL 含蓮心堿的培養(yǎng)液,孵育4 h 后在酶標儀450 nm 下檢測吸光度。

1.2.3 細胞炎癥相關(guān)指標的測定

RAW264.7 細胞被接種到24 孔板(1 × 105個細胞/孔)中,培養(yǎng)24 h 后,加入100 μL 不同濃度的蓮心堿(0.5、1、2 μmol/L)2 h,用LPS(2 μg/mL)刺激24 h。將細胞培養(yǎng)液離心(2000 rpm,10 min)后吸取上清至新的離心管,在各孔細胞中均加入50 μL Griess Reagent Ⅰ、Griess Reagent Ⅱ后輕輕振蕩,于540 nm 下檢測,以測定NO 濃度。按ELISA 試劑盒說明書檢測上清液中PGE2、TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量。

1.2.4 qRT-PCR

RAW264.7 細胞被接種在6 孔板(2 × 105個細胞/孔),培養(yǎng)24 h,隨后用不同濃度的蓮心堿(0.5、1、2 μmol/L)處理細胞2 h,用2 μg/mL LPS 刺激細胞12 h。采用TRIzol 試劑裂解細胞提取總RNA 后進行濃度測定,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進行qRT-PCR 檢測,結(jié)果以2-ΔΔct相對表達量表示。引物為:COX-2:F:5′-CTGGAACATGGACTCACTCAGTTTG-3′,R:5′-AGGCCTTTGCCACTGCTTGTA-3′;iNOS:F:5′-CAAGC ACATTTGGGAATGGAGA-3′,R:5′-CAGAACTGAGGG TACATGCTGGAG-3′;β-actin:F:5′-CAAGCACATT TGGGAATGGAGA-3′,R:5′-CAGAACTGAGGGTACAT GCTGGAG-3′。

1.2.5 細胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標的測定

RAW264.7 細胞被接種在6 孔板(2 × 105個細胞/孔),培養(yǎng)24 h,隨后用不同濃度的蓮心堿(0.5、1、2 μmol/L)處理細胞2 h,用2 μg/mL LPS 刺激細胞1 h。孵育30 min(10 μmol/L DCFH-DA,37℃),收集細胞懸液離心(1000 r/min,10 min),倒掉上清加200 μL Binding Buffer 用流式進行檢測,結(jié)果以平均熒光強度值表示,代表ROS 含量。

RAW264.7 細胞被接種到6 孔板(2 × 106個細胞/孔),培養(yǎng)24 h 后,加入100 μL 不同濃度的蓮心堿(0.5、1、2 μmol/L)2 h,用2 μg/mL LPS 刺激12 h,倒掉上清,收集細胞后根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書測定MDA、SOD 和GSH 的含量。

1.2.6 Western Blot

將3 × 106細胞接種于T25 細胞培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)12 h,隨后用0.5、1、2 μmol/L 的蓮心堿干預細胞6 h,2 μg/mL LPS 誘導細胞1 h。PBS 清洗兩次細胞,加入1 mL 裂解液冰上裂解30 min,吸至離心管中離心(12 000 rpm,10 min,4℃),吸取上清測蛋白濃度,加入Loading Buffer 后煮沸5 min。進行凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育過夜,二抗孵育,曝光,用Image J 進行條帶分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計學分析,結(jié)果以平均值± 標準差()表示,兩組比較采用LSD-t檢驗,P＜0.05 與P＜0.01 被認為差異具有顯著性以及差異極具顯著性。

2 結(jié)果

2.1 蓮心堿對LPS 刺激的RAW264.7 細胞具有抗炎作用

當用0～4 μmol/L 蓮心堿處理時,細胞存活率沒有降低,我們在隨后的實驗中使用了無毒濃度(0.5、1 和2 μmol/L)蓮心堿。

如圖1 所示,與對照組相比,LPS 組NO(表示為亞硝酸鹽)、PGE2 和促炎性細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1)的含量顯著增加(P＜0.01),與LPS 組相比,蓮心堿組顯著抑制了這些促炎介質(zhì)的生成(P＜0.01),且與蓮心堿劑量呈依賴性。

圖1 蓮心堿對LPS 誘導的RAW264.7 巨噬細胞的NO、PGE2、TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量的影響Note.Compared with the control group,#P ＜0.05,##P ＜0.01.Compared with the LPS group,*P ＜0.05,**P＜0.01.(The same in the following figures)Figure 1 Effects of LIE on the concents of NO,PGE2,TNF-α,IL-6 and IL-1β in LPS-induced RAW264.7 Macrophages

2.2 蓮心堿抑制了LPS 誘導的RAW264.7 細胞中 COX-2、iNOS mRNA 表達和NF-κB、MAPK通路

qRT-PCR 結(jié)果如圖2A,2B 所示,與對照組相比,LPS 組COX-2 與iNOS mRNA 表達量顯著升高(P＜0.01),蓮心堿處理后,與LPS 組相比,顯著降低了COX-2 與iNOS 的mRNA 表達量(P＜0.01)。

Western Blot 檢測結(jié)果如圖2C,2D,2E,2F 所示,與對照組相比,LPS 組IκBα 顯著發(fā)生降解和磷酸化,NF-κB p65、p38、ERK1/2、JNK1/2 顯著發(fā)生磷酸化(P＜0.05);與LPS 組相比,蓮心堿組顯著抑制了IκBα 的降解和磷酸化以及NF-κB p65、p38、ERK1/2 和JNK1/2 的磷酸化(P＜0.05),這些結(jié)果表明蓮心堿可以抑制NF-κB 和MAPK 通路。

圖2 蓮心堿對LPS 誘導的RAW264.7 巨噬細胞的COX-2 和iNOS 的表達以及NF-κB 和MAPKs 通路的影響Figure 2 Effects of LIE on iNOS mRNA expression and NF-κB and MAPKs pathway in LPS -induced RAW264.7 Macrophages

2.3 蓮心堿對LPS 誘導的RAW264.7 細胞的抗氧化作用

如圖3 所示,通過對平均熒光值分析表明,與對照組相比,LPS 組的ROS 生成增加,但使用蓮心堿進行處理后,ROS 生成顯著減少(P＜0.01),LPS組MDA 含量顯著增加,GSH 含量和SOD 活性顯著降低(P＜0.01),蓮心堿進行處理后,MDA 含量顯著減少,SOD 活性和GSH 含量顯著增加(P＜0.01)。

2.4 蓮心堿激活了LPS 誘導的RAW264.7 細胞中Nrf2/HO-1 通路

如圖4 所示,與LPS 組相比,蓮心堿組Keap1表達顯著降低,并以劑量依賴的方式促進Nrf2 和HO-1 表達(P＜0.05)。這些結(jié)果表明,蓮心堿有效地激活了Nrf2/HO-1 通路。

圖4 蓮心堿對LPS 誘導的RAW264.7 巨噬細胞中Nrf2/HO-1 通路的影響Figure 4 Effects of LIE on Nrf2/HO-1 pathway in LPS-induced RAW364.7 macrophages

3 討論

炎癥與氧化應(yīng)激是互相依賴存在的[9],許多疾病同時伴隨著炎癥與氧化應(yīng)激的發(fā)生,如急性肺損傷,蓮心堿已被證實具有抗炎抗氧化作用[8],但分子機制尚未明確,因此明確其抗炎抗氧化機制對于此類疾病的治療具有重要意義。我們通過LPS 誘導RAW264.7 細胞不僅驗證了蓮心堿的抗炎抗氧化作用而且證明了其抗炎抗氧化作用的機制。

PGE2 和NO 是兩種重要的促炎介質(zhì)[10];iNOS向體內(nèi)傳遞氣體信號并參與NO 的產(chǎn)生;環(huán)氧合酶COX-2 參與PGE2 的產(chǎn)生[11]。我們的研究表明,蓮心堿通過降低COX-2 和iNOS 的轉(zhuǎn)錄水平,顯著降低了PGE2 和NO 的生成。TNF-α、IL-1β 和IL-6 作為促炎因子可以促進炎癥[12]。我們的研究結(jié)果表明,蓮心堿能顯著降低TNF-α、IL-1β 和IL-6 的釋放,從而證實了蓮心堿的抗炎活性。LPS 通過促進IκBα 的降解,將重要的抗炎分子靶標NF-κB 從IκBα 中分離出來。許多炎癥介質(zhì),包括誘導型iNOS 和COX-2,將隨著NF-κB 進入細胞核而增加表達[13-14]。當LPS 誘導炎癥時,MAPK 信號通路被激活,P38、ERK 和JNK 被磷酸化,還調(diào)節(jié)某些基因的轉(zhuǎn)錄水平,包括iNOS 和COX-2[15-16]。在我們的研究中,蓮心堿阻斷了IκBα 的降解,并抑制了p65、p38、ERK 和JNK 的磷酸化。因此,蓮心堿的抗炎作用可能是通過抑制NF-κB 和MAPK 通路來實現(xiàn)的。

當機體發(fā)生氧化應(yīng)激會產(chǎn)生過量的ROS,破壞抗氧化系統(tǒng),致使細胞發(fā)生氧化性損傷[17]。MDA可以破壞細胞膜,這是氧化應(yīng)激的標志,氧化應(yīng)激造成的損害可以通過抗氧化酶的活性得到改善,包括SOD 和GSH[18-19]。實驗表明,蓮心堿能顯著降低LPS 誘導的ROS 和MDA 的生成。此外,LPS 誘導巨噬細胞會降低GSH 水平和SOD 活性,蓮心堿可以有效地逆轉(zhuǎn)這一改變。許多天然植物化合物可以通過Nrf2/HO-1 途徑減輕LPS 誘導的氧化應(yīng)激。當抗氧化分子進入細胞時,Nrf2 從Keap1 分離并移位到細胞核,上調(diào)HO-1 的表達,從而發(fā)揮抗氧化作用[20]。我們的研究表明,用蓮心堿處理后顯著增加了Nrf2 和HO-1 的核表達,降低了Keap1 的表達。在此,我們證明了蓮心堿可能通過激活Nrf2/HO-1 通路來減輕LPS 引起的氧化應(yīng)激。

綜上所述,蓮心堿通過抑制NF-κB 和MAPK 信號通路,從而抑制iNOS 和COX-2 的表達和促炎因子(TNF-α、IL-1β 和IL-6)的釋放,發(fā)揮抗炎作用;通過活化Nrf2/HO-1 通路,抑制ROS、MDA 的生成,增加SOD 的活性和GSH 的含量,發(fā)揮抗氧化作用。本研究對蓮心堿抗炎抗氧化作用機制的研究期望可以為伴有炎癥與氧化應(yīng)激的疾病的治療提供一個新的方向。