陳賽楠 李生強 謝麗華 陳玄 黃景文 陳娟* 葛繼榮*

1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)重點研究室，福建 福州 350003 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是全身骨量降低和骨微結(jié)構(gòu)破壞引起的骨折風(fēng)險性增加為特征的代謝性骨骼疾病[1]；2018年我國首次居民骨質(zhì)疏松癥流行病學(xué)調(diào)查顯示50歲以上男性患病率為6.0%，與各國差異不大，而50歲以上女性患病率高達32.1%，顯著高于歐美國家(美國患病率為16.5%，加拿大為15.8%)[2]，是我國中老年女性面臨的嚴重健康問題，因此防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥尤其重要。

雙膦酸鹽類(bisphosphonates，BPs)是目前臨床治療應(yīng)用最廣泛的一線藥物，是焦磷酸鹽的穩(wěn)定類似物，與羥基磷灰石高親和力結(jié)合，減少破骨細胞分化從而抑制骨吸收，在提高骨密度上具有優(yōu)勢[3-5]。骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡是維持骨重建的關(guān)鍵，補腎健脾活血中藥復(fù)方可全方位地調(diào)節(jié)機體內(nèi)骨重建穩(wěn)態(tài)，聯(lián)合骨吸收抑制劑可能產(chǎn)生更好的協(xié)同作用[6-7]。續(xù)苓健骨方是課題組學(xué)術(shù)帶頭人葛繼榮研究員治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床驗方，已獲得國家發(fā)明專利(專利號：ZL201 510 784 227.4)，前期研究顯示其防治骨質(zhì)疏松癥的作用[8-10]。因此，本研究觀察續(xù)苓健骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級3月齡雌性SD大鼠50只，體重(180±20) g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬) 2018-0004，合格證編碼：20180004027331。實驗動物飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號：醫(yī)動學(xué)第23-016號，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2實驗藥物：續(xù)苓健骨方由骨碎補、續(xù)斷、茯苓、白術(shù)和甘草等12味中藥組成，每劑總重量122 g，購自福建鷺燕中宏醫(yī)藥有限公司；加10倍量水，浸泡0.5 h，沸騰后煎煮90 min，倒出藥液，藥渣再加10倍量水，沸騰后煎煮90 min，合并兩次藥液，加熱至恒重，刮下干膏，按比例1∶1加糊精，混勻，烘干，打粉，過14目篩網(wǎng)，60 ℃下烘干、整粒，過篩，收集顆粒劑。阿侖膦酸鈉片，規(guī)格：70 mg，杭州默沙東制藥有限公司，批準文號：國藥準字J20130085，產(chǎn)品批號：T014466。

1.1.3主要試劑與儀器：Rat S-CTX ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)、Rat PINP ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)、EASYspin Plus骨組織RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物)、Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR II(AG11711)、SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(AG11718)、Anti-Ephrin B2 antibody(abcam，ab131536)、EPHB4 Rabbit Polyclonal antibody(proteintech，20883-1-AP)、乙二胺四乙酸二鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、雙能X線骨密度儀(HOLOGIC，Discovery WS/N89006)、酶標儀( BIO-TEK, LX-800)、全自動石蠟切片機(Leica，RM2255)、熒光倒置顯微鏡(Leica，DMI 4000B)、Real-time PCR(ABI，7500 Fast)、多色熒光/化學(xué)發(fā)光成像(Protein simple FluorChem M)。

1.2 方法

1.2.1模型制備：50只SD大鼠隨機分為5組：假手術(shù)組(Sham)、模型組(OVX)、續(xù)苓健骨方組(XL)、阿侖膦酸鈉組(ALN)和聯(lián)合用藥組(XL+ALN)，每組10只。行雙側(cè)卵巢切除術(shù)制備快速骨丟失模型[11]，術(shù)前一日禁食不禁水，稱重，2%戊巴比妥鈉0.2 mL/100 g腹腔注射，仰臥位固定，備皮，于腹部正中線作一長約1.5 cm的切口，沿腹白線打開腹腔，沿Y型子宮尋找雙側(cè)粉紅色桑葚狀卵巢，結(jié)扎，徹底摘除卵巢，逐層縫合，術(shù)后肌注青霉素8萬單位，連續(xù)3 d。假手術(shù)組采用相同手術(shù)方法，僅切除卵巢周邊等量的脂肪組織。

1.2.2藥物干預(yù)：于術(shù)后1周進行藥物干預(yù)，大鼠灌胃劑量根據(jù)實驗動物等效劑量系數(shù)折算法換算，續(xù)苓健骨方組灌胃劑量為4.1 g/(kg·d)，阿侖膦酸鈉組灌胃劑量為6.25 mg/ (kg·周)，聯(lián)合用藥組為續(xù)苓健骨方和阿侖膦酸鈉聯(lián)合灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)灌胃12周，灌胃結(jié)束后取材，腹主動脈采血，取脛骨、股骨和腰椎備用。

1.2.3骨密度測量：盡量去除股骨周圍肌肉組織，生理鹽水沾濕紗布包裹保持組織濕潤，-20 ℃保存，復(fù)溫后固定掃描位置，雙能X線骨密度儀選用小動物高分辨掃描模式掃描股骨，自選工具選定ROI區(qū)域，讀取骨密度。

1.2.4HE染色：脛骨4%中性多聚甲醛常溫固定72 h，10%EDTA(pH 7.2～7.4)脫鈣至刀切無阻力感，水洗，經(jīng)脫水、透明和浸蠟，石蠟包埋，選擇冠狀面為切面，4 μm厚切片，攤片，60 ℃拷片2～3 h，玻片脫蠟至水，蘇木素染液染色30 min，水洗，鹽酸酒精分色，水洗，返藍，伊紅染液染色2 min，水洗，中性樹脂封片，鏡下觀察顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.5ELISA：腹主動脈采血，全血常溫靜置2 h，3000 r/min離心10 min，取血清備用，設(shè)置空白孔、標準品孔和樣本孔，加樣，加入酶標試劑100 μL，37 ℃孵育60 min，棄去液體，甩干，洗滌5次，加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，37 ℃避光顯色15 min，加終止液50 μL，酶標儀測定450 nm波長處吸光度，繪制標準曲線，計算Ⅰ型膠原交聯(lián)C末端肽(S-CTX)和Ⅰ型原膠原N端前肽(PINP)含量。

1.2.6Real-time PCR：液氮研磨腰椎組織，EASYspin Plus骨組織RNA快速提取試劑盒提取總RNA，Nanodrop2000測量260/280 nm處吸光度，Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存；根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫基因序列設(shè)計合成引物(表1)，使用SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Ki的20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變形15 s，95 ℃ 30 s和60 ℃ 30 s共40個循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參，2-△△CT計算EphB4和EphrinB2 mRNA的相對表達量。

表1 Real-time引物序列Table 1 Real-time primer sequences

1.2.7Western Blot：液氮研磨腰椎組織，加入RIPA裂解液和PMSF抑制劑，冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，取上清，加入loading buffer恒溫金屬浴98 ℃變性10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?；SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)模，封閉，1∶3000 GAPDH、1∶1000 EphB4和1∶1000 EphrinB2一抗分別4 ℃孵育過夜，洗滌，1∶6000二抗常溫孵育60 min，洗滌，ECL顯影；分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算EphB4和EphrinB2蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨密度

與假手術(shù)組相比，模型組股骨遠端骨密度顯著降低(P<0.001)，提示快速骨丟失模型制備成功；與模型組相比，續(xù)苓健骨方組、阿侖膦酸鈉組和聯(lián)合用藥組骨密度均升高(P<0.001)，其中以聯(lián)合用藥組最為顯著，組內(nèi)骨密度分布更均勻；結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組的骨密度優(yōu)于單純續(xù)苓健骨方組和阿侖膦酸鈉組(圖1)。

圖1 各組大鼠股骨骨密度(g/mm2)Fig.1 Bone mineral density of the femur in ovariectomized rats (g/mm2)

2.2 骨組織顯微結(jié)構(gòu)

脛骨近端HE染色可見(黑色箭頭指示骨骺線)：假手術(shù)組骨小梁緊密、分布均勻，排列規(guī)則、相互連接成網(wǎng)狀，骨小梁間距小(圖2A)；模型組骨小梁顯著稀疏、厚薄不均，排列紊亂、可見骨小梁斷裂，骨小梁間距顯著增寬，骨髓腔內(nèi)脂滴顯著增加聚集(圖2B)；與模型組相比，續(xù)苓健骨方組(圖2C)、阿侖膦酸鈉組(圖2 D)和聯(lián)合用藥組(圖2E)骨小梁數(shù)量均增加，厚度較均勻，排列較規(guī)則，骨小梁間距縮小，并且髓腔內(nèi)脂滴聚集較少，其中以聯(lián)合用藥組骨微結(jié)構(gòu)最佳、阿侖膦酸鈉次之；結(jié)果顯示續(xù)苓健骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉用藥可顯著改善骨微結(jié)構(gòu)。

圖2 各組大鼠脛骨近端冠狀面(HE染色，×50)Fig.2 The coronal plane of the proximal tibia (HE staining,×50)

2.3 血清骨代謝指標

與假手術(shù)組相比，模型組S-CTX含量升高(P<0.01)，提示骨吸收速率增強；與模型組相比，續(xù)苓健骨方組S-CTX含量略升高，阿侖膦酸鈉組S-CTX含量顯著降低(P<0.05)，而聯(lián)合用藥組含量介于模型組與阿侖膦酸鈉組之間；結(jié)果顯示聯(lián)合用藥一定程度上抑制骨吸收活動(表2)。

與假手術(shù)組相比，模型組PINP含量升高(P<0.001)，提示骨形成速率增強；與模型組相比，續(xù)苓健骨方組、阿侖膦酸鈉組和聯(lián)合用藥組PINP含量均升高，其中聯(lián)合用藥組最為顯著(P<0.001)，續(xù)苓健骨方組次之(P<0.01)，阿侖膦酸鈉組略升高、但差異不具統(tǒng)計學(xué)意義；結(jié)果顯示續(xù)苓健骨一定程度上調(diào)骨形成速率，并且聯(lián)合用藥組更為顯著(表2)。

表2 各組大鼠血清CTX和PINP含量

2.4 EphB4/EphrinB2 mRNA表達水平

與假手術(shù)組相比，模型組EphB4和ephrinB2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.001)；與模型組相比，阿侖膦酸鈉組(P<0.001)和聯(lián)合用藥組(P<0.01)EphB4和ephrinB2 mRNA表達水平不同程度升高，續(xù)苓健骨方組表達水平略有升高、但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

表3 各組大鼠腰椎EphB4和ephrinB2 mRNA相對表達水平

2.5 EphB4/ephrinB2蛋白表達水平

與假手術(shù)組相比，模型組EphB4蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)；與模型組相比，阿侖膦酸鈉組(P<0.001)和聯(lián)合用藥組(P<0.01)表達水平不同程度升高，續(xù)苓健骨方組表達水平略有升高、但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。與假手術(shù)組相比，模型組ephrinB2蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)；與模型組相比，續(xù)苓健骨方組(P<0.01)、阿侖膦酸鈉組(P<0.001)和聯(lián)合用藥組(P<0.001)表達水平均升高(圖3、表4)。

圖3 各組大鼠腰椎EphB4和ephrinB2 蛋白表達水平Fig.3 Protein expression levels of EphB4 and EphrinB2 in the lumbar spine of rats in each group

表4 各組大鼠腰椎EphB4和ephrinB2 蛋白表達水平

3 討論

骨重建是同一部位上骨細胞間有序進行的新骨舊骨更替，破骨細胞介導(dǎo)骨吸收和成骨細胞介導(dǎo)骨形成之間的動態(tài)平衡直接影響骨重建穩(wěn)態(tài)，共同維持骨骼結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性和完整性[12]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥為雌激素水平的顯著急劇降低，破骨細胞功能活躍引起骨吸收增加，為高轉(zhuǎn)換型骨重建失衡[13]。2006年學(xué)者發(fā)現(xiàn)EphB4/ephrinB2是骨重建耦聯(lián)中雙向傳導(dǎo)的信號通路，可同時調(diào)控成骨細胞和破骨細胞功能[14]；EphrinB2配體是破骨細胞上的膜蛋白并具有與受體類似的結(jié)構(gòu)和功能，EphB4受體是成骨細胞前體上的膜蛋白，兩者近距離接觸后活化，ephrinB2向EphB4傳遞正向信號通過RhoA促進成骨細胞分化，EphB4向ephrinB2傳遞逆向信號通過c-Fos-NFATc1抑制破骨細胞分化[15]；EphB4/ephrinB2雙向信號在骨質(zhì)疏松癥中起重要作用[16]。

阿侖膦酸鈉是FDA首個獲批的第三代口服雙膦酸鹽藥物，臨床上廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療，焦磷酸鹽與羥磷灰石結(jié)合后由破骨細胞攝取，抑制法尼基焦磷酸合成酶，抑制破骨細胞活性從而抑制骨吸收。續(xù)苓健骨方以川續(xù)斷、骨碎補、茯苓、紅花等藥味組成，具有補腎健骨、健脾益氣和活血止痛功效，顯著緩解患者骨痛等癥狀，維持骨密度并提高生活質(zhì)量；其差異miRNAs可能調(diào)控MAPK、GnRH、Hedgehog和自噬等信號通路參與去卵巢模型大鼠的治療過程[8]。循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示，部分藥物聯(lián)合在骨質(zhì)疏松癥治療中協(xié)同增效的同時降低不良反應(yīng)[17]，本研究旨在觀察續(xù)苓健骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉的藥效作用和部分作用機制。

本研究顯示續(xù)苓健骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉治療骨質(zhì)疏松BMD和骨微結(jié)構(gòu)均優(yōu)于單藥組，血清骨吸收指標CTX略低于阿侖膦酸鈉組，骨形成指標PINP略高于續(xù)苓健骨方組，抑制骨吸收的同時促進骨形成，雙重調(diào)控骨重建。阿倫磷酸鈉強有力抑制早期破骨細胞活躍的快速骨丟失，有效彌補中藥復(fù)方的起效緩慢和藥效溫和；在降低骨轉(zhuǎn)換速率的同時，續(xù)苓健骨方提高成骨細胞活性，從而進一步改善骨質(zhì)和骨量；兩者盡可能多地產(chǎn)生疊加作用和協(xié)同作用，達到更優(yōu)的治療效果。與假手術(shù)組相比，模型組骨組織EphB4和ephrinB2 mRNA和蛋白表達水平顯著下調(diào)，與先前學(xué)者研究保持一致[18]；與模型組相比聯(lián)合用藥組EphB4和ephrinB2 mRNA和蛋白表達水平均顯著上調(diào)，表明續(xù)苓健骨方協(xié)同阿倫磷酸鈉可能通過激活EphB4/ephrinB2信號通路雙向調(diào)控骨重建；聯(lián)合用藥組其表達水平介于兩個單藥組之間，提示藥效與表達水平未呈完全正相關(guān)，因此通路下游變化有待于完善，亦或是存在多條信號通路的網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)共同作用的可能。

綜上所述，本研究結(jié)果初步提示續(xù)苓健骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉可能通過激活EphB4/ephrinB2信號通路，雙向調(diào)控骨重建，改善去卵巢快速骨丟失大鼠改善骨組織微結(jié)構(gòu)和血清骨代謝，從而提高BMD發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用；然而藥物協(xié)同調(diào)控EphB4/ephrinB2雙向信號通路的下游機制有待于課題組進一步深入研究，將從正向促進成骨和反向抑制破骨兩方面進行探討，闡釋藥物聯(lián)合治療的潛在作用機制，為臨床中西醫(yī)結(jié)合治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供新依據(jù)。