何振宇，周衛(wèi)青，劉立偉，郭釗翔，莫云海，徐華潮

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江省淳安縣林業(yè)局，浙江 淳安 311700；3.浙江自然博物院，浙江 杭州 311300)

森林資源是中國生態(tài)資源重要的組成部分，第9 次森林資源普查結(jié)果顯示：中國森林覆蓋率達(dá)22.9%，森林總面積2.2×108hm2[1]。森林資源包含林地資源、土壤資源和昆蟲資源等[2]。其中，昆蟲資源具有物種豐富度高、數(shù)量多和利用價值好等特性[3]。藥用昆蟲資源作為昆蟲資源的重要分支，具有良好的研究價值和開發(fā)前景[4]，如蜂類的蜂毒肽與茶多酚的納米復(fù)合物具有協(xié)同抗腫瘤作用[5]；土鱉蟲的活性肽具有降血脂作用[6]。

斗米蟲是桑天牛(Apriona germari)和銹色粒肩天牛(A.swainsoni)的全蟲幼蟲，在中國分布廣泛，是常見并具有較強(qiáng)危害的蛀干害蟲，但更是一種優(yōu)良的藥用昆蟲[7]。早在《中華本草》中就記錄了斗米蟲具有透疹、增強(qiáng)筋骨和治療勞傷的藥用價值；明朝李時珍所著《本草綱目》典籍中載錄食用此蟲可治療小兒疳積和肝硬化等疾病。已有研究顯示：斗米蟲有一定的體外抗腫瘤活性且具有潛在的免疫調(diào)節(jié)功效[8]；侯沛穎等[9]發(fā)現(xiàn)斗米蟲蛋白對4T1 荷瘤小鼠有較好的抗腫瘤作用。此外，斗米蟲繁殖能力較強(qiáng)，具有人工室內(nèi)養(yǎng)殖的基礎(chǔ)[10]。因此，斗米蟲是較為理想的藥用昆蟲。

病原性腹瀉是困擾各年齡段人群的常見疾病[11]。這種病癥常因大腸桿菌和沙門氏菌等病菌侵襲腸道引發(fā)腹瀉，進(jìn)一步引起水電解質(zhì)失調(diào)、營養(yǎng)不良和心慌氣短的癥狀[12]。一般通過施用抗生素達(dá)到治療目的，其治療時間短，且效果較為顯著[13]，但長期濫用抗生素藥物會出現(xiàn)很多弊端，如病原物的耐藥性增強(qiáng)及污染環(huán)境等[14]。

金鑫鑫等[15]研究發(fā)現(xiàn)：黃金蟲(Musca domestica)蟲粉對小鼠腸道炎癥有治療效果；周瓊等[16]研究發(fā)現(xiàn)：美洲大蠊粉(Periplaneta americana)對小鼠腹瀉腸道修復(fù)有較好效果。另外，在浙江和江西等地有不少腹瀉患者服用斗米蟲后病情恢復(fù)速度明顯加快的案例。因此，本研究在小鼠感染大腸桿菌(Escherichia coli)引發(fā)腹瀉的基礎(chǔ)上，通過在基礎(chǔ)飼糧中添加斗米蟲，并通過統(tǒng)計其結(jié)腸、回腸和盲腸中存在的大腸桿菌總數(shù)以及腸道內(nèi)總菌量，并測定其機(jī)體內(nèi)具有增強(qiáng)創(chuàng)傷傷口愈合能力和確保細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整的抗氧化酶和消化系統(tǒng)內(nèi)有關(guān)酶的活性[17]，確定斗米蟲對提高試驗(yàn)小鼠抵抗力以及治療腸道消化分解食物和吸收養(yǎng)分能力的作用，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用斗米蟲食藥用功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雄性昆明種小鼠(SPF 級)，體質(zhì)量(20±2)g，3～4 周齡，由南京博恩生物技術(shù)有限公司提供。大腸桿菌購自美國組織培養(yǎng)庫。超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(NBT 法)購自中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；VRBMUG瓊脂、脂肪酶(LPS)活性檢測試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定檢測試劑盒和過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性檢測試劑盒購自艾博抗上海生物貿(mào)易公司；淀粉酶(AMS)活性檢測試劑盒購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。瓊脂和蛋白胨均由南京博恩生物技術(shù)有限公司提供。將基礎(chǔ)飼糧(表1)磨碎，分別添加12%、8%和4%的斗米蟲粉制作成混合飼糧，將混合飼糧制作成飼糧小球?qū)π∈筮M(jìn)行飼喂。

表1 小鼠基礎(chǔ)飼糧營養(yǎng)成分Tab.1 Nutrient contents of mouse basal diet

1.2 斗米蟲粉的制備

斗米蟲 120 條(經(jīng)浙江農(nóng)林大學(xué)徐華潮教授鑒定為桑天牛幼蟲)，體質(zhì)量1.6～2.0 g，蟲齡5～6 齡，屬于老熟幼蟲，寄生于云實(shí)樹干中，購自江西上饒斗米蟲養(yǎng)殖基地。將其放入-80 ℃冰箱中低溫冷凍處死，隨即置于冷凍干燥機(jī)脫水干燥至恒質(zhì)量，然后在研缽內(nèi)加入液氮磨成粉末狀備用[18]。

1.3 動物分組與處理

選定健康正常的試驗(yàn)小鼠40 只，通過隨機(jī)組合的方式分成5 組，每組小鼠4 只，5 組分別各設(shè)置相同的重復(fù)小鼠各4 只。其中，模型組、12%斗米蟲粉組、8%斗米蟲粉組和4%斗米蟲粉組持續(xù)5 d 腹腔內(nèi)注入3.00×108CFU/mL 大腸桿菌菌液建模(注入劑量為0.02 mL/g)，空白組小鼠腹腔注入相同劑量的滅菌生理鹽水。腹瀉構(gòu)造期間每組都喂食基礎(chǔ)飼糧；腹瀉模型構(gòu)造完成后進(jìn)行為期2 周的混合飼糧喂食，用斗米蟲粉治療小鼠期間，12%斗米蟲粉組、8%斗米蟲粉組和4%斗米蟲粉組試驗(yàn)小鼠分別喂食斗米蟲粉加入量12%、8%和4%的混合飼糧2 g，空白組和模型組試驗(yàn)小鼠喂食2 g 的基礎(chǔ)飼糧(風(fēng)干水平)；之后自由取食基礎(chǔ)飼糧。

1.4 指標(biāo)測定

治療期完成后，分別從各組的2 個重復(fù)中選取4 只健康狀況基本一致的小鼠，用適量乙醚將其麻醉，使用2 mL 針筒注射器刺穿其心臟進(jìn)行采血，血液存入2 mL 無菌EP 管內(nèi)，迅速在4 000 r/min下離心10 min，取血清置于4 ℃冰箱內(nèi)，待用相關(guān)試劑檢測盒測定血清中淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)、乳酸脫氫酶(LDH)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和過氧化氫酶(CAT)活性。采集血液完成后，解剖分離小鼠腸道，依據(jù)解剖學(xué)原理按順序截斷并獲取回腸、盲腸和結(jié)腸，用無菌手術(shù)刀刮落并收集腸道內(nèi)容物，分別存入2 mL無菌EP 管內(nèi)，全部置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)完全冷凍保存待測。大腸桿菌和總菌分別使用VRB-MUG 瓊脂培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)，測定具體方法及操作步驟參照周瓊等[16]的研究。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間統(tǒng)計學(xué)差異采取one-way ANOVA 和Tukey’s 檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為有顯著性差異

2 結(jié)果與分析

2.1 斗米蟲對小鼠腸道菌數(shù)的影響

2.1.1 對大腸桿菌菌落數(shù)量的影響

由表2 可知：模型組小鼠結(jié)腸、盲腸和回腸中大腸桿菌菌落數(shù)量均顯著高于空白組和斗米蟲粉試驗(yàn)組(P＜0.05)，其中，模型組中的盲腸腸道中的大腸桿菌數(shù)量最高，達(dá)到20.24×106CFU/mL。試驗(yàn)小鼠3 個腸道中大腸桿菌菌落數(shù)量都隨斗米蟲粉添加量的增加而呈現(xiàn)出不同程度的下降；12%斗米蟲粉組小鼠3 個腸道中大腸桿菌數(shù)量與空白組差異均不顯著(P＞0.05)，且顯著低于4%斗米蟲粉組(P＜0.05)。在盲腸中，8%斗米蟲粉組的大腸桿菌菌落數(shù)量與12%斗米蟲粉組差異不顯著(P＞0.05)，但在回腸和結(jié)腸中兩者差異顯著(P＜0.05)?？梢?，12%斗米蟲粉對腸道大腸桿菌數(shù)量的抑制效果最顯著。

表2 斗米蟲粉對腹瀉小鼠腸道大腸桿菌數(shù)量的影響Tab.2 Effects of Apriona germari powder on the intestinal Escherichia coli count of diarrhea mice CFU/mL

2.1.2 對小鼠腸道總菌菌落數(shù)量的影響

由表3 可知：模型組小鼠結(jié)腸、盲腸和回腸內(nèi)的總菌菌落數(shù)量均顯著高于空白組和斗米蟲粉試驗(yàn)組(P＜0.05)，且盲腸內(nèi)的總菌菌落數(shù)量達(dá)52.36×106CFU/mL，是空白組的6.41 倍。試驗(yàn)小鼠3 個腸道內(nèi)總菌菌落數(shù)量均隨斗米蟲粉添加量的增加呈現(xiàn)不同程度的下降；12%斗米蟲粉組小鼠3 個腸道內(nèi)總菌菌落數(shù)量與空白組差異均不顯著(P＞0.05)，但顯著低于 4% 斗米蟲粉組(P＜0.05)。在回腸中，8%斗米蟲粉組的總菌菌落數(shù)量與12%斗米蟲粉組差異不顯著(P＞0.05)，但在盲腸和結(jié)腸中兩者差異顯著(P＜0.05)?？梢姡?2%斗米蟲粉對總菌數(shù)量的抑制效果最顯著。

表3 斗米蟲粉對腹瀉小鼠腸道總菌菌落數(shù)量的影響Tab.3 Effects of A.germari powder on the intestinal total bacteria count of diarrhea mice CFU/mL

2.2 斗米蟲粉對腹瀉小鼠血清相關(guān)酶活性的影響

2.2.1 對抗氧化酶活性的影響

由圖1 可知：模型組小鼠血清內(nèi)SOD、CAT、POD 和GST 等4 種抗氧化酶的活性均顯著低于空白組和斗米蟲粉組(P＜0.05)，且4 種抗氧化酶活性均隨斗米蟲粉添加量的增加而呈現(xiàn)不同程度的上升。12%斗米蟲粉組的SOD、CAT 和POD活性與空白組之間差異均不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于4%斗米蟲粉組(P＜0.05)；12%斗米蟲粉和8%斗米蟲粉組的SOD 和CAT 活性均無顯著差異(P＞0.05)，但12%斗米蟲粉組的POD 和GST 活性均顯著高于8%斗米蟲粉組(P＜0.05)?？梢姡?2%斗米蟲粉組抗氧化酶活性上升效果最顯著。

圖1 斗米蟲粉對腹瀉小鼠血清中抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of Apriona germari powder on the serum antioxidant enzymes activities of diarrhea mice

2.2.2 對消化相關(guān)酶活性的影響

由圖2 可知：模型組小鼠血清內(nèi)LDH、LPS和AMS 等3 種消化相關(guān)酶活性均顯著低于空白組和斗米蟲粉組(P＜0.05)，且3 種消化相關(guān)酶活性隨斗米蟲粉添加量的增多而呈現(xiàn)不同程度的上升。12%斗米蟲粉組的3 種消化相關(guān)酶活性均與空白組無顯著差異(P＞0.05)，且均顯著高于4%和8%斗米蟲粉組(P＜0.05)?？梢?，12%斗米蟲粉組消化相關(guān)酶活性上升效果最顯著。

圖2 斗米蟲粉對腹瀉小鼠血清中AMS、LDH 和LPS 活性的影響Fig.2 Effects of A.germari powder on the serum AMS,LDH and LPS activities of diarrhea mice

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)：病原性腹瀉是一種具有傳染性的疾病，也是導(dǎo)致動物幼體健康狀態(tài)不佳的重要病因[19]。大腸桿菌作為引發(fā)動物幼年個體發(fā)生病原性腹瀉的病原體，通過在動物機(jī)體腸道內(nèi)迅速繁殖產(chǎn)生有害腸毒素，擾亂腸道內(nèi)正常菌群；同時大腸桿菌外殼含有較多脂多糖，能穿越機(jī)體腸道黏膜并進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，顯著降低血液中SOD活性，致使腸道中丙二醛含量顯著上升，進(jìn)而減弱機(jī)體抵抗能力，并最終導(dǎo)致炎癥發(fā)生，引發(fā)一系列腹瀉癥狀[20-21]。本研究通過對腹瀉小鼠飼喂斗米蟲粉，檢測小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌與總菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)斗米蟲粉可有效抑制大腸桿菌生長并降低其數(shù)量。在有關(guān)昆蟲抑制大腸桿菌研究中，阿斯瑪[22]發(fā)現(xiàn)廄螫蠅(Stomoxys calcitrans)抗菌蛋白提取液對大腸桿菌生長具有抑制作用；安洪勇[23]發(fā)現(xiàn)蠅蛆抗菌肽能有效降低小鼠大腸桿菌數(shù)量。在有關(guān)中藥抑制大腸桿菌研究中，侯欣穎等[24]研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯對大鼠腸道大腸桿菌生長具有抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)論基本一致，說明斗米蟲對小鼠腸道內(nèi)的大腸桿菌具有較好的抑制作用。

當(dāng)動物機(jī)體發(fā)生病原性腹瀉時，體內(nèi)極易產(chǎn)生較多的巰基和超氧自由基，對機(jī)體本身造成危害，而抗氧化酶可以通過轉(zhuǎn)換上述毒害物質(zhì)或降低其毒性來保護(hù)機(jī)體免受傷害。作為動物機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，GST 能夠?qū)Υ罅炕钚噪暮兔笌€基起到保護(hù)作用；SOD 能把超氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，再經(jīng)過與CAT 聯(lián)合作用將H2O2分解成無毒的H2O，重構(gòu)成完整閉環(huán)的防氧化鏈，達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用[17]。本研究表明：飼喂斗米蟲粉可顯著提高小鼠血清中4 種抗氧化酶活性，提高其抗氧化性能。程逍妹等[25]研究發(fā)現(xiàn)：飼料中加入蠅蛆蛋白可提高凡納濱對蝦的免疫能力；劉黎等[26]研究發(fā)現(xiàn)：飼糧中添加蠅蛆粉對青魚的非特異性免疫和抗氧化性具有提升作用；WAN 等[27]研究發(fā)現(xiàn)：蠶提取物可顯著提升大鼠血清中SOD 活性。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論相類似，說明斗米蟲可提高小鼠抗氧化性能。

動物個體腹瀉時易引發(fā)功能性消化不良和新陳代謝緩慢等病癥，這多與個體內(nèi)部消化相關(guān)酶LPS、AMS 和LDH 活性下降有關(guān)[28]。本研究表明：飼喂斗米蟲后，小鼠血清中AMS、LPS 和LDH活性增加，說明斗米蟲對其腸道消化功能具有較好的改善作用，同時抗氧化酶活性增強(qiáng)可提高腸道免疫力。張玉棟等[17]發(fā)現(xiàn)：蠅蛆粉可顯著提升腹瀉小鼠腸道消化酶和抗氧化酶活性，提高小鼠消化機(jī)能和抗氧化機(jī)能。本研究對小鼠抗氧化酶與消化相關(guān)酶活性的研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，但是其相關(guān)作用機(jī)理及更高劑量下的治療效果有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

斗米蟲能顯著抑制腸道內(nèi)大腸桿菌的繁殖，且能有效降低其菌落數(shù)量，還可提高血清中抗氧化酶的活性以及消化吸收功能相關(guān)酶的活性。斗米蟲對由大腸桿菌引發(fā)的腹瀉病癥具有治療效果。本研究為闡釋斗米蟲治療腹瀉功效提供理論依據(jù)，也為藥用斗米蟲系列產(chǎn)品的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。