白萬輝 趙勇 王旋 陳泓穎 韋俊余 秦偉凱

1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029 2.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102

骨質疏松性骨折(osteoporosis fracture，OF)多是原發(fā)性骨質疏松患者首次就診的原因，亦是骨質疏松癥最嚴重的后果，危險因素包括種族、性別、老齡化、脆性骨折家族史等[1]。骨折部位常見于脊柱、髖部、橈骨遠端等部位。其治療遵循復位、固定、功能鍛煉和抗骨質疏松的原則，中藥被認為對骨折愈合及預防再發(fā)骨折具有積極意義[2]。

《景岳全書》指出其屬“骨折病”范疇，腎虛血瘀是重要病機之一[3-4]，桃紅四物湯是中醫(yī)骨傷科常用方劑，臨床多加味使用治療該病?，F(xiàn)代藥理學證實其中藥物具有活血化瘀、鎮(zhèn)痛、促進骨折愈合、抗炎、提高免疫力等作用[5-6]。相關臨床試驗表明其對OF急性期消腫止痛及促進骨折愈合顯示出良好療效[7-9]，但相關作用機制尚不十分明確。

本研究使用網(wǎng)絡藥理學篩選方藥中主要活性成分及其潛在作用靶點，并通過分子對接技術驗證有效成分與作用靶點之間活性，意在發(fā)掘桃紅四物湯治療OF潛在活性成分及作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物主要活性成分和潛在靶點

通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP，收集熟地黃、白芍、當歸、川芎、桃仁、紅花的化學成分，構建數(shù)據(jù)庫，利用生物利用度(OB≥30%)和類藥性指數(shù)(DL≥0.18)篩選，選擇不同藥物的主要活性成分及潛在靶點，靶點通過UniProt數(shù)據(jù)庫轉換為人類相應標準基因。

1.2 疾病靶點篩選

以“Osteoporosis fracture”或“Fragility fracture”或“Osteoporotic fracture”為檢索詞分別根據(jù)數(shù)據(jù)庫特性進行檢索：GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫，刪除重復靶點，最終確定OF疾病靶點。

1.3 構建“藥物-成分-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡圖

使用venny2.1軟件將桃紅四物湯有效成分的靶點與OF疾病靶點取交集，得到的共有靶點同有效成分、疾病、藥物為網(wǎng)絡中的節(jié)點(node)，四者之間的相互作用為網(wǎng)絡中的連接(edge)，制成表格，并通過 Cytoscape 3.8.2軟件構建。

1.4 交集靶點的蛋白互作網(wǎng)絡

將1.3交集靶點上傳STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，選擇物種為homo sapiens，獲得相關信息，導入Cytoscape軟件中利用工具cutoHubba，構建蛋白相互網(wǎng)絡(PPI)，分析各靶點之間的作用關系，并結合可視化網(wǎng)絡圖篩選出核心靶點。

1.5 基因本體論(GO)及KEGG通路富集分析

Metascape數(shù)據(jù)庫導入交集靶點，選擇物種為homo sapiens，獲取具有顯著性的富集信息(P<0.05)，其中GO及KEGG富集分析結果各選取P值最小的20條，將相關信息(富集名稱、P值、Count)運用在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)分別進行GO及KEGG富集氣泡圖繪制。

1.6 分子對接

1.3中degree值前3活性成分作為配體、1.4中degree前3靶蛋白作為受體，從PDB數(shù)據(jù)庫中獲取靶蛋白3 D結構，用Pymol2.4.1進行預處理。Pubchem數(shù)據(jù)庫獲取有效成分的sdf結構，通過OpenBabel轉換成mol2文件。通過Autodock Tools1.5.6軟件將受體和配體分別進行處理，AutoDock Vina計算結合能，最終通過Pymol可視化數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 藥物主要活性成分和潛在靶點

桃紅四物湯中熟地黃(2)、白芍(13)、當歸(2)、川芎(7)、桃仁(23)、紅花(22)藥物有效成分69個，將篩重后44個有效成分編碼Id(表1)；通過UniProt轉化得到的標準基因靶點代碼(Symbol)，篩重后得到潛在靶點229個。

表1 桃紅四物湯主要活性成分信息Table 1 Information on the main active ingredients of Taohong Siwu decoction

2.2 桃紅四物湯與OF共有靶點

獲得疾病相關靶點3 752個，篩重后剩余3 639個，與桃紅四物湯有效成分潛在靶點，使用Venny2.1軟件取交集，得到共有靶點152個，見圖1。

圖1 桃紅四物湯活性成分靶點和OF靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of active component target in Taohong Siwu decoction and disease target in OF

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡圖

網(wǎng)絡圖共包括203個節(jié)點，535條相互作用關系，見圖2。不同顏色和形狀的節(jié)點代表信息不同，其中紅色三角節(jié)點代表疾病，綠色圓形節(jié)點代表中藥，墨綠色菱形代表共有靶點，各色八邊形代表不同的有效成分，V形代表相同有效成分，連線代表四者之間的相互作用關系。根據(jù)degree值顯示node大小，越大表示在網(wǎng)絡中連接程度越高。根據(jù)degree值篩選出前10的關鍵活性成分，見表2。

圖2 桃紅四物湯“藥物-有效成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖Fig.2 The network of drug-active ingredients-target-disease of Taohong Siwu decoction

表2 藥物-有效成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖有效成分及PPI靶點蛋白(Degree前10)

2.4 交集靶點的蛋白互作網(wǎng)絡

將共有靶點152個上傳STRING數(shù)據(jù)庫獲取蛋白之間的作用關系，構建蛋白相互網(wǎng)絡(PPI)(圖3)，根據(jù)degree值分析出前10核心靶點，見表2。

圖3 桃紅四物湯治療OF蛋白互作網(wǎng)絡圖Fig.3 Protein-protein interaction network regarding Taohong Siwu decoction in the treatment of OF

2.5 基因本體論(GO)及KEGG通路富集分析

GO富集分析獲得生物過程(BP)5 881個、細胞組成(CC)和分子功能(MF)分別為503和465個，共6 849個條目(P<0.01)。從生物過程的相關條目分析，桃紅四物湯治療骨質疏松性骨折的靶點主要參與對無機物及激素、傷害應激、細胞凋亡增殖、生長因子等過程；細胞組成方面，治療靶點主要覆蓋細胞膜閥、囊泡腔、轉錄因子復合體、蛋白激酶復合物等區(qū)域；分子功能相關條目主要針對轉錄因子結合、核受體活性、蛋白激酶結合等過程。每個模塊分別根據(jù)P值排序前20位(圖4)。KEGG通路富集分析共得到465條信號通路，篩選排名前20條條目(圖5)。主要涉及癌癥途徑、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、乙肝、IL17、PI3K-Ak、HIF-1、多種激素、鈣等多種信號通路，與炎癥反應、骨代謝、血管生成和免疫調節(jié)密切相關。

圖4 GO富集分析(排名前20)Fig.4 GO enrichment analysis (top 20)

圖5 KEGG 信號通路分析 (排名前20)Fig.5 KEGG channel analysis (top 20)

2.6 分子對接驗證

關鍵活性成分與靶蛋白的分子對接穩(wěn)定，兩者具有較好的結合活性(表3)。以槲皮素和AKT1蛋白結構對接模式為例，槲皮素能穩(wěn)定地對接到AKT1蛋白結構活性口袋中，說明槲皮素與AKT1具有良好的結合作用，見圖6。

表3 活性成分與核心靶點蛋白的結合能(kJ/mol)

圖6 槲皮素與AKT1的分子對接模式圖Fig.6 Molecular docking picture of quercetin and AKT1

3 討論

本研究結果顯示，桃紅四物湯含有多種有效成分如槲皮素、木犀草素、山奈酚、多種甾醇、黃芩素等均是網(wǎng)絡中的重要節(jié)點，它們多屬于桃仁、紅花，體現(xiàn)了君藥在方劑中的決定性作用。結合相關的基礎與臨床研究，這些成分具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎、調控細胞增殖分化、改善骨代謝、抗腫瘤及免疫調節(jié)等作用[10-13]，在OF治療中扮演著重要的角色。

從蛋白相互網(wǎng)絡和可視化網(wǎng)絡圖的結果來看，IL6、JUN、AKT1、MAPK1、TNF等可能是桃紅四物湯治療OF的關鍵靶點，這也體現(xiàn)了桃紅四物湯治療OF具有多靶點的特點。有研究表明[14-15]，IL-6可作用于破骨細胞的早期階段，刺激破骨細胞前體細胞分裂增殖，影響成骨細胞活性，同時使成骨細胞通過胞間接觸，產生具有前列腺素、IL1、集落刺激因子等的微環(huán)境，并使得破骨細胞發(fā)揮骨吸收的作用，研究證實絕經(jīng)后雌激素水平降低導致IL6產生過量，二者表現(xiàn)出負相關。JUN屬于AP-1轉錄因子家族，主要參與細胞增殖、免疫相關、凋亡抑制等信號通路，有研究表明[16]，JUN通過Wnt通路參與成骨細胞的形成，使得骨質增加，骨長度變短。AKT1是PI3K/AKT信號通路中核心因子，主要通過調控細胞增殖和生長，參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的細胞過程[17]。MAPK1屬于整合多個生化信號，參與如轉錄調控、增殖分化及發(fā)育等復雜的細胞過程[18]。破骨細胞樣細胞及成骨細胞合成TNF，已證明的TNFα可以直接對成骨細胞的增殖、分化產生影響，從而抑制膠原合成、AKP活性和骨鈣素合成[19]。由此可知，桃紅四物湯可通過參與細胞免疫反應、骨細胞增殖分化、細胞代謝、炎癥反應等治療OF。

富集分析發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯治療OF多作用于RANKL-RANK啟動的下游信號通路，如PI3K/Akt、NF-κB、MAPK信號通路等[20-21]，OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)具有重要的信號轉導作用[22]，在介導破骨細胞分化和功能的過程中，起到抗骨質疏松的作用[23]。腫瘤、糖尿病、甲狀腺激素信號通路可能與繼發(fā)性OF密切相關，本研究重點介紹桃紅四物湯活性成分起到抗炎免疫、細胞修復、調節(jié)骨細胞等的作用通路。IL17家族通過相應受體信號并激活下游信號通路如NF-KappaB、MAPKs和C/EBPs，誘導多種具有抗炎及修復功能的因子表達，從而將髓樣細胞吸引到炎癥部位[24]。NF-kappaB屬于NF-κb/Rel家族，是一種重要的轉錄因子，RANKL的信號經(jīng)RANK傳遞給TRAF6，TRAF6通過NIK(NF-κB可誘導性激酶)和IKK(NF-κB激酶誘導劑)活化NF-κB，與Ⅰ-KB分離后的NF-κB迅速進入細胞核，并和相應啟動子結合，以通過調控轉錄來調節(jié)破骨細胞的分化、功能和凋亡[25]。IL17A在骨髓中廣泛表達，其受體編碼蛋白還調節(jié)NF-κB和絲裂原激活的蛋白激酶的活性，并可以誘導炎癥信號如IL6和環(huán)氧合酶2(PTGS2/COX-2)的過表達，并有效增加一氧化氮(NO)的含量，對宿主防御反應、細胞轉運、免疫調控和組織修復重建具有重要影響，是炎性及多種疾病的關鍵環(huán)節(jié)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導因子-1(HIF-1)通過調控多種蛋白因子和多個經(jīng)典信號通路，起到促進細胞增殖分化；此外，HIF-1高表達可以促進長骨成骨[26]。桃紅四物湯治療OF是從多信號通路出發(fā)的，且通路之間存在緊密聯(lián)系。其他相關通路目前報道較少，還需要深入研究，以證實其作用機制。

綜上所述，桃紅四物湯從多靶點、多成分及多通路出發(fā)治療骨質疏松性骨折，證明中醫(yī)藥對本病的治療具有天然優(yōu)勢。本研究為骨質疏松及其合并癥的治療提供了循證證據(jù)，也為今后深入揭示其核心靶點作用機制奠定了基礎，對抗骨質疏松新藥的研發(fā)同樣具有意義。