張 煦，李 捷 ，馮麗丹，何 靜，李永暉，孫 濤，張生懂

(1.甘肅農業(yè)大學 林學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070)

寧夏枸杞(Lycium bararum)作為西北地區(qū)特色農產品之一，在寧夏、青海及甘肅地方經濟中有重要地位，但是枸杞在栽培過程中病害問題非常嚴重，種植戶在種植過程中存在使用不安全農藥、超量使用農藥和違反農藥安全間隔期等問題，從而導致部分枸杞產品農藥殘留高于國家規(guī)定標準及歐盟標準[1-2]，嚴重制約枸杞產品生產，不利于西北地區(qū)經濟的長遠發(fā)展。

植物誘導抗性又稱植物免疫，是指植物經外界激發(fā)子刺激后，對病原菌侵染表現出明顯的防衛(wèi)反應。大量研究表明：植物抗病誘導劑(以下簡稱“誘抗劑”)的使用能顯著提高果蔬病害的防治效果，是一種很有前景的植物病害防治方法[3-5]。植株通過誘抗劑的刺激增強天然免疫力，提高其對病害的對抗作用，從而誘導植物自身產生抗病性[6-7]。乙酰水楊酸(acetylsalicylic acid，ASA)是水楊酸(salicylic acid，SA)的結構類似物，現已證實SA 能有效誘導多種植物產生系統(tǒng)獲得性抗性，ASA 也表現出類似的生物活性[8]；茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)作為一種與植物體損傷相關的信號分子，廣泛地存在于植物體中，外源應用MeJA 能夠激發(fā)植物防御基因的表達[9]，誘導植物的化學防御[10]；β-氨基丁酸(βaminobutyric acid，BABA)可通過特異性的BABA信號傳導通路啟動植物交聯(lián)應答機制，誘導植物的超敏反應，從而激發(fā)宿主對病原真菌的廣譜抗性[11]，在植物誘導抗病性領域具有應用潛力。

植物誘導抗性具有預防性、系統(tǒng)性、穩(wěn)定性、相對性和安全性等優(yōu)點，利用植物免疫系統(tǒng)防治病害，可從源頭上減少農藥對環(huán)境和農產品的污染，更符合當今農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。目前，枸杞誘導抗病性相關研究鮮有報道，葉面噴施誘抗劑提高枸杞抗病能力可為防治枸杞病害提供新思路。因此，本研究選取西北地區(qū)種植面積最廣的寧杞7 號為試驗材料，檢測分析不同誘抗劑對其生長、活性氧代謝途徑相關指標、細胞膜氧化程度和苯丙烷代謝途徑等指標的差異，為枸杞栽培管理及抗病機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況和試驗材料

試驗地點位于甘肅省古浪縣大靖鎮(zhèn)大墩村(N37°09′01″，E103°08′35″)，海拔1 930 m，屬溫帶大陸性氣候。試驗材料為6 年生、樹勢一致的寧杞7 號植株，正常修剪及水肥管理。

1.2 藥劑及配置方法

參考胡彥江等[12]的研究，將ASA(Cas 50-78-2，分析純)濃度設置為3 mmol/L；參考向妙蓮等[13]的研究，將MeJA(Cas 33924-52-2，分析純)濃度設置為0.3 mmol/L；參考王靜等[14]的研究，將BABA(Cas 541-48-0，分析純)質量濃度設置為1 mg/mL。以清水為溶劑配置對應藥劑，同時加入0.5%的吐溫-80 作為表面活性劑。對照組為0.5%的吐溫-80 水溶液。

1.3 試驗設計與取樣方法

試驗于2020 年實施。采用完全隨機區(qū)組設計，設置試驗株共120 株，每個處理10 株，3 次重復，隨機分布在試驗地塊中。每處理間設置1～2 株隔離株，地塊周邊設隔離行。采用1.2 節(jié)的3 種藥劑和對照水溶液于晴天無風時對試驗地內選定的寧杞7 號植株進行噴施處理，保證整株噴施且噴灑均勻。于5 月底枸杞初花期開始噴施，間隔7 d 噴施1 次，共噴施5 次，噴施藥劑量以均勻噴施整株葉片表面而不滴落為宜。具體噴施日期為5 月23 日、5 月30 日、6 月6 日、6 月14 日和6 月21 日。誘導處理前1個月內和處理過程中不噴施任何防病和防蟲害藥劑。

以1 次噴施后7 d 為1 個誘導周期，在第3次噴施后開始取樣，共取3 次，具體時間為6 月13 日、6 月20 日和6 月27 日，分別對應誘導3、4、5 次。測定樣品采用植株中上部完全展開發(fā)育充實的葉片，其中細胞膜相對透性、葉面積、葉片厚度和葉綠素含量測定樣品于采摘后立即測定，其余生理生化指標按照每份0.5 g、每處理準備25 份混合樣品，稱量和編號后立即液氮速凍，帶回實驗室測定。

1.4 測定指標及測定方法

1.4.1 自然發(fā)病率的測定

于最后1 次取樣時進行自然發(fā)病率調查，以枸杞葉斑病為病害調查對象，以葉片為單位，根據枸杞葉斑病發(fā)病程度進行分級調查。在每株樹同一水平面的東、西、南、北面以及中心各取1 個點，以此點為中心調查周圍的10 枚葉片，每株樹共調查50 枚葉片，逐片記錄病葉數和發(fā)病嚴重程度。病級劃分標準為：0 級：無病斑；1 級：病斑占葉片面積的1%～10%；2 級：病斑占葉片面積的11%～25%；3 級：病斑占葉片面積的26%～50%；4 級：病斑占葉片面積的51%以上。計算枸杞葉斑病病葉率、病情指數及相對防治效果：

發(fā)病率=(發(fā)病葉片總數/調查葉片總數)×100%；

病情指數=∑(各級病葉數×相對級數值)/(調查總葉數×最高級數值)；

相對防治效果=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數×100%。

1.4.2 葉片相關指標的測定

葉綠素含量的測定采用舒展等[15]的提取和測定方法。葉面積的測定采用照相后使用軟件Adobe Photoshop 2020 進行分析統(tǒng)計的方法，每個處理隨機選取1 株，采取枝條中部或中上部完全展開的成熟葉片，低溫保濕帶回拍照，所得圖片使用Adobe Photoshop 2020 處理計算得到葉面積。葉片厚度采用厚度測量儀測定，每處理隨機選取3 株進行測定，每株在東、西、南、北4 個方位隨機抽取1 個枝條，測定并記錄每枝條中部或中上部完全展開的成熟葉片5 片，每個葉片測定葉片中部兩側不包含主脈的邊緣厚度。

1.4.3 生理生化指標的測定

H2O2和含量的測定參照REN 等[16]的方法；POD 和SOD 活性的測定參照YUAN 等[17]的方法；PAL 活性的測定參照ASSIS 等[18]的方法；總酚和類黃酮含量的測定參照PIRIE 等[19]的方法；細胞膜相對透性與丙二醛(MDA)含量分別采用電導法和硫代巴比妥酸法測定[20]。

1.5 數據處理方法

用GraphPad Prism 8.0.2 軟件計算標準偏差并繪制圖表，采用IBM SPSS Statistics 26 軟件對數據進行單因素方差分析，采用Duncan’s 多重比較進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 誘抗劑對枸杞自然發(fā)病率的作用

由表1 可知：葉面噴施3 種誘抗劑處理的枸杞葉斑病發(fā)病率和病情指數以MeJA 處理最低，分別為3.06%和27.11，都顯著低于其他處理(P＜0.05)，其次是ASA 處理，BABA 處理的病情指數與對照無顯著差異；MeJA 處理相對于對照的防治效果為53.43%。這說明MeJA 相比其他處理更有利于降低枸杞葉斑病病葉率和病情指數。

表1 葉面噴施3 種誘抗劑對枸杞葉斑病的影響Tab.1 Effects of spraying three kinds of inducers on the leaf spot disease of Lycium barbarum

2.2 誘抗劑對枸杞葉片生長的影響

由圖1 可知：3 種誘抗劑均能提高枸杞葉面積，在3 次誘導后，處理過的枸杞葉面積與對照無顯著差異(P＞0.05)；4 次誘導后，MeJA 處理顯著高于對照和其他處理(P＜0.05)，比對照高16.62%；而5 次誘導全部結束后7 d，ASA、MeJA 和BABA 處理的葉面積分別提高56.20%、59.26%和36.11%。

圖1 葉面噴施3 種誘抗劑對枸杞葉面積的影響Fig.1 Effects of spraying three kinds of inducers on the leaf area of Lycium barbarum

由圖2 可知：3 種誘抗劑會降低枸杞葉厚度，其中MeJA 處理于3 次誘導后即顯著低于對照(P＜0.05)，較對照降低5.25%；在誘導4 次后7 d，ASA、MeJA 和BABA 等3 種誘抗劑處理均顯著低于對照(P＜0.05)，分別降低9.14%、8.49%和9.94%；在5 次誘導結束后，ASA 和BABA 處理的抑制效果減弱，分別比對照低8.19%和6.56%，而MeJA 處理的葉片厚度進一步降低達11.32%。

圖2 葉面噴施3 種誘抗劑對枸杞葉片厚度的影響Fig.2 Effects of spraying three kinds of inducers on the leaf thickness of L.barbarum

由圖3 可知：3 次誘導后，3 種誘抗劑處理的枸杞葉片葉綠素含量均顯著高于對照(P＜0.05)，但各處理之間無顯著差異(P＞0.05)，ASA、MeJA 和BABA 處理過的葉片葉綠素含量分別高于對照14.67%、13.33%和16.88%；誘導4 次后，ASA 和BABA 處理的葉片葉綠素含量顯著上升，分別高于對照32.05%和30.76%；5 次誘導結束后7 d，ASA 和MeJA 處理葉片的葉綠素含量低于BABA 處理而高于對照，此時BABA較對照高49.56%。

圖3 葉面噴施3 種誘抗劑對枸杞葉片葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of spraying three kinds of inducers on the chlorophyll content of L.barbarum

2.3 誘抗劑對枸杞葉片活性氧代謝的影響

由圖4 可知：3 次誘導后，ASA、MeJA 和BABA 處理的SOD 活性均顯著高于對照(P＜0.05)，其中MeJA 處理高于對照76.34%，ASA 和BABA分別比對照高65.85%和65.55%；ASA、MeJA和BABA 處理及對照的酶活在4 次誘導后均呈下降趨勢，并在誘導5 次后開始上升，BABA 處理的SOD 活性在5 次誘導后處于最高水平，高于對照72.56%。

由圖4 還可知：3 次誘導后，ASA 和BABA處理的H2O2含量分別顯著低于對照6.61%和16.45%(P＜0.05)，而MeJA 處理比對照高3.24%；4 次誘導后，3 種誘抗劑處理的H2O2含量均顯著高于對照(P＜0.05)，其中MeJA 處理的H2O2含量為304.97 μg/g，比對照高25.38%，ASA 和BABA處理分別高于對照8.55%和9.54%；誘導5 次后，BABA 處理的H2O2含量急劇升高，顯著高于其他處理與對照(P＜0.05)，與對照相比高31.01%。

圖4 葉面噴施3 種誘抗劑對枸杞葉片活性氧代謝的影響Fig.4 Effects of spraying three kinds of inducers on the active oxygen metabolism of L.barbarum

由圖4 可知：ASA、MeJA 和BABA 誘導處理均可提高枸杞葉片中的POD 活性，但峰值出現時間有所不同。ASA 和MeJA 處理的POD 峰值在3 次誘導后，分別較對照高54.72%和20.38%；BABA 處理的峰值出現在5 次誘導后，比對照高72.34%，其峰值的出現雖晚于其他處理，但高于其他處理。

2.4 誘抗劑對枸杞細胞膜氧化程度的影響

由圖5 可知：3 次誘導后，3 種誘抗劑均降低了枸杞葉片細胞膜透性，其中ASA 處理葉片的細胞膜相對透性雖低于對照，但仍高于其他處理，且在此之后與對照無顯著差異(P＞0.05)；3 次誘導后，MeJA處理的細胞膜相對透性低于對照和ASA 處理，但高于BABA 處理，在總趨勢上升的情況下，上升幅度較低，總體基本穩(wěn)定；BABA 處理的細胞膜相對透性在第3 次施藥后有上升趨勢，但一直處于最低水平，最低水平比對照低48.21%。由圖5 還可知：3 種誘抗劑處理的MDA 含量均顯著低于對照(P＜0.05)。在3、4 次誘導后各誘抗劑之間無顯著差異；5 次誘導后，MeJA 和BABA 處理顯著低于ASA 處理(P＜0.05)。

圖5 葉面噴施3 種誘抗劑對枸杞葉片細胞膜氧化程度的影響Fig.5 Effects of spraying three kinds of inducers on the cell membrane oxidation of L.barbarum

2.5 誘抗劑對枸杞葉片苯丙烷代謝的影響

由圖6 可知：葉面噴施3 種誘抗劑均可顯著提高枸杞葉片的PAL 活性(P＜0.05)。誘導3、4次后，MeJA 處理的PAL 活性最高，而誘導5 次后BABA 處理達到最佳，其中MeJA 誘導3 次后的PAL 活性達到峰值。ASA 處理對PAL 活性的提高能力低于其他2 個處理，其峰值出現亦在3次誘導后。3 次誘導后，ASA 和MeJA 處理分別比對照高10.84%和38.28%。BABA 處理的PAL活性在3 次誘導時便有所提高，5 次誘導后達到峰值，此時較對照高41.76%。

3 種誘抗劑對總酚與類黃酮含量的影響基本一致(圖6)。MeJA 處理的總酚和類黃酮含量在3、4 次誘導后均處于最高值，且顯著高于對照(P＜0.05)；在5 次誘導后，BABA 處理的總酚與類黃酮含量高于其他處理和對照，分別比對照高48.32%和53.39%。MeJA 處理的總酚含量在誘導3 次后達到峰值，比對照高29.14%，4 次誘導后有所下降，但仍比對照高21.25%，5 次誘導后與對照無顯著差異(P＞0.05)。

圖6 葉面噴施3 種誘抗劑對枸杞葉片苯丙烷代謝的影響Fig.6 Effects of spraying three kinds of inducers on the phenylpropane metabolism of L.barbarum

3 討論

大量研究表明：外源施用誘抗劑可增加植株抗病能力，降低其自然發(fā)病率和病情指數[13-14]。在本研究中，噴施MeJA 能顯著降低枸杞葉斑病的發(fā)病率和病情指數，說明其能有效誘導枸杞產生抗病性。在生理生化指標的測定中發(fā)現：MeJA處理的活性氧代謝與苯丙烷途徑相關指標均有一定變化，即MeJA 可能是通過激活活性氧代謝與苯丙烷途徑從而使枸杞產生抗病性。BABA 處理的發(fā)病率高于對照而病情指數與對照無顯著差異，是由于BABA 處理有更小的病斑面積，說明BABA 處理在葉斑病侵染前期尚未誘導枸杞葉片產生抗病性，甚至有負面效果使病原物更易侵染，在試驗后期有效抑制了病斑擴張。

本研究發(fā)現：3 種誘抗劑均可提高枸杞葉面積、增加葉綠素含量，這是由于3 種誘抗劑具有多種生物功能，不僅能誘導植物提高對病原菌的抗性，也可以激發(fā)植物體內代謝調控過程，促進植物生長[21]。ASA 能通過調節(jié)植物活性氧(ROS)積累以促進細胞分裂，提高植物生物量[22]；外源MeJA 能提高植物體內源茉莉酸含量，調節(jié)植物碳水化合物積累，從而調節(jié)植物生長[23]；BABA可調節(jié)植物生理代謝，促進根系生長，進而促進植物地上部生長[24]。相關研究表明：葉面噴施100 mg/L ASA 可提高鷹嘴豆(Cicer arietinumL.)葉面積和葉綠素含量[25]；施用3 mmol/L ASA 可顯著提高菜豆(Phaseolus vulgarisL.)葉片光合色素及地上部生物量[26]；葉面噴施2.5 μmol/L 外源MeJA 能提高Cd 脅迫下番茄(Solanum lycopersicumL.)幼苗的生物量[27]。本研究中，葉面噴施ASA、MeJA 和BABA 可提高枸杞葉面積和葉綠素含量，即能有效增加枸杞葉片光合能力。本研究還發(fā)現：誘抗劑的使用會減小葉片厚度，也有研究表明一些植物會采取增加葉片面積、降低葉片厚度的策略以提高光利用率[28]。光利用率的提升有利于產量的形成，但是這種生存策略會加劇葉片蒸騰作用，在種植地灌溉水源充沛的情況下有利于增產增收，但缺水條件下可能有負面影響。誘抗劑的使用能通過增強枸杞葉片細胞抗氧化能力改善其細胞穩(wěn)定性。植物細胞抗氧化能力與細胞膜保護能力呈正相關[29]。病原物侵染植物時往往會使植物產生大量ROS，ROS 對病原物有抑制作用或殺傷力[30]，且過量的ROS 會造成植物氧化損傷。植物體內的SOD 可催化轉化為H2O2和O2，POD 可催化分解H2O2以維持植物體內ROS 平衡[31]。有研究顯示：外源施加植物免疫誘抗劑可激活植物活性氧代謝途徑以提高其抗病能力。噴施2.5 mmol/L MeJA 可提高紫花地丁(Viola philippica)葉片的CAT、POD 和SOD 活性，減少MDA 含量[32]；葉面噴施2.5 μmol/L MeJA可提高番茄抗氧化酶活性，減輕氧化損傷[27]；噴施500 mg/L BABA 可提高番茄幼苗CAT 和POD活性，增強抗番茄白粉病的能力[33]。本研究表明：3 種誘抗劑提高枸杞葉片中活性氧含量的同時可提高抗氧化酶活性，且降低MDA 含量和細胞膜透性。其中，MeJA 誘導3 次后可顯著提高枸杞葉片SOD 活性，降低含量，提高H2O2含量，同時POD 活性顯著提升，并且抑制細胞的氧化損傷，說明MeJA 誘導3 次后激活了枸杞活性氧代謝途徑，可增強其自身抗病能力，與自然發(fā)病率和病情指數結果一致。

3 種誘抗劑提高了枸杞葉片PAL 活性，其總酚與類黃酮的積累均與之對應上升。PAL 是植物體內主要的抗性酶之一，其活性可代表植物的抗性高低，現已證明MeJA 可通過調節(jié)植物PAL 相關基因表達量來提高PAL 活性及苯丙烷代謝產物[34]。有研究顯示：200 μmol/L MeJA 處理可極顯著(P＜0.01)上調莧菜(Amaranthus tricolorL.)PAL、F3H、CHI和CHS基因表達量，提高類黃酮含量[8]；煙草(Nicotiana tabacumL.)幼苗噴施2 mmol/L SA 可顯著提高其PAL 活性，有效抑制煙草花葉病毒(TMV)[35]；5 g/L BABA浸泡巴西香蕉(Musa.AAA Group cv.Brazil)可提高PAL 活性和MaPAL1基因表達量，提高其抗病性[36]。MeJA 處理在3 次誘導后PAL 活性即達到峰值，說明MeJA可以較快地誘導枸杞產生抗性。植物體內總酚和類黃酮含量的積累與植物的耐逆性有關。PAL 催化L-苯丙氨酸形成肉桂酸是苯丙烷代謝的起點，總酚和類黃酮是苯丙烷代謝的下游分支產物[37]，總酚和類黃酮含量與PAL 活性正相關。酚類和黃酮類化合物是一種強大的抗氧化劑，它們在清除自由基和對抗氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用[25]。本研究中，3 種誘抗劑在一定程度上增加了枸杞總酚與類黃酮的積累，其中MeJA 處理的總酚與類黃酮含量在3、4 次誘導時均為最高，BABA處理在5 次誘導后處于最高。

枸杞對不同誘抗劑誘導次數的響應有差異。相關研究表明：誘導抗病效果與誘導次數呈正相關[38-39]，而本研究中相關指標的測定發(fā)現：ASA與MeJA 處理的SOD、POD 和PAL 活性以及總酚和類黃酮含量在3 次誘導后達到峰值，持續(xù)誘導并無疊加效應。BABA 的誘導效果在5 次誘導中均呈現遞增現象，在5 次誘導后達到最佳誘導效果。3 種誘抗劑在最佳誘導次數下均可提高SOD、POD 和PAL 活性，增加總酚和類黃酮含量。綜上所述，MeJA 較BABA 可更快誘導枸杞產生抗病性，且效果優(yōu)于ASA。因此，MeJA 在枸杞生產中的意義更為重要。

4 結論

葉面噴施乙酰水楊酸、茉莉酸甲酯和β-氨基丁酸可提高寧杞7 號葉綠素含量及葉面積，減小葉片厚度；3 種誘抗劑可激發(fā)枸杞葉片產生活性氧，同時可以提高抗氧化酶活性，并保護細胞膜完整性，提高苯丙氨酸解氨酶活性與總酚和類黃酮的積累，提高抗病性。葉面噴施0.3 mmol/L茉莉酸甲酯誘導3 次可顯著降低寧杞7 號葉斑病的自然發(fā)病率和病情指數；乙酰水楊酸和茉莉酸甲酯誘導3 次后達到最佳誘導效果，且茉莉酸甲酯誘導效果優(yōu)于乙酰水楊酸，β-氨基丁酸在誘導5 次后達到最佳誘導效果。