肖之奇,林占熺

(福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)中心,福州 350002)

【研究意義】菌草是指經(jīng)過了栽培食藥用菌的三級系統(tǒng)篩選法的系統(tǒng)選育之后，可以用于栽培食藥用菌的新型草本植物[1]。菌草技術(shù)由福建省農(nóng)林大學(xué)菌草研究所林占熺研究員于1987年發(fā)明，菌草技術(shù)最初用于“以草代木”種植食藥用菌[2]，即通過使用菌草代替樹木作為培育食藥用菌的基質(zhì)，從而緩解當(dāng)時(shí)因培育食藥用菌而大量砍伐樹木所造成的突出的“菌林矛盾”[3]。菌草技術(shù)問世后，立即引起了聯(lián)合國開發(fā)計(jì)劃署和糧農(nóng)組織的關(guān)注，于1994年被聯(lián)合國開發(fā)計(jì)劃署列為“中國與其它發(fā)展中國家優(yōu)先合作項(xiàng)目”，之后又于2017年被聯(lián)合國列為“和平發(fā)展基金項(xiàng)目”重點(diǎn)項(xiàng)目向全球推廣，為國際減貧事業(yè)貢獻(xiàn)中國智慧和中國方案[4]。隨著時(shí)代的發(fā)展，目前菌草技術(shù)已經(jīng)廣泛運(yùn)用到生態(tài)治理領(lǐng)域，在治理土壤鹽堿化的過程中發(fā)揮了重要的作用，菌草“綠洲一號”作為近年來選育培養(yǎng)出來的新草種，在治理土壤鹽堿化領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。因此，研究菌草“綠洲一號”這種可用于土壤鹽堿化治理的新型草種對于鹽堿地土壤的改良治理機(jī)制具有重要的研究意義，可以為運(yùn)用生物方法對鹽堿地土壤進(jìn)行改良治理提供新的思路和方法?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用菌草“綠洲一號”改良治理鹽堿地土壤目前已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展，2013—2017年，福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)中心先后在內(nèi)蒙古阿拉善、山西運(yùn)城、河南蘭考、山東東營、新疆阜康、和田等地區(qū)開展了種植菌草“綠洲一號”治理鹽堿地的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，均取得了理想的治理成果[5]。相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，菌草“綠洲一號”根系發(fā)達(dá)、生長迅速、植株富含各類粗蛋白，在治理鹽堿地的過程中見效快、效果好[6]。種植菌草“綠洲一號”可以顯著增加土壤微生物的數(shù)量，從而改善土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)，從而從根本上改善鹽堿地的土壤理化性質(zhì)，降低鹽堿土壤的鹽堿度，使鹽堿土壤自身的土壤肥力得到有效恢復(fù)[7]。這也是菌草“綠洲一號”改善鹽堿土壤的核心機(jī)制所在。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)在檢測和鑒定微生物種群方面發(fā)揮著重要的作用，其中以16sDNA高通量測序技術(shù)因其具有良好的特異性因而在鑒定微生物種群方面應(yīng)用最為廣泛。16sDNA位于原核細(xì)胞核糖體小亞基上，包括10個(gè)保守區(qū)域(Conserved Regions)和9個(gè)高變區(qū)域(Hypervariable Regions)，其中保守區(qū)在細(xì)菌間差異不大，高變區(qū)具有屬或種的特異性，隨親緣關(guān)系不同而有一定的差異。因此，16sDNA可以作為揭示生物物種的特征核酸序列，被認(rèn)為是最適于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標(biāo)。16sDNA擴(kuò)增子測序(16sDNA Amplicon Sequencing)，通常是選擇某個(gè)或某幾個(gè)變異區(qū)域，利用保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對高變區(qū)進(jìn)行測序分析和菌種鑒定，16S rDNA擴(kuò)增子測序技術(shù)已成為研究環(huán)境樣本中微生物群落組成結(jié)構(gòu)的重要手段[8-10]。同時(shí)菌落PCR技術(shù)也已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于陽性克隆子的鑒定[11]。菌落PCR直接以菌體熱解后暴露的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，省去了提取細(xì)菌菌體DNA等一系列的復(fù)雜過程，與傳統(tǒng)的先提取細(xì)菌菌體DNA而后進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法相比，更加省時(shí)省力[12]，適合菌株的快速批量鑒定?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前相關(guān)的研究進(jìn)展仍然停留在初步的數(shù)據(jù)采集階段，對菌草“綠洲一號”對于鹽堿地土壤微生物種群數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)的改良具體機(jī)制尚不明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】本文以菌草“綠洲一號”根際土壤微生物為切入點(diǎn)，通過對菌草“綠洲一號”根際土壤中具有重要生態(tài)價(jià)值的優(yōu)勢菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)及篩選鑒定，明確菌草“綠洲一號”對鹽堿地土壤微生物種群數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)的改良具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

取樣地點(diǎn)為福建省福州市國家菌草工程技術(shù)中心長江澳鹽堿灘涂治理基地(25°31′28.03″N、119°47′46.22″E)，菌草“綠洲一號”為兩年生成年植株(圖1)，該基地的土壤類型均為濱海鹽堿地土壤。采用五點(diǎn)取樣法在毗鄰菌草“綠洲一號”種植地段的未種植菌草“綠洲一號”植株且表面無植物生長的空白鹽堿地段提取深度為20 cm左右的深層土壤，作為空白組土樣；在菌草“綠洲一號”種植地段內(nèi)挑選植株土壤選取長勢較好的“綠洲一號”菌草植株，提取菌草“綠洲一號”植株根際深度為20 cm左右的根際土壤，作為對照組土樣(表1)。去除土樣中的雜物和大的土塊后，將每組土樣混合均勻，裝入無菌袋中置于-80 ℃冰箱中保存。

表1 土壤樣品采集信息

圖1 菌草“綠洲一號”植株

1.2 培養(yǎng)基制備

TSB固體培養(yǎng)基：用于菌草“綠洲一號”植株根際土壤中優(yōu)勢菌株的分離培養(yǎng)和篩選純化。其配方為：胰酪胨17.0 g，氯化鈉5.0 g，大豆木瓜蛋白酶消化物3.0 g，磷酸氫二鉀2.5 g，葡萄糖(一水合/無水)2.5 g，瓊脂20.0 g，pH 7.3±0.2。

LB固體培養(yǎng)基：用于菌草“綠洲一號”植株根際土壤中優(yōu)勢菌株的保存。其配方為：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，瓊脂15.0 g，pH 7.3±0.2。

1.3 空白組和實(shí)驗(yàn)組土壤微生物種群的差異性分析

按照MP Biomedicals Fast DNA土壤樣品提取試劑盒的操作說明，提取空白組土樣和實(shí)驗(yàn)組土樣的土壤微生物總DNA，每個(gè)組的土壤均提取8個(gè)土壤微生物總DNA樣本，空白組土樣提取的8個(gè)土壤微生物總DNA樣本編號為：KB1～KB8；實(shí)驗(yàn)組土樣提取的8個(gè)土壤微生物總DNA樣本編號為：SY1～SY8。檢測合格之后以提取到的土壤微生物總DNA為模板運(yùn)用PCR技術(shù)對細(xì)菌的16sDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并送檢?？瞻捉M和實(shí)驗(yàn)組土壤微生物種群的差異性分析由蘇州帕諾米克生物技術(shù)有限公司運(yùn)用16sDNA高通量測序技術(shù)進(jìn)行分析。

1.4 菌草“綠洲一號”根際土壤中優(yōu)勢菌株的分離篩選與純化

稱取保存于-80 ℃的菌草“綠洲一號”植株根際土壤9.0 g，置于經(jīng)過滅菌處理的250 mL錐形瓶中，加入90 mL生理鹽水，配置成10-1濃度梯度的土壤懸浮液。密封后放置于37 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩120 min,使土壤當(dāng)中的微生物充分溶解于生理鹽水。振蕩結(jié)束后室溫下靜置20 min左右，吸取1 mL上清液于2號試管中，加入9 mL生理鹽水，稀釋成10-2濃度梯度的土壤懸浮液。依此類推，分別吸取1 mL上一濃度梯度土壤懸浮液用生理鹽水按照10倍的濃度梯度進(jìn)行稀釋，依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9濃度梯度的土壤懸浮液[13]。

選取10-4、10-5、10-6、10-74個(gè)濃度梯度的土壤懸浮液，用200 μL移液槍吸取100 μL的土壤懸浮液接種于含有滅菌處理的TSB培養(yǎng)基的細(xì)菌培養(yǎng)皿，用涂布棒均勻涂抹于TSB培養(yǎng)基表面，每個(gè)濃度梯度的土壤懸浮液接種4個(gè)培養(yǎng)皿，密封后倒置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～6 d左右。將接種環(huán)用酒精燈燒紅冷卻后分別挑取TSB培養(yǎng)基表面長出的白色和黃色單菌落，在經(jīng)過1×105Pa滅菌20 min處理后的TSB培養(yǎng)基上連續(xù)劃線，直至TSB培養(yǎng)基表面生長出的菌落全部為白色菌落和黃色菌落為止。

1.5 菌草“綠洲一號”根際土壤中酸桿菌和鞘氨醇單胞菌的菌落PCR鑒定

在無菌的超菌工作臺中，用經(jīng)過滅菌處理的移液槍槍頭挑取TSB培養(yǎng)基表面的白色和黃色單菌落，放入裝有20 μL無菌雙蒸水(ddH2O)的1.5 mL PCR管中，攪拌后不斷吹打，使挑取的酸桿菌菌體充分溶于無菌雙蒸水(ddH2O)中。而后將裝有優(yōu)勢菌株菌液的1.5 mL PCR管蓋好管蓋置于電磁爐中用沸水持續(xù)蒸煮5 min，使優(yōu)勢菌株菌體在加熱條件下充分裂解，DNA充分暴露[14]。

以充分裂解的優(yōu)勢菌株菌體DNA為模板，設(shè)計(jì)優(yōu)勢菌株的特異性引物(酸桿菌上下游引物為Acido-135F：ATACCGCATAACACCTACG，Acido-587R：CCACACTCAAGCCAGATAG，擴(kuò)增片段長度452 bp; 鞘氨醇單胞菌上下游引物為Sphin-187F：AGCGTTGTTCGGAATTACT, Sphin-403R：CACCTCAGCGTCAATACC, 擴(kuò)增片段長度216 bp)。PCR反應(yīng)體系采用20 μL體系：3 μL DNA, 上游下游引物各1 μL，10 μL 2×TaqMaster Mix(內(nèi)含Taq酶、dNTP、Mg2+)，5 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性90 s; 94 ℃變性30 s, 50 ℃退火30 s, 72 ℃延伸60 s,進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸4 min。

1.6 優(yōu)勢菌株菌落PCR反應(yīng)產(chǎn)物的凝膠電泳反應(yīng)

稱取0.4 g凝膠瓊脂糖，加入40 mL 1×TAE凝膠電泳緩沖液，煮沸后加入4 μL Glegreen核酸凝膠染料，倒入DNA凝膠多孔制膠器，待冷卻形成多孔凝膠板后取出放入電泳槽中備用。

向電泳槽中倒入1×TAE凝膠電泳緩沖液，液面高于凝膠板約1 cm,在凝膠板第一個(gè)點(diǎn)樣孔中加入5 μL DL2000 DNA Marker試劑、而后將5 μL酸桿菌菌落PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1 μL 6×DNA Loading Buffer試劑(DNA上樣緩沖液)在封口膜表面混合均勻后依次加入剩余的點(diǎn)樣孔，樣品加入完畢后，開始進(jìn)行電泳。電泳電壓120 V，電泳時(shí)間30 min，電泳結(jié)束后，用凝膠電泳成像系統(tǒng)驗(yàn)證凝膠電泳效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 空白組和實(shí)驗(yàn)組土壤微生物種群的差異性分析

2.1.1 門水平的物種相對豐度差異性分析 由圖2可以看出，在門水平上，空白組土樣(KB1～KB8)中種群相對豐度較高的變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)在實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中均明顯下降。而泉古菌門(Crenarchaeota)、不明細(xì)菌(unidentified-Bacteria)，放線桿菌門(Actinobacteriota)，藍(lán)藻(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)，Chloroflexi等菌門的相對豐度變化不大。酸桿菌門(Acidobacteriota)和脫硫菌門(Desulfobacterota)在實(shí)驗(yàn)組土樣(RS1～RS8)中的相對豐度得到了有效提高?？瞻捉M土樣(KB1～KB8)中酸桿菌門的物種相對豐度依次為1.0%、0.74%、2.7%、2.0%、2.8%、1.6%、2.3%、2.2%；實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中酸桿菌門的相對豐度依次為5.5%、8.4%、5.0%、6.4%、5.1%、6.1%、6.1%、6.5%；空白組土樣(KB1～KB8)中脫硫菌門的物種相對豐度依次為0.1%、0.1%、0.4%、0.3%、0.7%、0.6%、0.8%、0.7%；實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中脫硫菌門的相對豐度依次為3.9%、5.1%、2.2%、1.2%、5.0%、9.5%、3.7%、2.6%；兩者的相對豐度均明顯提高。

圖2 各樣本門水平物種相對豐度

由圖3可以看出，在門水平上，實(shí)驗(yàn)組土樣(RS1～RS8)中KD4-96、古菌門(Archaea)、Subgroup-21、bacteriap25、Thermoplasmata、Verrucomicrobiae、脫硫菌門(Desulfuromondia)、Polyangia、酸桿菌門(Acidobacteriae)、Vicinamibacteria和亞硝酸菌門(Nitrososphaeria)的物種聚類要明顯高于空白組土樣(KB1～KB8)。結(jié)合門水平物種相對豐度柱形圖和門水平物種聚類熱圖綜合分析，脫硫菌門和酸桿菌門為實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中門水平的優(yōu)勢菌門。

圖3 各樣本門水平物種聚類熱圖

2.1.2 目水平的物種相對豐度差異性分析 由圖4可以看出，空白組土樣(KB1～KB8)和實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)各樣本之間在目水平的物種相對豐度出現(xiàn)了明顯的分化，實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)在目水平的物種相對豐度明顯要高于空白組土樣(KB1～KB8)。在實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中，紅螺菌目(Rhodospirillales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales)的物種相對豐度要明顯高于空白組土樣(KB1～KB8)。紅螺菌目在實(shí)驗(yàn)組土樣中物種相對豐度依次為4.2%、6.1%、4.4%、3.3%、5.1%、4.4%、5.9%、3.6%；鞘脂單胞菌目在實(shí)驗(yàn)組土樣中物種相對豐度依次為0.6%、0.6%、0.7%、6.6%、1.4%、0.7%、0.6%、0.9%，在空白組土樣KB3～KB5中，鞘脂單胞菌目的物種相對豐度為0，其余各空白組土樣的鞘脂單胞菌目的物種相對豐度均極低；伯克霍爾德氏菌目在實(shí)驗(yàn)組土樣中物種相對豐度依次為6.2%、3.8%、6.3%、10.9%、4.9%、4.8%、5.2%、4.9%。對比空白組土樣，實(shí)驗(yàn)組土樣中紅螺菌目、鞘脂單胞菌目、伯克霍爾德氏菌目的物種相對豐度均有提高。

圖4 各樣本目水平物種相對豐度

由圖5可以看出，實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中紅螺菌目(Rhodospirillales)，根瘤菌目(Rhizobiales)，鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)，假單胞菌目(Pseudomondales)，微球菌目(Micrococcales)的物種聚類要明顯高于空白組土樣(KB1～KB8)。其中假單胞菌目為常見的致病菌，具有感染性。

圖5 各樣本目水平物種聚類熱圖

結(jié)合目水平物種相對豐度柱形圖和目水平物種聚類熱圖綜合分析，紅螺菌目(Rhodospirillales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)為實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中目水平的優(yōu)勢菌目。

2.1.3 科水平的物種相對豐度差異性分析 由圖6可以看出，空白組土樣(KB1～KB8)和實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)各樣本之間在科水平的物種相對豐度的差異更加明顯。在實(shí)驗(yàn)組土樣中，磁螺菌科(Magnetospiraceae)，鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)，草桿菌科(Oxalobacteraceae)，脫硫單胞菌科(Desulfuromonadaceae)的物種相對豐度要明顯高于空白組土樣(KB1～KB8)。磁螺菌科在實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中物種相對豐度依次為4.0%、5.9%、4.2%、2.0%、4.8%、4.2%、5.7%、3.4%；鞘氨醇單胞菌科在實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中物種相對豐度依次為0.6%、0.5%、0.5%、6.5%、1.4%、0.7%、0.6%、0.9%，在空白組土樣KB3～KB6中，鞘氨醇單胞菌科的物種相對豐度為0，其他各樣本中鞘氨醇單胞菌科的物種相對豐度均極低；草桿菌科在實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中物種相對豐度依次為0.1%、0.1%、0.3%、7.8%、0.1%、0.3%、0.3%、0.4%，在空白組土樣(KB1～KB8)中，草桿菌科的物種相對豐度均為0；脫硫單胞菌科在實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中物種相對豐度依次為2.0%、4.1%、1.2%、0.6%、3.2%、8.1%、2.3%、1.4%。

圖6 各樣本科水平物種相對豐度

由圖7可以看出，實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中脫硫單胞菌科(Desulfuromonadaceae),假單胞菌科(Pseudomonadaceae)，鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)，硫桿菌科(Acidithiobacillaceae)的物種聚類要明顯高于空白組土樣(KB1～KB8)。其中假單胞菌科為具有感染能力的致病菌。

圖7 各樣本科水平物種聚類熱圖

結(jié)合科水平物種相對豐度柱形圖和科水平物種聚類熱圖綜合分析，鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)和脫硫單胞菌科(Desulfuromonadaceae)為實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中科水平的優(yōu)勢菌科。

2.1.4 屬水平的物種相對豐度差異性分析 屬水平是公認(rèn)的可以最有效的鑒定不同菌株的分類水平，各類不同菌株的差異性在屬水平上體現(xiàn)得最為明顯，通過屬水平的種群相對豐度差異性分析，可以快速區(qū)分不同菌株之間的差異性。空白組土樣(KB1～KB8)和實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)各樣本之間的物種相對豐度的差異性在屬水平上體現(xiàn)得最明顯，由圖8可以看出，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中的物種相對豐度要高于空白組土樣(KB1～KB8)。鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中的物種相對豐度依次為0.3%、0.3%、0.3%、5.7%、0.5%、0.5%、0.3%、0.6%。而空白組土樣KB3～KB8中的物種相對豐度為0，在其他各空白組樣本當(dāng)中的物種相對豐度均極低。

圖8 各樣本屬水平物種相對豐度

由圖9可以看出，實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的物種聚類要明顯高于空白組土樣(KB1～KB8)。其中假單胞菌屬為致病菌。結(jié)合屬水平物種相對豐度柱形圖和屬水平物種聚類熱圖綜合分析，鞘氨醇單胞菌屬為實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)屬水平的優(yōu)勢菌屬。

圖9 各樣本屬水平物種聚類熱圖

2.2 分離培養(yǎng)的目標(biāo)菌株確定

通過對空白組土樣(KB1～KB8)和實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)在各分類水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus)上的物種相對豐度柱和物種聚類的差異分析，實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中門分類水平的優(yōu)勢菌門為脫硫菌門(Desulfuromondia)和酸桿菌門(Acidobacteriae)；目分類水平的優(yōu)勢菌目為紅螺菌目(Rhodospirillales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)；科分類水平的優(yōu)勢菌科為鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)和脫硫單胞菌科(Desulfuromonadaceae)；屬分類水平的優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)；由于假單胞菌為致病菌，不進(jìn)行分離培養(yǎng)。

2.3 目標(biāo)菌株菌落PCR反應(yīng)產(chǎn)物的凝膠電泳分析

從治理土壤鹽堿化的生態(tài)利用價(jià)值和菌株自身的生態(tài)作用出發(fā)，選擇酸桿菌和鞘氨醇單胞菌作為目標(biāo)菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)。如圖10～11所示，酸桿菌菌落PCR目標(biāo)條帶(452 bp)和鞘氨醇單胞菌菌落PCR目標(biāo)條帶(216 bp)清晰明亮，排列整齊，目標(biāo)條帶的長度和分布位置準(zhǔn)確。因此，可以確定從菌草“綠洲一號”根際土壤當(dāng)中分離培養(yǎng)出的目標(biāo)菌株為酸桿菌和鞘氨醇單胞菌菌株。

M為DL2000 DNA marker指示條帶，1～24為樣品擴(kuò)增結(jié)果

3 討 論

本文通過運(yùn)用16sDNA高通量測序技術(shù)對空白組土樣(KB1～KB8)和實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)進(jìn)行微生物種群結(jié)構(gòu)測序，明確了兩者在各分類水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus)上的物種相對豐度柱和物種聚類的差異，實(shí)驗(yàn)組土樣(SY1～SY8)中門分類水平的優(yōu)勢菌門為脫硫菌門(Desulfuromondia)和酸桿菌門(Acidobacteriae)；目分類水平的優(yōu)勢菌目為紅螺菌目(Rhodospirillales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)；科分類水平的優(yōu)勢菌科為鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)和脫硫單胞菌科(Desulfuromonadaceae)；屬分類水平的優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)。最終從菌草“綠洲一號”的根際土壤中分離培養(yǎng)出了酸桿菌和鞘氨醇單胞菌這兩種具有重要生態(tài)作用的目標(biāo)菌株。

菌草“綠洲一號”作為一種可以有效治理土壤鹽堿化的新型草種，其根際土壤當(dāng)中的酸桿菌豐度較高[15]，酸桿菌是近年來新分離出來的細(xì)菌，作為嗜酸菌可有效分泌各類胞外酸[16]，從而降低土壤鹽堿度，在治理土壤鹽堿化的過程當(dāng)中發(fā)揮著重要作用[17]。但由于純化的酸桿菌菌體很難通過人工分離培養(yǎng)獲得，因此對于酸桿菌的研究非常稀少[18]。鞘氨醇單胞菌同樣也是近年來新分離出來的細(xì)菌，雖然作為一種新型的微生物資源，具有高效的芳香有機(jī)物降解能力，在環(huán)境保護(hù)及工業(yè)生產(chǎn)方面具有巨大的應(yīng)用潛力[19]。但由于對鞘氨醇單胞菌的認(rèn)識較晚，因此對于鞘氨醇單胞菌的研究仍然還停留在初級階段[20]。

M為DL2000 DNA marker指示條帶，1～15為樣品擴(kuò)增結(jié)果

鹽堿土壤最顯著的特征就是土壤鹽堿度增加，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致鹽類物質(zhì)從土壤內(nèi)部析出覆蓋在土壤表層而導(dǎo)致土壤呈現(xiàn)出霜白色。同時(shí)還可使土壤顆粒因離子間的相互作用而凝結(jié)成塊狀導(dǎo)致土壤板結(jié)[21]。土壤板結(jié)會嚴(yán)重破壞土壤的自身結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致土壤自身性狀的改變[22]。鹽堿地土壤最嚴(yán)重的問題除了土壤板結(jié)導(dǎo)致自身性狀的徹底改變之外，還在于土壤內(nèi)部微生物種群生態(tài)系統(tǒng)的徹底破壞[23]。鹽堿地土壤內(nèi)部微生物種群生態(tài)系統(tǒng)被徹底破壞之后，土壤微生物的種群豐度及代謝活動大大減少，導(dǎo)致鹽堿地土壤徹底喪失了土壤肥力的內(nèi)在恢復(fù)機(jī)制[24]。因此，恢復(fù)鹽堿地土壤內(nèi)部的微生物種群生態(tài)系統(tǒng)成為了鹽堿地土壤修復(fù)治理的核心問題[25]。目前鹽堿地土壤的修復(fù)治理方法主要是物理方法和化學(xué)方法，但無論是物理方法還是化學(xué)方法，在治理鹽堿地土壤的同時(shí)也具有嚴(yán)重的副作用，會造成對土壤的二次傷害。因此，運(yùn)用生物方法選用具有良好的鹽堿地土壤改良特性的新型植物對鹽堿地土壤進(jìn)行生物治理成為了未來治理鹽堿地土壤的首要選擇[26]。

本研究通過選取酸桿菌和鞘氨醇單胞菌物種豐度豐富的菌草“綠洲一號”植株的根際土壤，結(jié)合菌落PCR的鑒定方法，成功從菌草“綠洲一號”植株的根際土壤當(dāng)中分離出了酸桿菌和鞘氨醇單胞菌的純化菌株，為酸桿菌和鞘氨醇單胞菌的后續(xù)研究，尤其是兩者的宏基因組學(xué)分析和相關(guān)菌肥的開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。同時(shí)也從側(cè)面印證了菌草“綠洲一號”植株具有良好的鹽堿土壤治理作用，為通過生物方法治理鹽堿土壤提供了新的方法和思路，具有很好的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

相比較于傳統(tǒng)的物理和化學(xué)治理方法在治理鹽堿地的同時(shí)需要破壞土壤的物理結(jié)構(gòu)和內(nèi)部的離子結(jié)構(gòu)而言，運(yùn)用菌草“綠洲一號”治理鹽堿地不需要破壞土壤的物理結(jié)構(gòu)和內(nèi)部的離子結(jié)構(gòu)，能夠有效避免治理過程中對土壤造成的二次傷害；同時(shí)能夠有效恢復(fù)鹽堿地土壤內(nèi)部的微生物種群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)鹽堿地土壤肥力的自我恢復(fù)，具有更加持續(xù)高效的治理效果。因此，運(yùn)用菌草“綠洲一號”治理鹽堿地土壤具有重要的生態(tài)應(yīng)用價(jià)值。