奎秀瑩，王文廣，金亮子，鄧 偉，仝品芬，陸彩霞 ，代解杰

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650031；2.昆明醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650031；3.云南大學(xué) 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650031)

皮膚成纖維細(xì)胞是網(wǎng)狀真皮層中較為常見(jiàn)的細(xì)胞[1]，能夠在結(jié)締組織中分泌和沉積大量整合素和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，包括膠原蛋白、彈性纖維和結(jié)合蛋白等[2]。由于能夠分泌一系列的ECM，皮膚成纖維細(xì)胞在皮膚的衰老、光老化[3-4]、炎癥、燒傷或機(jī)械損傷[5]、瘢痕形成[6]和腫瘤及其他皮膚相關(guān)疾病等多種皮膚修復(fù)過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。目前，已有研究者成功分離出小鼠皮膚成纖維細(xì)胞[7]、大鼠皮膚成纖維細(xì)胞[8]、人皮膚成纖維細(xì)胞[9]、裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞[10]和驢皮成纖維細(xì)胞[11]，并基于不同物種的皮膚成纖維細(xì)胞開(kāi)展了皮膚疾病相關(guān)研究。樹(shù)鼩屬攀鼩目小型哺乳動(dòng)物，具有體型小、繁殖快的特點(diǎn)，進(jìn)化上比嚙齒類更接近非人靈長(zhǎng)類。FAN 等[12]研究顯示：樹(shù)鼩在神經(jīng)系統(tǒng)、視覺(jué)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)上與人相似，已被用于眼部[13]、視神經(jīng)和腦部神經(jīng)發(fā)育相關(guān)疾病以及多種肝炎病毒[14-17]、寨卡病毒[18]、單純皰疹病毒[19]和流感病毒[20]等疾病的模型研究中。已有研究對(duì)樹(shù)鼩進(jìn)行肺纖維化誘導(dǎo)，建立了與臨床患者出現(xiàn)相似癥狀的肺纖維化模型[21]。ZHANG 等[22]對(duì)樹(shù)鼩皮膚結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)其與恒河猴及人的皮膚結(jié)構(gòu)極為相似，有豐富的汗腺和皮脂腺，且汗腺分布在毛球頂部周圍，與毛囊皮脂腺等共同組成與人類相似的附屬皮膚單位，而小鼠汗腺和皮脂腺并不明顯，表明樹(shù)鼩是皮膚相關(guān)疾病研究的潛在非人靈長(zhǎng)類替代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

課題組前期分離出原代樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞[23]，然而，原代細(xì)胞往往只能夠穩(wěn)定增長(zhǎng)幾個(gè)代次，傳代次數(shù)過(guò)多細(xì)胞便會(huì)出現(xiàn)各種問(wèn)題，如細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變和細(xì)胞增殖變緩，試驗(yàn)過(guò)程中很容易錯(cuò)過(guò)細(xì)胞的最佳生長(zhǎng)時(shí)期，阻礙了皮膚相關(guān)疾病細(xì)胞模型的構(gòu)建和相關(guān)機(jī)制的研究。此外，對(duì)于需要反復(fù)驗(yàn)證的試驗(yàn)，原代細(xì)胞幾乎無(wú)法再次重復(fù)，每一批次分離出的細(xì)胞難免會(huì)有差異，并且耗時(shí)長(zhǎng)，試驗(yàn)效率會(huì)受到很大影響。因此，建立能夠連續(xù)多次傳代的永生化細(xì)胞可彌補(bǔ)原代細(xì)胞的不足。本研究通過(guò)優(yōu)化分離樹(shù)鼩原代皮膚成纖維細(xì)胞的方法，再利用攜帶SV40T的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)過(guò)50 代以上的傳代，以期獲得永生化樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞，為皮膚相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和慢病毒

供試樹(shù)鼩為滇西亞種中緬樹(shù)鼩(Tupaia belangeri chinensis)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心提供，雄性，1 歲，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滇)K2018-0002，使用許可證號(hào)為SYXK(滇)K2018-0002。本研究遵循試驗(yàn)動(dòng)物使用3R 原則和福利倫理原則。

攜帶SV40T基因的慢病毒由漢恒生物科技(上海)有限公司構(gòu)建，病毒滴度為1×109TU/mL。

1.2 樹(shù)鼩成纖維細(xì)胞的酶消化法分離純化

本試驗(yàn)在白劍等[23]的酶消化法基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)。取約1 歲的樹(shù)鼩腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.5 mL 麻醉后處死，用75%酒精進(jìn)行皮膚消毒，刮除樹(shù)鼩大腿內(nèi)側(cè)的毛發(fā)，剪下約2.5 cm×1.5 cm 的皮膚組織塊，在含2%青霉素—鏈霉素(美國(guó)Gibco)的PBS(美國(guó) Hyclone)中反復(fù)刮洗3次，將組織塊剪碎為約1 mm3的塊狀，置于50 mL離心管中，加入0.1% Ⅰ型膠原酶(PBS 配制)，于37 ℃恒溫箱中消化45 min，每15 min 振蕩1 次，使組織塊與Ⅰ型膠原酶充分接觸。消化完成后用100 目的鋼網(wǎng)篩過(guò)濾細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清后加入完全培養(yǎng)基[ 配方為：MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(以色列Biological Industries)+10% FBS(以色列Biological Industries)+1%青霉素—鏈霉素+1% NaHCO3+1%非必需氨基酸(美國(guó)Gibco)]重懸細(xì)胞，1 000 r/min 離心10 min，用完全培養(yǎng)基再次重懸后轉(zhuǎn)至6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。待細(xì)胞鋪滿皿底時(shí)，用PBS 清洗原代細(xì)胞3 次，每孔加入0.25% Trypsin-EDTA 胰蛋白酶(美國(guó)Gibco)500 μL，室溫消化3 min 后吸棄胰蛋白酶，加入完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打，待變圓的皮膚成纖維細(xì)胞脫落后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染樹(shù)鼩成纖維細(xì)胞

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的皮膚成纖維細(xì)胞以1×105mL-1的密度接種于6 孔板，每孔2 mL，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上時(shí)，用PBS 清洗2 次，加入含4 μg/mL助轉(zhuǎn)劑的培養(yǎng)液1 mL，以感染復(fù)數(shù)(MOI)為30 接種攜帶SV40T基因的慢病毒，并設(shè)不接種的空白對(duì)照孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后補(bǔ)加含4 μg/mL 助轉(zhuǎn)劑的培養(yǎng)液1 mL，培養(yǎng)24 h 后更換為新鮮且不含助轉(zhuǎn)劑的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后，將培養(yǎng)液更換為含4 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，2 d 更換1 次培養(yǎng)液，直至空白對(duì)照孔的細(xì)胞完全死亡。

1.4 有限稀釋法挑取單克隆

細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上時(shí)，用0.25%Trypsin-EDTA 胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋至密度為103mL-1，再進(jìn)行10 倍梯度稀釋，直至約10 mL-1，每個(gè)密度梯度接種16 孔(2 排)96 孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d 觀察并標(biāo)記由單個(gè)細(xì)胞增殖形成的單個(gè)細(xì)胞群。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，消化轉(zhuǎn)至24 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，并逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，每消化1 次記為1 代。

1.5 樹(shù)鼩成纖維細(xì)胞傳代

細(xì)胞匯合度達(dá)80%以上時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次，用0.25%胰蛋白酶消化，1.5 min后吸棄胰蛋白酶，待大部分細(xì)胞變圓、培養(yǎng)瓶底部變成毛玻璃狀時(shí)加入培養(yǎng)液終止消化，以1∶6的比例傳代培養(yǎng)，定期拍照保存。

1.6 樹(shù)鼩永生化皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取第52 代細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，稀釋至密度為5×104mL-1，接種于96 孔板，每孔100 μL，按照CCK-8 試劑盒(上海東仁)說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)6 d 的細(xì)胞增殖情況，并以6 d的吸光度值繪制細(xì)胞增殖動(dòng)力曲線圖。

1.7 免疫熒光鑒定

取第52 代細(xì)胞，經(jīng)消化后將其稀釋至密度為1×105mL-1，接種于24 孔板，每孔500 μL，同時(shí)用樹(shù)鼩原代腦內(nèi)皮細(xì)胞作對(duì)照。待細(xì)胞貼壁后，PBS 清洗2 次；用4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛于室溫固定細(xì)胞20 min，PBS 清洗3 次，每次5 min；0.5% Triton X-100(PBS 稀釋)室溫通透20 min，PBS 清洗3 次，每次5 min；用0.01 mmol/L PBS 稀釋至20%的山羊血清封閉液封閉30 min，PBS 清洗3 次，每次5 min；加入1∶500 的鼠抗波形蛋白單克隆抗體和1∶50 的兔抗SV40T 單克隆抗體(一抗稀釋液稀釋，每個(gè)抗體2 個(gè)復(fù)孔)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 清洗3 次，每次5 min；分別加入1∶500 的羊抗鼠二抗和驢抗兔二抗(用0.01 mmol/L PBS 稀釋)，37 ℃避光孵育1 h，PBS 清洗3 次，每次5 min；加入5 μg/mL DAPI染色液，室溫避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBS 漂洗4 次，每次5 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.8 細(xì)胞核型分析

取第53 代細(xì)胞消化轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入4 ℃預(yù)冷的80 μg/mL 秋水仙素(美國(guó)Sigma)200 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，PBS 清洗3 次，每次5 min；用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)至15 mL離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；加入37 ℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCl 溶液7 mL，輕輕吹散細(xì)胞，室溫低滲25 min，期間若有沉淀時(shí)需要輕輕吹打，使細(xì)胞與KCl 低滲液充分接觸，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；加入現(xiàn)配卡諾固定液(V甲醇∶V冰醋酸=3∶1)7 mL，固定5 min后沿管壁輕輕吹打，使沉淀的細(xì)胞翻轉(zhuǎn)，固定5 min 后，輕輕吹散細(xì)胞，繼續(xù)固定20 min，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；再次以7 mL 固定液以同樣方式固定25 min，1 000 r/min 離心5 min，棄去上清后重新加入適量固定液，重懸細(xì)胞。取4 ℃預(yù)冷的載玻片，吸管吸取混勻的細(xì)胞液懸空30 cm 垂直滴3 滴至載玻片上，斜靠載玻片流掉多余細(xì)胞液，自然風(fēng)干12 h；將載玻片放入染缸中，加入Giemsa 染液(北京索萊寶)染色2 h，之后流水沖洗載玻片，自然風(fēng)干12 h 后封片，在顯微鏡下用油鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同代次的樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞

由圖1 可知：樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)總體較均一，為梭形，較胖，細(xì)胞增殖速度較快。以1∶6 傳代后，2 d 便長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，可繼續(xù)傳代；培養(yǎng)2 d 后細(xì)胞上清中出現(xiàn)少許死細(xì)胞漂浮，45代后細(xì)胞增殖有所減慢，約3 d 可長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，細(xì)胞狀態(tài)也有所變化，部分細(xì)胞出現(xiàn)拉絲，細(xì)胞兩端拉長(zhǎng)，但大部分細(xì)胞仍能維持原有形態(tài)。

圖1 不同代次的樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞(200×)Fig.1 Skin fibroblasts of Chinese tree shrew in different generations

2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

由圖2 可知：細(xì)胞數(shù)量在第2～3 天時(shí)明顯增加，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，之后緩慢增長(zhǎng)，在第5 天時(shí)達(dá)到高峰，進(jìn)入平臺(tái)期。

圖2 第53 代樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of Chinese tree shrew skin fibroblasts in the 53th generation

2.3 免疫熒光鑒定

由圖3 可知：樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中有明顯的成纖維細(xì)胞特異性蛋白Vimentin 信號(hào)，而原代腦內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)該信號(hào)，結(jié)合樹(shù)鼩原代皮膚成纖維細(xì)胞的分離方法及細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析[23]，判定分離得到的細(xì)胞是樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞。

圖3 第52 代樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞波形蛋白免疫熒光鑒定(200×)Fig.3 Vimentin identification of Chinese tree shrew skin fibroblasts in the 52th generation by immunofluorescence

由圖4 可知：樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞核處有明顯的SV40T 信號(hào)，而原代腦內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)該信號(hào)，說(shuō)明SV40T 已成功導(dǎo)入到所獲得樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞中。

圖4 第52 代樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞永生化基因SV40T 免疫熒光鑒定(200×)Fig.4 SV40T identification of Chinese tree shrew skin fibroblasts in the 52th generation by immunofluorescence

2.4 核型分析

選取53 代樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行核型分析，對(duì)細(xì)胞分裂相進(jìn)行觀察，結(jié)果(圖5)顯示：所獲得的樹(shù)鼩永生化皮膚成纖維細(xì)胞染色體數(shù)為62 條，與滇西亞種中緬樹(shù)鼩的染色體數(shù)[24]一致，說(shuō)明試驗(yàn)所得細(xì)胞是樹(shù)鼩來(lái)源細(xì)胞。

圖5 第52 代樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞核型分析Fig.5 Karyotype identification of Chinese tree shrew skin fibroblasts in the 52th generation

3 討論

本研究參考白劍等[23]的酶消化法分離得到的細(xì)胞確定為樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞。本研究針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行了改良優(yōu)化，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%血清、1%雙抗、1%非必需氨基酸和1%NaHCO3，但沒(méi)有添加低血清生長(zhǎng)添加物。使用改良后的培養(yǎng)基細(xì)胞增殖能力仍然較強(qiáng)，生長(zhǎng)狀態(tài)也較好，即使數(shù)十次傳代后細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)也未出現(xiàn)差異，可提高試驗(yàn)的重復(fù)性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性；此外，還避免了血清未知成分對(duì)細(xì)胞的損傷，提高了細(xì)胞質(zhì)量和試驗(yàn)效率，一方面節(jié)省了細(xì)胞培養(yǎng)成本，另一方面減少了人為添加生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的改變和影響。

本研究分離所得的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好，不同代次之間細(xì)胞整體形態(tài)一致，均為梭形纖維狀和多角纖維狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間排列緊密，有典型的成纖維細(xì)胞特性。這與人及大鼠[25]永生化后的皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)類似，且與原代細(xì)胞沒(méi)有明顯區(qū)別。成纖維細(xì)胞特異性波形蛋白(Vimentin)鑒定結(jié)果證實(shí)所獲得的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，與人體皮膚成纖維細(xì)胞的鑒定結(jié)果[9]一致；永生化基因SV40T檢測(cè)證實(shí)已經(jīng)將該基因成功導(dǎo)入成纖維細(xì)胞，在細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程中，其能夠在維持細(xì)胞狀態(tài)的同時(shí)無(wú)限增殖。永生化的成纖維細(xì)胞染色體數(shù)為62 條，與滇西亞種中緬樹(shù)鼩[24]一致，證實(shí)所得細(xì)胞為樹(shù)鼩源細(xì)胞。樹(shù)鼩永生化皮膚成纖維細(xì)胞的建立為人類皮膚相關(guān)疾病的體外研究提供了新材料，也為體內(nèi)皮膚治療藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

目前廣泛用于永生化細(xì)胞建立的方法主要有病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)(包括人乳頭瘤病毒、人類皰疹病毒和猴腎病毒SV40 等)、化學(xué)致癌物誘導(dǎo)射線、基因自發(fā)突變和端?！肆Ｃ讣せ钫T導(dǎo)產(chǎn)生。病毒誘導(dǎo)主要是病毒感染細(xì)胞后，通過(guò)改變細(xì)胞基因使細(xì)胞度過(guò)致死期，從而能夠無(wú)限增殖，以成功誘導(dǎo)永生化細(xì)胞[26]。其中，SV40的應(yīng)用機(jī)制為SV40基因被導(dǎo)入細(xì)胞核后，細(xì)胞內(nèi)的抑癌基因P53和pRb及相應(yīng)蛋白能夠與其大T 抗原特定結(jié)合域結(jié)合，導(dǎo)致抑癌基因無(wú)法正常表達(dá)，細(xì)胞得以無(wú)限增殖并出現(xiàn)腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)變[27]。而病毒在感染細(xì)胞時(shí)，感染效率與細(xì)胞種類有極大的關(guān)系，慢病毒由于轉(zhuǎn)染效率較高而被廣泛應(yīng)用?；瘜W(xué)和射線誘導(dǎo)均是將細(xì)胞進(jìn)行癌變誘導(dǎo)[28]，而這個(gè)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)無(wú)法預(yù)測(cè)的其他基因突變，對(duì)構(gòu)建目的細(xì)胞模型造成困擾。自發(fā)突變則是在細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中，自發(fā)的基因突變引起細(xì)胞不斷增殖，出現(xiàn)細(xì)胞永生化現(xiàn)象，但這一方式隨機(jī)性極強(qiáng)，突變后的基因型極不穩(wěn)定，或許已經(jīng)丟失了細(xì)胞的原本特性，用于試驗(yàn)時(shí)易出現(xiàn)多種不確定因素。端粒—端粒酶激活主要是通過(guò)活化細(xì)胞內(nèi)的端粒酶，使其相對(duì)高水平地發(fā)揮催化端粒復(fù)制和維持端粒長(zhǎng)度的功能[29]，以保證細(xì)胞無(wú)限分裂。本研究采用慢病毒包裝SV40T基因，在確保細(xì)胞基因能夠往所需方向突變的基礎(chǔ)上，大大提高了目的基因被導(dǎo)入細(xì)胞基因組的效率，對(duì)細(xì)胞的永生化建立起到很好的效果。

皮膚成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織的重要組成成分，對(duì)維持皮膚彈性和韌性具有重要作用。本研究獲得的永生化樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞是可以穩(wěn)定傳代的細(xì)胞，試驗(yàn)時(shí)能夠即取即用，省去了每次試驗(yàn)需要重新分離純化細(xì)胞的步驟，并且不同代次間的細(xì)胞狀態(tài)差別較小，試驗(yàn)重復(fù)性高，能夠有效排除試驗(yàn)結(jié)果的偶然性，保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。已有研究表明：樹(shù)鼩皮膚結(jié)構(gòu)與恒河猴及人類皮膚極為相似[22]；但小鼠和人類皮膚結(jié)構(gòu)明顯不同，如人類皮膚表皮內(nèi)陷，出現(xiàn)網(wǎng)脊，表皮和真皮層均較厚，而小鼠網(wǎng)脊不突出，皮層均較薄[30]，且小鼠的汗腺皮脂腺不發(fā)達(dá)。因此，建立樹(shù)鼩永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系，并利用該細(xì)胞開(kāi)展人類皮膚疾病的致病機(jī)理研究和相關(guān)藥物研發(fā)具有重要意義。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)染含SV40T永生化基因后的樹(shù)鼩皮膚成纖維細(xì)胞，經(jīng)過(guò)53 代以上的傳代培養(yǎng)仍能維持原有狀態(tài)，不同代次間細(xì)胞整體形態(tài)一致且排列緊密，有典型的成纖維細(xì)胞特性；細(xì)胞增殖能力旺盛且其永生化特性得以穩(wěn)定表達(dá)；細(xì)胞的核型鑒定結(jié)果證明所得細(xì)胞確為樹(shù)鼩源細(xì)胞。本研究成功建立1 株樹(shù)鼩永生化皮膚成纖維細(xì)胞，為人類皮膚相關(guān)疾病的體外研究提供了新材料。