宿少鋒，王小燕，林之盼，金映紅，薛 楊

(1.海南省林業(yè)科學(xué)研究院/海南省紅樹林研究院，海南 海口 571100；2.海南文昌森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，海南 文昌 571300；3.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 海口 571100)

土壤微生物通過硝化作用、反硝化作用、腐殖質(zhì)的分解和合成等方式調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分和維持生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)代謝，是森林生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的組成部分[1-2]。土壤微生物不僅通過森林凋落物分解和土壤養(yǎng)分改善直接影響生態(tài)系統(tǒng)生物化學(xué)循環(huán)，還通過土壤碳代謝間接影響植物生長發(fā)育[3]。土壤微生物與地上植被是相互作用的有機體，地上植被通過改變非生物因子影響土壤微生物組成，而土壤微生物又通過改變土壤理化性質(zhì)反作用于植被[4-5]。微生物群落多樣性是衡量土壤微生物特征的重要指標(biāo)[6]，也是評價土壤肥力的重要生物指示指標(biāo)[7]，近年來也是研究植物—土壤生態(tài)系統(tǒng)的熱點領(lǐng)域。一些學(xué)者通過環(huán)境改變和人為干擾等外源因素的控制研究對土壤微生物多樣性特征的影響，如農(nóng)作物栽培[8]、環(huán)境控制[9-10]和根際分泌物[11-12]等。目前，測定土壤微生物群落多樣性的方法包括生理學(xué)譜圖分析、核酸分析和磷脂脂肪酸分析等[13]，其中，BIOLOG 微孔板分析法具有快速、靈敏、簡便和分辨力高等特點，可通過對單一碳源利用程度的測定反映微生物群體水平特征[14]。

土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性受環(huán)境條件、季節(jié)變化、坡度、坡向和地上植被的影響。相同環(huán)境條件下，不同森林類型土壤微生物分布特征也各不相同[15]。BACH 等[16]研究發(fā)現(xiàn)：凋落物分解和根際分泌物是土壤微生物所需的主要碳源，由于不同樹種所產(chǎn)生的凋落物質(zhì)量、分解速率以及根系分泌物存在差異，可對土壤微生物群落功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行影響或調(diào)控。此外，森林類型還會間接影響土壤結(jié)構(gòu)和土壤理化特性，進(jìn)而間接影響土壤微生物的群落組成和多樣性特征[17-18]。地域也是影響土壤微生物群落組成和多樣性特征的關(guān)鍵因子。微生物群落結(jié)構(gòu)隨著緯度的變化而變化[19]，與高緯度地區(qū)相比，低緯度地區(qū)溫、濕度更高，降雨量更多，凋落物分解速率更快。

目前，有關(guān)中亞熱帶土壤微生物多樣性的研究頗多，但熱帶地區(qū)低丘臺地平原地帶土壤微生物多樣性研究還未見報道。因此，本研究以熱帶地區(qū)6 種典型林分類型為研究對象，采用BIOLOG微孔板法研究不同林分類型土壤微生物代謝特征，探索不同林分類型對土壤微生物多樣性的影響規(guī)律，以期揭示熱帶人工林生態(tài)系統(tǒng)和天然林生態(tài)系統(tǒng)與土壤微生物的相互作用機制，為熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)經(jīng)營提供理論依據(jù)，也為進(jìn)一步探究土壤微生物群落特征與環(huán)境因子的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于海南省文昌市(N19°34′～19°43′，E110°43′～110°58′)，具有明顯的熱帶和亞熱帶氣候特點，屬熱帶季風(fēng)島嶼型氣候。研究區(qū)為低丘臺地平原地帶，平均海拔20～50 m；全年無霜凍，年平均溫度23.9～24.4 ℃；全年降雨量豐富，年平均降雨量1 529.8～1 948.6 mm，但時空分布不均，干、濕季明顯，11—4 月為干季，雨季主要集中在5—10 月。土壤類型為沙壤土。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤樣品采集和處理

于2019 年11 月，分別選取海拔和光照等生態(tài)因子相似的木麻黃林、椰子林、濕加松林、混交林、半紅樹林和次生林等6 種典型森林類型設(shè)置樣地(表1)。每種林分類型分別設(shè)置3 個20 m×20 m 的樣方，共18 個樣方。在樣方內(nèi)按“S”形采集0～20 cm 的土壤，采樣時去除表面浮土，相同樣方的土樣取等量充分混合后，去除根系和石塊，裝入無菌密封袋中，置于4 ℃的恒溫箱中保存，48 h 內(nèi)完成土壤微生物測定。每個樣方另取約500 g 土樣，帶回實驗室經(jīng)2 mm 篩網(wǎng)過篩處理后，自然風(fēng)干，用于測定土壤化學(xué)特性。

表1 不同森林類型樣地基本情況Tab.1 Basic situation of different forest types

1.2.2 土壤化學(xué)性質(zhì)測定

土壤化學(xué)性質(zhì)測定包括土壤pH 值、有機質(zhì)含量、土壤含水量、全氮含量、全磷含量和全鉀含量等6 個指標(biāo)。pH 值的測定采用電位法；有機質(zhì)含量的測定采用重鉻酸鉀氧化法；土壤含水量的測定采用恒溫箱烘干法；全氮含量的測定采用半微量開氏法；全磷含量的測定采用酸溶—鉬銻抗比色法；全鉀含量的測定采用堿溶—火焰光度法[20]。

1.2.3 土壤微生物群落多樣性測定

(1)碳源利用率

土壤微生物31 種碳源多樣性采用BIOLOG生態(tài)測試板(ECO)測定。取新鮮土壤樣品10 g放入三角瓶中，加入無菌水90 mL，同時加入少量玻璃珠，把三角瓶置于振蕩器上以120 r/min 充分振蕩30 min，靜置10 min 后，取上清液5 mL，用無菌水45 mL 進(jìn)行稀釋，充分搖勻，制得 1∶100的樣品提取液。用8 通道移液器分別吸取樣品提取液150 μL，置入BIOLOG 微孔板中，重復(fù)3 次，并設(shè)置1 個空白對照孔。在25 ℃恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)240 h，每間隔24 h 使用酶標(biāo)儀分別測定590 和750 nm 吸光值。

根據(jù)化學(xué)基團的性質(zhì)，把土壤微生物31 種碳源分為六大類：碳水化合物包括D-纖維二糖、D-甘露醇、α-D-乳糖、N-乙酰-D-葡萄糖氨、β-甲基-D-葡萄糖苷、1-磷酸葡萄糖、D-木糖、D,L-α-磷酸甘油、i-赤蘚糖醇和D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯等10 種；氨基酸類包括L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸等6 種；多聚物類包括吐溫-40、吐溫-80、α-環(huán)式糊精和肝糖等4 種；酚酸類包括2-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲酸；胺類包括苯乙胺和腐胺；羧酸類包括D-葡萄糖胺酸、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、γ-羥丁酸、衣康酸、α-丁酮酸和D-蘋果酸等7 種。

采用平均每孔顏色變化率[21](average well color development，AWCD)表征樣品中微生物群落對總碳源利用的整體情況及利用活性，可間接反映土壤微生物活性和微生物群落生理功能多樣性。通過計算不同類型森林土壤AWCD 值的3 次平均值繪制土壤微生物AWCD 動態(tài)變化曲線。計算公式為：

AWCD=(Ci-R)/N。

式中：Ci為反應(yīng)孔在碳源的吸光值；R為對照孔吸光值；N為碳源數(shù)，即31。

此外，將各類碳源平均C-R值的變化繪圖，獲得土壤微生物對不同碳源種類利用能力隨時間變化的情況。

(2)多樣性指數(shù)

McIntosh 指數(shù)(U)表征微生物群落在空間距離的多樣性特征；Shannon-Wiener 指數(shù)(H')表征樣品中微生物群落多樣性；Simpson 指數(shù)(D)表征微生物群落優(yōu)勢度特征；Pielou 均勻度指數(shù)(E)表征微生物群落均勻度特征。各指數(shù)計算公式為：

式中：ni為第i孔的相對吸光度，即ni=Ci-R；Pi為第i孔相對光密度值(Ci-R)與整個平板光密度總和的比值；S為微生物可利用碳源的數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010 進(jìn)行不同林分類型微生物多樣性數(shù)據(jù)的處理；采用SPSS 18.0 進(jìn)行單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)和不同類型土壤微生物群落對碳源利用特征的主成分分析(principle component analysis，PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物總碳源利用的動力學(xué)特征

由圖1 可知：隨著培養(yǎng)時間的延長，不同植被類型土壤微生物代謝速率均逐漸增強，總體呈倒“J”形曲線變化，但不同植被類型AWCD 值存在差異。24 h 時，半紅樹林、次生林和椰子林的土壤微生物活性較高，碳源已開始被利用；而木麻黃、濕加松和混交林的土壤微生物活性較低，碳源底物基本未被利用。24～48 h，次生林、半紅樹林、混交林和椰子林等4 種植被AWCD 值呈對數(shù)增長，表明土壤微生物對碳源利用明顯增加；而濕加松林和木麻黃林48 h 后AWCD 值才呈現(xiàn)對數(shù)增長。培養(yǎng)120 h 后，6 種植被類型增長速率逐漸緩慢；培養(yǎng)144～168 h，混交林、次生林、半紅樹林和椰子林的AWCD 達(dá)到最大值；培養(yǎng)240 h 時，濕加松和木麻黃林的AWCD 達(dá)到最大值，此時，不同植被類型AWCD 大小順序為：混交林＞半紅樹林＞次生林＞椰子林＞濕加松林＞木麻黃林，表明混交林的土壤微生物群落代謝活性最高，其次是次生林，木麻黃林土壤微生物代謝活性最差。

圖1 不同植被類型土壤微生物AWCD 值隨培養(yǎng)時間的變化Fig.1 Changes in AWCD value of soil microorganisms of different vegetation types with incubation time

2.2 土壤微生物對各類碳源的利用率

由圖2 可知：不同植被類型土壤微生物對六大類碳源的利用率存在差異。其中，混交林、半紅樹林、次生林和椰子林的土壤微生物對六大類碳源，尤其是碳水化合物、氨基酸類和多聚物的碳源利用率最高，而木麻黃林和濕加松林等人工純林的土壤微生物對六大類碳源的利用率均最低。

圖2 不同植被類型土壤微生物對不同碳源利用隨培養(yǎng)時間的變化Fig.2 Changes in the utilization of different carbon sources by soil microorganisms of different vegetation types with incubation time

根據(jù)AWCD 值的變化曲線(圖1)，192 h 后所有微生物的生長曲線基本平穩(wěn)，能更準(zhǔn)確地反應(yīng)微生物總體生長情況，因此，選取培養(yǎng)時間192 h 處的土壤AWCD 值進(jìn)一步分析不同土壤微生物對六大類碳源的利用情況。由圖3 可知：不同植被類型土壤微生物對六大類碳源底物利用率均存在顯著差異(P＜0.05)?？傮w而言，混交林、半紅樹林、次生林和椰子林對六大類碳源底物的利用率均較高，而濕加松和木麻黃林等純林對六大類碳源的利用率較低。不同群落土壤微生物的主要碳源利用情況也不同，其中，碳水化合物、氨基酸類和多聚物類是混交林和次生林群落的主要碳源，而氨基酸類和羧酸類是濕加松和木麻黃林等純林群落的主要碳源。

圖3 不同植被類型土壤微生物對不同碳源利用特征Fig.3 The utilization characteristics of different carbon sources by soil microorganisms of different vegetation types

2.3 土壤微生物多樣性指數(shù)特征

由表2 可知：BIOLOG-ECO 微平板培養(yǎng)192 h時，混交林的AWCD 值最高，其次是次生林和半紅樹林，木麻黃林最低；除次生林和半紅樹林外，不同植被類型的AWCD 值間均呈顯著差異(P＜0.05)，說明混交林土壤微生物對碳源底物消耗最大，微生物活性最高，而木麻黃林土壤微生物對碳源底物消耗最少，活性也最差。混交林、次生林、半紅樹林的McIntosh 指數(shù)明顯高于濕加松、椰子林和木麻黃人工純林，表明混交林、次生林和半紅樹林的土壤微生物種類較為豐富，碳源利用程度較高。6 種植被類型中，混交林的Shannon-Wiener 指數(shù)最高(4.39±0.02)，木麻黃最低(3.01±0.22)，說明混交林土壤微生物種類更多且分布更均勻。Simpson 指數(shù)大小順序為次生林＞半紅樹林＞混交林＞椰子林＞濕加松林＞木麻黃林，表明次生林土壤中某些優(yōu)勢菌生長最為旺盛，而木麻黃、濕加松和椰子林等純林優(yōu)勢菌群生長較差。

表2 土壤微生物群落的AWCD 和多樣性指數(shù)(192 h)Tab.2 AWCD and diversity index of soil microbial communities

2.4 土壤微生物碳源利用的主成分分析

應(yīng)用主成分分析法(principal component analysis)從31 種因子中提取2 個主要因子，以分析6 種林分類型土壤微生物代謝功能。由圖4 可知：主成分1(PC1)可以解釋所有變量方差的47.32%，主成分2(PC2)可以解釋所有變量方差的31.58%，累計貢獻(xiàn)可以達(dá)到78.90%。濕加松群落和木麻黃群落與其他4 種群落在PC1 和PC2上分布較遠(yuǎn)，且分布在主成分PC1 軸的負(fù)半軸，說明濕加松和木麻黃與其他4 種群落的碳源利用差異較大；而椰子林、次生林、半紅樹林和混交林均分布于PC1 軸的正方向附近，說明它們對碳源的利用能力較一致。

圖4 不同植被類型土壤微生物碳源利用主成分分析Fig.4 Principal component analysis of soil microbial carbon source utilization in different vegetation types

由表3 可知：31 種碳源中，與PC1 相關(guān)度較高的有20 種，其中碳水化合物和羧酸類各7種，氨基酸類3 種，酚酸類、聚合物類和胺類各1 種，對 PC1 起分異作用的主要碳源是碳水化合物和羧酸類；與PC2 相關(guān)度較高的有13 種，其中氨基酸類4 種，碳水化合物和羧酸類各3 種，聚合物類2 種，胺類1 種，對 PC2 起分異作用的主要碳源是氨基酸類。

表3 PC1 和PC2 的碳源載荷因子Tab.3 Carbon sources loading factors of PC1 and PC2

2.5 不同林分土壤理化特性與微生物群落特征的關(guān)系

由表4 可知：不同植被類型土壤理化性質(zhì)差異顯著。土壤pH 值在4.78～6.17 之間，表明試驗地植被土壤為典型的酸性土壤。土壤平均含水量在46.67%～72.04%之間，不同林分土壤含水量順序為半紅樹林＞次生林＞椰子林＞混交林＞濕加松林＞木麻黃林，即天然林含水量高于人工林，而椰子林含水量高于混交林和其他2 種純林。不同植被類型土壤化學(xué)特性有較大差異，總體而言，半紅樹林和次生林等天然林土壤養(yǎng)分明顯優(yōu)于人工林，木麻黃林土壤養(yǎng)分最差。

表4 不同植被類型土壤理化特性比較Tab.4 Soil physical and chemical properties of different vegetation types

由表5 可知：土壤微生物群落多樣性指數(shù)與土壤pH 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中McIntosh 指數(shù)、Shannon-Wiener 指數(shù)和Pielou 指數(shù)達(dá)到顯著水平(P＜0.05)；4 個多樣性指數(shù)與土壤含水量均呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，與總有機碳含量和全氮含量均呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。

表5 土壤理化特性與微生物群落特征關(guān)系Tab.5 Relationship between soil physicochemical properties and microbial community characteristics

3 討論

植被類型是影響土壤微生物群落多樣性的主要影響因子之一，土壤平均顏色變化率(AWCD)是衡量土壤微生物群落利用碳源能力的重要指標(biāo)[22]。隨著培養(yǎng)時間的增加，熱帶地區(qū)6 種植被類型的AWCD 值均表現(xiàn)出適應(yīng)期、對數(shù)期和穩(wěn)定期等微生物生長曲線，不同植被類型AWCD大小順序為：混交林＞半紅樹林＞次生林＞椰子林＞濕加松林＞木麻黃林，表明混交林的土壤微生物群落代謝活性最高，其次是半紅樹林，木麻黃純林土壤微生物代謝活性最差?？梢?，立地條件基本一致時，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能受植被的影響不同?？傮w而言，半紅樹林和次生林等天然林AWCD 值明顯高于人工純林，這與賀若陽等[23]和鄭華等[24]的研究結(jié)果一致；而人工混交林AWCD 值高于天然林，表明通過改變植被結(jié)構(gòu)和組成可以推動土壤微生物活性和功能種群結(jié)構(gòu)變化，從而增強土壤微生物群落的代謝活性。

此外，不同植被類型土壤微生物對六大類碳源的利用率存在差異，混交林、半紅樹林、次生林和椰子林對六大類碳源底物利用率均較高，其中碳水化合物、氨基酸類和多聚物是其主要碳源利用形式；而木麻黃和濕加松人工純林土壤微生物對這6 種碳源底物的利用率均不高，其中氨基酸類和羧酸類碳源是其主要碳源利用形式。主成分分析也進(jìn)一步表明：混交林、半紅樹林、次生林和椰子林的碳源利用形式較一致，而木麻黃和濕加松人工純林對碳源的利用形式與其他林分不一致。McIntosh 指數(shù)、Shannon-Wiener 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和Pielou 指數(shù)是評估土壤微生物群落狀態(tài)與功能的重要指標(biāo)，能夠準(zhǔn)確反映微生物的群落特征[25]。不同植被土壤微生物的多樣性指數(shù)也呈現(xiàn)出混交林、半紅樹林和次生林高于人工純林的趨勢。主成分分析表明：不同植被類型土壤微生物群落代謝多樣性能夠明顯區(qū)分，其中PC1 可以解釋所有變量方差的47.32%，PC2 可以解釋所有變量方差的31.58%，累計貢獻(xiàn)可以達(dá)到78.90%。對 PC1 起分異作用的主要碳源是碳水化合物和羧酸類，對 PC2 起分異作用的主要碳源是氨基酸類。

森林生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物群落多樣性還受土壤養(yǎng)分、凋落物、根系分泌物和水熱狀況的影響[26]。不同植被類型通過其林下凋落物數(shù)量、組成和分解影響土壤理化特性，進(jìn)而影響土壤微生物的數(shù)量、組成和分布特征[27]。在本研究中，混交林、半紅樹林和次生林土壤微生物群落多樣性明顯高于濕加松和木麻黃人工純林，表明林分結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，植物種類越豐富，土壤微生物種群代謝活性也越高。土壤微生物群落功能多樣性與土壤理化特性相關(guān)性分析表明：土壤微生物群落多樣性與土壤有機碳和全氮含量之間呈極顯著正相關(guān)，與土壤pH 呈負(fù)相關(guān)，與土壤含水量呈顯著正相關(guān)。可見，土壤養(yǎng)分對土壤微生物群落特征具有重要影響，尤其是土壤有機質(zhì)和土壤全氮。土壤有機質(zhì)和全氮含量為土壤各種功能的維持、轉(zhuǎn)換提供必要的能量及底物，對微生物群落的構(gòu)成起到關(guān)鍵作用。不同植被類型林分凋落物數(shù)量和組成不同，其養(yǎng)分含量也有較大差異。通過野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)：混交林、半紅樹林和次生林林下物種豐富度較高，林分凋落物含量也明顯高于濕加松和木麻黃等人工純林，分解層和半分解層尤為明顯，說明混交林、半紅樹林和次生林的凋落物更易分解，對土壤有機質(zhì)的轉(zhuǎn)換率更高，從而促進(jìn)土壤微生物的生長和代謝。另外，與人工純林相比，混交林、半紅樹林和次生林的林分結(jié)構(gòu)復(fù)雜、群落多樣性高，具有更高的根系分泌物和根系生物量，對于土壤氮的利用率也明顯更高。

綜上所述，土壤微生物是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是連接植物和土壤的紐帶。不同植被類型通過凋落物的組成和結(jié)構(gòu)影響土壤微生物的組成和分布，土壤微生物也可通過驅(qū)動養(yǎng)分、競爭和協(xié)調(diào)等復(fù)雜的過程影響植物，研究土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能多樣性對于揭示植物—土壤微生物—土壤之間的關(guān)系及驅(qū)動機理具有重要意義。本研究利用BIOLOG 法分析海南熱帶地區(qū)6 種典型森林植被微生物群落特征，并取得了一定的成果，但微生物群落特征也具有典型的季節(jié)性特征，且BIOLOG 法僅能反映出土壤中快速生長的微生物活性，不能表征慢性生長類微生物活性，因此，今后的研究可以結(jié)合其他土壤微生物的研究方法，進(jìn)一步揭示不同植被類型微生物群落的季節(jié)性特征和不可培養(yǎng)型土壤微生物的群落特征。

4 結(jié)論

(1)海南島6 種林分類型土壤微生物群落功能多樣性從高到低排序為：混交林＞半紅樹林＞次生林＞椰子林＞濕加松林＞木麻黃林。在生產(chǎn)實踐中，通過合理的混交林種植改變森林結(jié)構(gòu)對促進(jìn)土壤微生物群落特征具有重要作用。

(2)不同林分類型對六大類主要碳源的利用率存在差異?；旖涣帧爰t樹林、次生林和椰子林對六大類碳源底物的利用率均較高，碳水化合物、氨基酸類和多聚物是其主要碳源利用形式；木麻黃和濕加松人工純林對六大類碳源底物的利用率不高，氨基酸類和羧酸類是其主要碳源利用形式。

(3)土壤養(yǎng)分對熱帶森林微生物群落功能多樣性有重要影響。土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)與土壤有機碳含量、全氮含量和含水量之間存在正相關(guān)關(guān)系，與土壤pH 存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。