章喻 張孫正遠(yuǎn) 王利波 王成龍 蔡玨峰 戴薇薇

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院科技中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)是激素治療最常見的不良反應(yīng)之一，以骨強(qiáng)度(骨密度和骨質(zhì)量)下降和骨折風(fēng)險(xiǎn)增高為特征。國內(nèi)多中心對(duì)曾經(jīng)或正服用糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)的風(fēng)濕病患者調(diào)查，90%存在骨量減少，GIOP發(fā)生率為41.4%，且抗GIOP藥物使用不規(guī)范。必須高度重視GC的負(fù)性作用，采取有效措施防治GIOP。雙膦酸鹽是“GIOP診治共識(shí)”的一線用藥[1]，但易引起胃腸道反應(yīng)、低鈣血癥、超敏反應(yīng)、腎功能損害[2]。

牛膝-杜仲是臨床常用于治療骨質(zhì)疏松的經(jīng)典藥對(duì)。牛膝成分β-蛻皮甾酮(βEcdysterone，βEcd)屬天然類固醇成分，具有廣泛的藥理作用[3]；杜仲成分松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside，PDG)為木脂素類化合物，具有廣泛的生物活性。課題組前期使用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)βEcd-PDG是牛膝-杜仲活性成分干預(yù)斑馬魚GIOP模型的較佳組合，可抑制高濃度地塞米松(dexamethasone，Dex)引起的斑馬魚脊椎骨量減少，并提高脊椎骨密度[4]。βEcd-PDG組合具有良好的協(xié)同作用，因此，本研究以GIOP小鼠模型進(jìn)一步探索βEcd-PDG治療骨質(zhì)疏松癥的可行性，以篩選防治GIOP的植物類中藥及其有效成分，減少激素類用藥。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

β-蛻皮甾酮，松脂醇二葡萄糖苷(純度≥98%，上海同田，5289-74-7、63902-38-5)，均以乙醇溶解、1×PBS稀釋；地塞米松(純度≥98%，美國Sigma Aldrich，D9184)，以乙醇溶解、聚乙二醇及1×PBS稀釋；阿侖膦酸鈉(純度≥97%，美國Sigma Aldrich，A4978)，以H2O溶解，1×PBS稀釋；ELISA試劑盒(上海生工，D721197-0096，D721053-0096)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天，P0010)；Caspase-3、Bax、Bcl-2、β-actin單克隆兔抗小鼠抗體(Cell Signaling Technology，9662 S、14796 S、3498 S、8457 S)，山羊抗兔IgG-HRP(辣根過氧化物酶)二抗(Biotech，MR-R100)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天，P0018FS)。

1.2 儀器設(shè)備

小鼠獨(dú)立通風(fēng)籠盒(IVC)系統(tǒng)(意大利Tecniplast，藍(lán)線)，小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)(美國Midmark Matrx，VMR)，超聲波粉碎機(jī)(美國 Fisher Scientific，CL-18)，三點(diǎn)力學(xué)彎曲試驗(yàn)儀(美國Instron，1195)，高分辨顯微CT掃描儀(美國Skyscan，1172)，酶標(biāo)儀(美國Biotek，Synergy H1 MF)，電泳儀與凝膠垂直電泳系統(tǒng)(美國 Bio-Rad, Mini Protean)，凝膠圖像拍攝系統(tǒng)(上海勤翔，Chemiscope 6300)，電子分析天平(德國Sartorius，BSA-124 S)，超低溫冰箱(美國Thermo Scientific,905-ULTS)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物病理模型制備、給藥及分組：SPF級(jí)2月齡雄性C57BL/6 WT小鼠，體重(23.8±1.5)g，購自江蘇集萃藥康生物科技公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證：SCXK(蘇)2018-0008]，飼養(yǎng)于上海龍華醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF環(huán)境[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYXK(滬)2018-0036]。隨機(jī)分為6組(n=8)：正常對(duì)照組(Ctrl)、模型組(Dex)、陽性對(duì)照阿侖膦酸鈉組(Dex+ALN)、βEcd組(Dex+βEcd)、PDG組(Dex+PDG)、βEcd+PDG組(Dex+βEcd+PDG)。Ctrl組皮下注射100 μL生理鹽水；Dex組與給藥組皮下注射Dex(2 mg/kg)；給藥組中，分別皮下注射ALN(0.5 mg/kg)、βEcd(0.5 mg/kg)、PDG(0.5 mg/kg)以及βEcd+PDG(劑量各為0.5 mg/kg，按1∶1比例配制)。上述藥物干預(yù)4周，每周5次。

1.3.2體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)測定：每周測量體重。取每周體重與實(shí)驗(yàn)初始體重比值，計(jì)算BMI。

1.3.3Micro CT檢測小鼠股骨密度：取右側(cè)股骨進(jìn)行Micro CT檢測。以相同參數(shù)(厚度9 μm，電壓49 kV，電流179 μA，旋轉(zhuǎn)步進(jìn)0.6°)掃描股骨生長板開始往下2.3 mm，使用NRecon軟件(1.7 version)對(duì)掃描圖像進(jìn)行3 D重建并定量分析皮質(zhì)骨骨密度(bone mineral density，BMD)。

1.3.4生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測各組小鼠股骨質(zhì)量：取左側(cè)股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，將其放置在支點(diǎn)跨距6 mm的2個(gè)支架上，在股骨中點(diǎn)以1 mm/min的持續(xù)位移速度施加彎曲載荷直至骨折。記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算生物力學(xué)參數(shù)，以彈性模量(elastic modulus)、彎曲強(qiáng)度(bending strength)、彎曲剛度(bending stiffness)、最大彎曲載荷(maximum bending load)為骨質(zhì)量測定指標(biāo)。

1.3.5ELISA法檢測血清β-骨膠原交聯(lián)及1型前膠原氨基端原肽濃度：實(shí)驗(yàn)結(jié)束收集血清，ELISA法檢測1型前膠原氨基端原肽(procollagen type-1 N-terminal propeptide，P1NP)及β-骨膠原交聯(lián)(beta crosslaps，β-CTx)濃度。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.6Western blot檢測小鼠脛骨組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)：Western blot檢測小鼠凋亡相關(guān)因子表達(dá)(n=3)。取左側(cè)脛骨加入組織細(xì)胞裂解液，破碎組織提取總蛋白，BCA法測定含量，變性蛋白；SDS-PAGE電泳(80 V，3 h)，轉(zhuǎn)膜(350 mA，1 h)，室溫封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜；TBST充分洗滌；二抗孵育1 h，TBST充分洗滌。ECL顯色；曝光、拍照；Image J軟件分析印跡的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 組合用藥對(duì)模型小鼠體重的影響

建立模型1周(9周)內(nèi)，Dex組體重下降，并隨時(shí)間推移逐漸下降，在第4周(12周)，Dex組體重明顯低于Ctrl組(P<0.05)。給藥1周內(nèi)，給藥組體重下降，在第2、3周不同程度回升；在第4周，βEcd+PDG明顯干預(yù)模型小鼠體重下降(P<0.05)，組合用藥效果具有優(yōu)于單獨(dú)用藥的趨勢(圖1)。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量指數(shù)測定Fig.1 Weight index of each group注：與 Control(Ctrl)組比較，*P<0.05；與 Dex組比較，#P<0.05。

2.2 組合用藥對(duì)小鼠股骨骨密度的影響

各組小鼠股骨皮質(zhì)骨三維重建見圖2A。Micro CT檢測(n=6)結(jié)果顯示Dex組股骨皮質(zhì)骨BMD明顯下降(P<0.05，圖2B)，用藥組皮質(zhì)骨BMD均高于Dex組(P<0.05，圖2B)，且組合用藥具有優(yōu)于單獨(dú)用藥的趨勢。

圖2 Micro CT檢測結(jié)果Fig.2 Results of micro CT test注：A：各組小鼠股骨皮質(zhì)骨三維結(jié)構(gòu)重建圖；B：骨密度。與 Control(Ctrl)組比較，*P<0.05；與Dex組比較，#P<0.05。

2.3 組合用藥對(duì)小鼠股骨骨質(zhì)量的影響

生物力學(xué)檢測(n=8)結(jié)果表明，Dex組股骨彈性模量、彎曲剛度、彎曲強(qiáng)度和最大負(fù)重載荷降低(P<0.05)，用藥組上述4個(gè)指標(biāo)具有均高于Dex組的趨勢。其中，ALN明顯提高模型小鼠股骨彈性模量和彎曲剛度(P<0.05)，βEcd-PDG則有效提高模型小鼠股骨彎曲強(qiáng)度和最大負(fù)重載荷(P<0.05)，見表1。

2.4 組合用藥對(duì)小鼠血清P1NP及β-CTx濃度的影響

Dex組血清P1NP濃度顯著降低，β-CTx濃度明顯上升(P<0.05，圖3)；βEcd、βEcd+PDG提高模型小鼠P1NP濃度(P<0.05，圖3A)；ALN、PDG及βEcd+PDG降低模型小鼠β-CTx濃度(P<0.05，圖3B)。

圖3 血清β-骨膠原交聯(lián)及1型前膠原氨基端原肽濃度檢測結(jié)果Fig.3 Results of concentrations of P1NP and β-CTx注：A：P1NP；B：β-CTx。與 Control(Ctrl)組比較，*P<0.05；與 Dex組比較，#P<0.05。

2.5 組合用藥對(duì)小鼠脛骨組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Dex組Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05，圖4A、4B、4C)，Bcl-2/Bax比值下降(P<0.05，圖4E)；βEcd、PDG及βEcd-PDG均上調(diào)Bcl-2表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值(P<0.05，圖4D、4E)，表明3種用藥方式均能保護(hù)骨組織細(xì)胞免受GC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而組合用藥具有優(yōu)于單獨(dú)用藥的趨勢。

圖4 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Expression of apoptosis-related protein using Western blotting注：A：各組蛋白的表達(dá)；B：Caspase-3/β-actin比值；C：Bax/β-actin比值；D：Bcl-2/β-actin比值；E：Bcl-2/Bax比值。與 Control(Ctrl)組比較，*P<0.05；與 Dex組比較，#P<0.05。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)牛膝成分βEcd可提高骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性，有效干預(yù)Dex引起的細(xì)胞凋亡[5-6]；杜仲成分PDG可抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射Dex(2 mg/kg)使小鼠體重明顯下降。βEcd-PDG有效增加模型小鼠體重，表明該用藥可能對(duì)小鼠的生長發(fā)育無不良影響。

骨的無機(jī)質(zhì)和有機(jī)質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)相互作用，使骨具有高硬度和抗骨折能力。βEcd-PDG顯著提高模型小鼠股骨皮質(zhì)骨BMD，提示該組合可增強(qiáng)小鼠骨礦物質(zhì)沉積，改善骨質(zhì)流失。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，βEcd-PDG可提高小鼠股骨彎曲強(qiáng)度和最大負(fù)重載荷，從而改善骨韌性和抗骨折能力。P1NP是成骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分，參與骨形成過程中骨礦物質(zhì)沉積[8]，是骨形成標(biāo)志物[9]；β-CTx是骨基質(zhì)蛋白Ⅰ型膠原的降解產(chǎn)物，是骨吸收標(biāo)志物[9]。實(shí)驗(yàn)表明，βEcd-PDG可明顯提升小鼠血清P1NP、降低β-CTx濃度，提示該組合可促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。上述指標(biāo)說明該組合通過促進(jìn)模型小鼠骨形成，增加骨密度、增強(qiáng)骨質(zhì)量，從而改善骨強(qiáng)度。

細(xì)胞凋亡是GIOP發(fā)生過程中的重要病理現(xiàn)象，導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡，骨質(zhì)損失、骨脆性增加。高劑量Dex可抑制成骨細(xì)胞分化與活性，減少骨細(xì)胞，延遲骨形成，減慢骨重塑，使骨量丟失[6,10]。Caspase-3等因子為凋亡信號(hào)通路的下游效應(yīng)物。Bcl-2家族控制細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑[11]，其中Bax是促凋亡蛋白，通過提高線粒體外膜通透性，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[11-12]；Bcl-2屬抗凋亡因子，通過結(jié)合Bax、降低線粒體膜通透性，提高細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗力[11]。Bcl-2/Bax比值反映了抗凋亡能力。實(shí)驗(yàn)表明，Dex上調(diào)小鼠Caspase-3、Bax等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值。βEcd-PDG上調(diào)Bcl-2、降低Bax表達(dá)，升高Bcl-2/Bax比值，βEcd-PDG可保護(hù)骨組織細(xì)胞免受GC誘導(dǎo)的凋亡，有利于骨穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)和骨形成。

綜上所述，β-蛻皮甾酮與松脂醇二葡萄糖苷組合應(yīng)用可促進(jìn)骨形成與轉(zhuǎn)化，提高骨強(qiáng)度，且二者的協(xié)同作用優(yōu)于單獨(dú)用藥，有利于防治GIOP，但其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。