敖 靜，李 楊，劉曉輝，高曉梅，孫玉祿

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽 122000)

黃瓜枯萎病是主要由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)侵染引起的土傳真菌病害，可侵染多種植物寄主，病菌通過分泌降解酶和菌毒素等侵染作物的維管束系統(tǒng)，導(dǎo)致作物出現(xiàn)萎蔫和腐爛等癥狀[1-2]，可引起作物和花卉枯萎病，嚴(yán)重時造成植株死亡，從而使作物大量減產(chǎn)，影響農(nóng)業(yè)發(fā)展[3-5]。尖孢鐮刀菌的菌絲和孢子可存留在土壤或作物種子上越冬，在土壤和空氣中能存活10 年以上[6]。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要通過化學(xué)藥劑防治尖孢鐮刀菌，如利用唑類、甲酯類和酰胺類等藥物對種子進(jìn)行消毒，或?qū)ψ魑镏仓赀M(jìn)行灌根等處理以抑制病原菌生長[7-8]，但長期大量施用化學(xué)藥品不僅會污染作物、土壤和水系，產(chǎn)生病原菌耐藥性的風(fēng)險，還會直接影響人類健康[9-10]。目前，生物防治是應(yīng)用前景廣、成本較低且綠色無污染的技術(shù)[11]。本研究以尖孢鐮刀菌黃瓜轉(zhuǎn)化型為研究對象，通過從設(shè)施溫室土壤中篩選出高效拮抗菌株并研究其抑菌作用，旨在為進(jìn)一步探究拮抗菌的生防作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌：尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)黃瓜轉(zhuǎn)化型，由遼寧省微生物科學(xué)研究院分離。

1.2 拮抗菌的篩選和鑒定

1.2.1 拮抗菌篩選

于遼寧省朝陽市喀左縣六官營子鄉(xiāng)東前溝村(N41.16°，E119.68°)種植黃瓜的設(shè)施溫室中采集土壤樣品，將其混勻后稱取1.0 g 放至99 mL無菌水中，振蕩約30 min。梯度稀釋至10-5倍，吸取100 μL 均勻涂布于含病原菌的平皿中，28 ℃培養(yǎng)24 h，將能產(chǎn)生抑菌圈的菌株分離純化，即得到初篩菌株。利用平板對峙法[12]測定抑菌率，篩選出抑菌率較高的拮抗菌株。抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

1.2.2 生理生化鑒定及16S rDNA 序列比對

采用劃線法將所得拮抗菌株接種到LB 固體培養(yǎng)基[13]平皿上，觀察菌落形態(tài)及其顯微形態(tài)，并進(jìn)行生理生化試驗。16S rDNA 擴(kuò)增引物序列為：F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。反應(yīng)體系總體積50.0 μL，包括：上、下游引物各1.5 μL，細(xì)菌基因組1.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，Taq聚合酶1.0 μL，dNTP 1.0 μL，ddH2O 39.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后送至上海派森諾生物技術(shù)有限公司完成測序。將16S rDNA 序列與Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，利用MEGA 軟件進(jìn)行比對及構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3 抑菌作用研究

1.3.1 揮發(fā)性物質(zhì)對病原菌菌絲的影響

采用平皿倒扣法，一個平皿加入PDA 培養(yǎng)基，并于中心接種直徑為5 mm 的尖孢鐮刀菌菌塊，另一個平皿加入LB 固體培養(yǎng)基，將拮抗菌種混懸液(調(diào)節(jié)密度為108CFU/mL)均勻涂布，2 個平皿倒扣用封口膜封口，并用保鮮膜密封，以空白LB固體培養(yǎng)基平皿為對照。28 ℃培養(yǎng)，觀察處理組病原菌生長情況，每個處理重復(fù)3 次[14]。

1.3.2 拮抗菌對病原菌菌絲形態(tài)的影響

采用平板對峙法，將直徑為5 mm 的尖孢鐮刀菌菌餅接種至PDA 培養(yǎng)基平皿中心，在距離中心2.5 cm 處接種拮抗菌菌塊，挑取靠近拮抗菌一側(cè)的病原菌菌絲，在顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。將靠近拮抗菌一側(cè)的病原菌菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察其是否有再生長能力，每24 h 測量菌落直徑大小，以未經(jīng)對峙處理的病原菌菌絲為對照，每個處理組設(shè)置3 個重復(fù)[15]。

1.3.3 胞外物質(zhì)對病原菌及孢子萌發(fā)的影響

將拮抗菌接種到100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h 得到種子液；將種子液按2%的比例接到LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，低溫5 000 r/min 離心10 min，棄去下沉菌體，再用0.22 μm 濾膜過濾，即得到無菌發(fā)酵液。將培養(yǎng)5 d 的病原菌菌絲用去離子水洗脫，再用6 層紗布過濾，10 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，收集孢子，用去離子水制備孢子混懸液，調(diào)節(jié)其密度為106個/mL，備用。

將1 mL 病原菌孢子混懸液與10 mL 融化冷卻至約45 ℃的PDA 培養(yǎng)基混合搖勻后倒入平皿中冷卻，采用牛津杯法，向牛津杯中加入100 μL無菌發(fā)酵液，以LB 液體培養(yǎng)基為空白對照，將平皿置于(28±1)℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)，并測量抑菌圈大小，每個處理設(shè)置3 個重復(fù)[16]。精確吸取0.50 mL 孢子混懸液與同體積無菌發(fā)酵液混合，將混合液體滴于凹玻片，然后放于平皿中，加蓋保濕培養(yǎng)，恒溫箱設(shè)置28 ℃，分別于2、4、6、8 和10 h 檢測孢子萌發(fā)數(shù)，以無菌水為對照，每個處理組設(shè)置3 個重復(fù)[17]。

1.4 HPLC 分析條件

采用Agilent 1260 高效液相色譜分析儀和Venusil XBP C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)進(jìn)行HPLC 分析，流動相由色譜純乙腈(A)和純化水(B)組成，梯度洗脫程序見表1。進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL/min，波長220 nm，收集各峰成分并進(jìn)行抑菌試驗。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選結(jié)果

土壤樣品中共分離出細(xì)菌菌株32 株，其中有8 株(XN-1～XN-8)對尖孢鐮刀菌有抑菌作用。由表2 可知：XN-3 的抑菌率最高，為71.81%，故選擇XN-3 進(jìn)行下一步試驗。

表2 菌株XN-1～XN-8 測定抑菌率結(jié)果Tab.2 Results of XN-1-XN-8 antibacterial rate

2.2 形態(tài)學(xué)及生理生化特征

由圖1 可知：XN-3 單菌落呈白色，近圓形，表面半干燥，有隆起褶皺，顯微鏡下菌體呈桿狀，產(chǎn)橢圓形芽孢，革蘭氏顏色試驗呈陽性。通過生理生化試驗結(jié)果(表3)并結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[19]，將XN-3 鑒定為芽孢桿菌屬。

圖1 XN-3 在LB 培養(yǎng)基(a)和光學(xué)顯微鏡下(b)的形態(tài)特征Fig.1 The morphological characteristics of XN-3 in LB medium(a)and light microscope(b)

表3 細(xì)菌XN-3 生理生化特征Tab.3 The physiological and biochemical characteristics of XN-3

2.3 分子生物學(xué)鑒定

將16S rDNA 序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示菌株XN-3 與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)16S rDNA 序列的同源相似性最高，為99%。由圖2 可知：菌株XN-3 與解淀粉芽孢桿菌位于同一分支，結(jié)合菌體形態(tài)特征及生理生化鑒定結(jié)果，可確定XN-3 為解淀粉芽孢菌，將其核酸序列上傳至Genebank，獲取登錄號為：OK465112。

圖2 XN-3 的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 The 16S rDNA phylogenetic evolution tree of XN-3

2.4 抑菌作用

2.4.1 揮發(fā)性物質(zhì)對病原菌菌絲的影響

由圖3 可知：對照組菌絲生長狀態(tài)較好，菌絲較長，且氣生菌絲生長旺盛；處理組菌絲卷曲，長度變短，說明XN-3 能夠產(chǎn)生對病原菌菌絲生長有抑制作用的揮發(fā)性氣體。

圖3 對照組(a)和處理組(b)的菌絲形態(tài)比較Fig.3 Comparison of mycelium morphology of control group(a)and treatment group(b)

2.4.2 拮抗菌對病原菌菌絲的影響

由圖4 可知：對照組菌絲粗細(xì)均勻，表面光滑，有彈性，菌絲內(nèi)原生質(zhì)均勻分布，有少量孢子產(chǎn)生；處理組菌絲膨大、變彎變短，粗細(xì)不均勻，菌絲分節(jié)現(xiàn)象明顯，頂端出現(xiàn)不規(guī)則分支，分枝菌絲生長受阻，有厚垣孢子生成。

圖4 光學(xué)顯微鏡下對照組(a)和處理組(b)的菌絲形態(tài)比較Fig.4 Comparison of mycelium morphology of control group(a)and treatment group(b)under light microscope

由圖5 可知：在72 h 內(nèi)，處理組菌落直徑分別為10.06、21.00 和35.00 mm，均小于對照組，說明處理組菌絲生長初期受限，但并未完全失去生長能力；隨著菌絲生長，96 h 后對照組和處理組菌落直徑基本一致。

圖5 菌絲生長情況比較Fig.5 Comparison of mycelial growth

2.4.3 胞外物質(zhì)對病原菌及孢子萌發(fā)的影響

由表4 可知：無菌發(fā)酵液可對病原菌產(chǎn)生抑菌作用，抑菌圈直徑為18.23 mm，說明XN-3 胞外物質(zhì)對病原菌有抑制作用；同時，處理組孢子萌發(fā)率明顯降低，對照組孢子完全萌發(fā)時，處理組孢子萌發(fā)率僅為10.23%，說明XN-3 無菌發(fā)酵液對病原菌孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。

表4 XN-3 無菌發(fā)酵液對病原菌孢子萌發(fā)的影響Tab.4 Effect of XN-3 aseptic fermentation broth on spore germination of pathogenic bacteria

2.5 HPLC 分析結(jié)果

由圖6 可知：無菌發(fā)酵液共分離出2 個峰，保留時間分別為29.728(A-1)和35.858 min(A-2)；峰面積分別為116 444 和198 887。收集出峰成分進(jìn)行平板抑菌試驗，結(jié)果(圖7)顯示：峰A-2 中成分有抑菌圈出現(xiàn)，具有較明顯抑菌作用。

圖6 無菌發(fā)酵液HPLC 色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of sterile fermentation liquid

圖7 峰A-1(a)與峰A-2(b)成分的抑菌作用Fig.7 Fungicidal activity of the components of peak A-1(a)and peak A-2(b)

3 討論

尖孢鐮刀菌是土傳病原真菌，且分布廣泛，在設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中很難防治，現(xiàn)已成為植物病理中的第三大土傳病原真菌[6]，長期以來，過度的化學(xué)防治已造成嚴(yán)重的環(huán)境污染甚至影響人類健康，因此，應(yīng)用綠色生物防治技術(shù)，篩選尖孢鐮刀菌高效拮抗菌株、明顯其抑菌成分、探究其作用機理并研究其田間防治效果具有重要的理論和實踐意義。本研究以尖孢鐮刀菌引起的黃瓜枯萎病為靶標(biāo)進(jìn)行高效拮抗菌的篩選，得到1 株抑菌率高達(dá)71.81%的細(xì)菌菌株XN-3，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌，而解淀粉芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌具有明顯的抑菌作用，這與張美君等[20]的研究結(jié)論一致。此外，解淀粉芽孢桿菌是一種具有廣泛抑菌作用的生防菌，有研究發(fā)現(xiàn)其對橡膠樹褐根病菌(Phellinus noxius)、橡膠疫霉(Phytophthora heveae)、小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsis microspora)和尖孢炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)等多種病原真菌具有較好的抑菌效果[21]，因此，對XN-3 的研究具有更廣闊的應(yīng)用價值，這也是本研究的重要意義所在。

本研究表明：XN-3 能夠產(chǎn)生有抑菌作用的揮發(fā)性物質(zhì)。有研究顯示：解淀粉芽孢桿菌能夠產(chǎn)生抑制青霉菌的羥基丁酮以及2-癸酮等11 種揮發(fā)性有機物(VOCs)，這些有機物都可以有效抑制香蕉枯萎病菌菌絲生長及孢子萌發(fā)[22-23]。郝象瑢等[24]利用GC-MS 研究解淀粉芽孢桿菌LJ02 產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體對多種果類致病菌的作用，特別是對黑腐皮殼菌(Valsa mali)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)和棗漿胞病菌(Alternariaspp.)有顯著抑制效果，抑菌率均大于50%。本研究顯示：XN-3 可使病原菌菌絲卷曲，長度變短，顯微形態(tài)出現(xiàn)菌絲膨大和彎曲不均，分枝菌絲生長受阻，這些病原菌菌絲形態(tài)的變化可能是由于XN-3 產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)破壞了病原菌菌絲細(xì)胞；利用HPLC 分析技術(shù)，通過收集分離出的各峰組分，在峰A-2 中發(fā)現(xiàn)對尖孢鐮刀菌具有明顯抑菌作用的成分。權(quán)春善等[25]和王軍華等[26]研究發(fā)現(xiàn)：解淀粉芽孢桿菌對病原菌菌絲細(xì)胞有強烈的破壞作用；ARREBOLA 等[22]研究發(fā)現(xiàn)：解淀粉芽孢桿菌PPCB004 對青霉屬真菌的菌絲延伸有強烈的抑制作用，能抑制其生長速度；劉超等[27]研究發(fā)現(xiàn)：解淀粉芽孢桿菌BA-26 發(fā)酵液組分中的抗菌物質(zhì)對灰葡萄孢(Botrytis cinerea)孢子萌發(fā)抑制作用較強。這些研究均驗證了解淀粉芽孢桿菌的廣譜抑菌作用，同時也說明解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌成分是可被分離的，為微生物發(fā)酵生物農(nóng)藥的研發(fā)提供可能性，但在本研究中XN-3 抑菌物質(zhì)的含量、種類及具體的抑菌機理尚不明確，有待進(jìn)一步探索和研究。

本研究篩選出1 株抑菌率較高的解淀粉芽孢桿菌XN-3，可為今后植物病害綠色防治提供菌種種質(zhì)資源，通過對其抑菌作用的初探，為進(jìn)一步研究生防機制奠定基礎(chǔ)，為針對尖孢鐮刀菌引發(fā)的植物病害研發(fā)綠色生物農(nóng)藥提供依據(jù)和方向。

4 結(jié)論

本研究在設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤中分離篩選出8 株黃瓜枯萎病的高效拮抗菌菌株，其中，抑菌率最高的菌株XN-3 鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliticus)。XN-3 能夠產(chǎn)生有抑菌作用的揮發(fā)性物質(zhì)，能夠抑制病原菌菌絲生長，且胞外物質(zhì)能夠有效地抑制病原菌孢子萌發(fā)，其發(fā)酵液組分A-2 中有明顯抑菌作用的成分。