申云鑫，沈廣材，包玲鳳，濮永瑜，張 慶，周旭東，尹興盛，張榮琴，陳齊斌，何永宏，楊佩文

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205；3.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000)

【研究意義】煙草青枯病是由茄科青枯菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種毀滅性病害，病害的發(fā)生發(fā)展與土壤微生物相互作用的變化以及微生物群落失衡密切相關(guān)。近年來，隨著連作年限的增加，化肥和化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，導(dǎo)致煙草青枯病流行和蔓延的速度加快，嚴(yán)重田塊發(fā)病率達(dá)100%，已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。土壤微生物群落具有能通過復(fù)雜的相互作用抑制土傳疾病的能力，通過人為調(diào)控土壤微生物群落，建立免疫型根際土壤微生態(tài)環(huán)境防控?zé)煵萸嗫莶∫殉蔀殛P(guān)注的焦點(diǎn)[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】作物根莖類病害的爆發(fā)與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性密切相關(guān)，充分利用微生物群落結(jié)構(gòu)和微生物功能多樣性是實(shí)現(xiàn)作物根莖類病害持續(xù)有效綠色防控的有效措施[3]。相關(guān)研究表明，具有高微生物群落多樣性的根際土壤可降低煙草青枯病暴發(fā)的幾率[4]。具有較高多樣性的根際土壤往往比微生物群落單一的根際土壤更不容易受到病原菌的入侵[5]。微生物群落多樣性高、微生物食物網(wǎng)多樣化等特點(diǎn)是構(gòu)建健康的土壤的關(guān)鍵，土壤中的有益微生物類群可通過捕食、競爭和寄生等多種方式將病原菌相對豐度控制在較低的水平之下[6]。土壤微生物類群在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用時(shí)，它們能促進(jìn)復(fù)雜、模塊化的微生物群落網(wǎng)絡(luò)的形成，從而使土壤具有抑制病原菌的作用，具有類似“健康”分支微生物群落結(jié)構(gòu)的土壤可能抑制根莖類病害的爆發(fā)[7]。土壤中有些微生物種群具有分泌抗生素或抗菌蛋白的能力，對植物病原菌表現(xiàn)出廣泛的生物效應(yīng)，并應(yīng)用于控制多種作物病害；土壤有些細(xì)菌種群在作物根系的微生態(tài)環(huán)境中對物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)化起重要作用，還與病原菌競爭養(yǎng)分，產(chǎn)生抗生素和胞外酶；許多放線菌顯示出防控作物病害能力；土壤微生物群落能通過與病原菌爭奪營養(yǎng)、抑制病原菌或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抵抗病原菌的化合物從而減少病原菌的入侵[8-10]。土壤微生物群落與病原菌之間存在著明顯的生態(tài)效應(yīng)，對病原菌的抑制在一定程度上是土壤微生物的群體作用；土壤中的有益微生物類群與病原菌競爭時(shí)可以產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，或者完全占據(jù)根際土壤有限的生長空間和物質(zhì)，從而有效抑制病原菌的生長，抑制病害爆發(fā)[11-12]。【本研究切入點(diǎn)】煙草青枯病的發(fā)生發(fā)展可能與土壤微生物物種組成、豐度和功能變化相關(guān)，通過分析健康煙株和患病煙株根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)組成和多樣性，明確具有差異性的細(xì)菌種群，為煙草青枯病的生物防控提供菌種資源。本研究擬分別采集云南省保山市2個(gè)堿性土壤縣(區(qū))的患病與健康煙株根際土壤，采用稀釋涂布平板法獲得可培養(yǎng)細(xì)菌種群，基于Illumina MiSeq高通量測序，解析健康煙株和患病煙株根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)組成和多樣性特征。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過研究可培養(yǎng)細(xì)菌種群變化與煙草青枯病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，為利用土壤微生物群落多樣性防控?zé)煵萸嗫莶√峁?shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

采樣地點(diǎn)位于保山市隆陽區(qū)和施甸縣，每個(gè)縣(區(qū))選擇5個(gè)鄉(xiāng)(鎮(zhèn))，每個(gè)鄉(xiāng)(鎮(zhèn))選擇3個(gè)村，共30個(gè)樣點(diǎn)。每個(gè)樣點(diǎn)選擇煙草青枯病典型發(fā)病地塊，分別采集5株典型患病煙株和5株健康煙株的根際土壤樣品，并混合為1個(gè)土壤樣品。每個(gè)土壤樣品分為2部分，一部分土樣置于50 mL 的無菌管里，帶回實(shí)驗(yàn)室做土壤細(xì)菌種群培養(yǎng)；另一部分土樣過40 目篩后放入自封袋中，做好標(biāo)記，待自然風(fēng)干后于實(shí)驗(yàn)室土壤理化性質(zhì)分析測定。

1.2 土壤樣品主要理化性質(zhì)測定

分析測定土壤樣品主要理化性質(zhì)，包括pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、水解性氮、有效磷、速效鉀、交換性鈣、交換性鎂、有效銅、有效鋅等有效硼指標(biāo)，測定方法參照魯如坤[13]的方法。

1.3 土壤樣品細(xì)菌種群分離培養(yǎng)

1.3.1 供試培養(yǎng)基 細(xì)菌的培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基，具體為牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15～20 g，加蒸餾水至1000 mL，調(diào)pH至7.0～7.2，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3.2 培養(yǎng)方法 每個(gè)土壤樣品取2 g置于198 mL無菌水中(500 mL錐形瓶加玻璃珠)，搖床25 ℃震蕩培養(yǎng)(180 r/min)1 h左右，靜置2～3 min，取上清液梯度稀釋至10-3、10-4、10-5，每個(gè)濃度3次重復(fù)，充分搖勻后吸取0.2 mL均勻涂布于NA平板上，然后倒置于恒溫箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)5～10 d。待其菌落數(shù)量不再增加，每個(gè)平板用無菌水5 mL洗脫菌落，同一樣本的9個(gè)平板洗脫至同一個(gè)無菌離心管中。最后再將隆陽區(qū)的15個(gè)患病煙株根際土壤樣品以等體積混合為1個(gè)樣品(LY.B)，15個(gè)健康煙株根際土壤樣品以等體積混合為1個(gè)樣品(LY.J)；施甸縣的15個(gè)患病煙株根際土壤樣品以等體積混合為1個(gè)樣品(SD.B)，15個(gè)健康煙株根際土壤樣品以等體積混合為1個(gè)樣品(SD.J)。

1.4 土壤樣品細(xì)菌種群Illumina MiSeq高通量測序

采用試劑盒進(jìn)行樣品DNA抽提，并利用 Thermo Nano Drop One 檢測純度和濃度，使用帶 barcode 的特異引物及TaKaRa Premix Taq-Version 2.0(TaKaRa Biotechnology Co.，Dalian，China)對V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的片段長度和濃度，按照 NEB Next?UltraTMII DNA Library Prep Kit for Illumina?(New England Bio labs，USA)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行建庫操作，使用 Illumina Nova 6000 平臺對構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫進(jìn)行 PE250 測序[14]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用UPARSE聚類方式，基于97%的序列相似度進(jìn)行OTU歸并和劃分得到OUT表，基于OTU豐度表，進(jìn)行α多樣性指數(shù)以及群落組成分析，以上均在廣東美格基因科技有限公司云平臺(美格云平臺,magigene.com)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品主要理化性質(zhì)分析

如表1所示，各樣品pH為6.54～7.48，有機(jī)質(zhì)22.63～24.67 g/kg，全氮1.40～1.57 g/kg，全磷1.10～1.39 g/kg，全鉀13.56～19.50 g/kg，水解性氮90.91～139.62 mg/kg，交換性鈣17.35～25.82 cmol/kg，交換性鎂4.97～10.66 cmol/kg，有效銅2.13～2.73 mg/kg，有效鐵9.73～30.23 mg/kg，有效錳10.35～33.77 mg/kg，患病和健康土壤中具有顯著差異性(P<0.05)；有效磷43.21～80.00 mg/kg，速效鉀441.17～499.44 g/kg，有效鋅3.85～4.68 mg/kg，有效硼0.39～1.43 mg/kg，其在病土中的含量高于健康土，且速效鉀在患病和健康土壤中具有顯著差異性(P<0.05)。

表1 土壤理化指標(biāo)分析

2.2 煙株根際土壤細(xì)菌種群α多樣性分析

在對原始序列文庫進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)后，利用熱測序技術(shù)對細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行檢測。12個(gè)土壤樣品，均一化每樣本79 629條高質(zhì)量細(xì)菌序列，聚為2668個(gè)不同的細(xì)菌操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTUs)。SD.J與SD.B所含OUT數(shù)分別為690、725個(gè)，共有的OT有456個(gè)，LY.J與LY.B樣品分別有OUT數(shù)573、683個(gè)，共有的OUT 361條(圖1)。原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接，并按97%的序列相似性進(jìn)行劃分，LY.B共有OUT 684個(gè)，隸屬于6個(gè)門，10個(gè)綱，34個(gè)目，58個(gè)科，128個(gè)屬和49個(gè)種。LY.J共有OUT 569個(gè)，隸屬于6個(gè)門，11個(gè)綱，32個(gè)目，58個(gè)科，125個(gè)屬和47個(gè)種。SD.B共有OUT 691個(gè)，隸屬于7個(gè)門，11個(gè)綱，33個(gè)目，57個(gè)科，115個(gè)屬和47個(gè)種。SD.J共有OUT 724個(gè)，隸屬于8個(gè)門，12個(gè)綱，36個(gè)目，69個(gè)科，1325個(gè)屬和54個(gè)種；α多樣性指數(shù)結(jié)果均無顯著差異(圖2)。

圖1 共有及特有OTU venn圖

圖2 α多樣性指數(shù)柱狀圖

2.3 煙株根際土壤細(xì)菌種群門和綱分類水平組成分析

在門分類水平上，層次聚類分析表明各采樣地的細(xì)菌群落組成相似(圖3)，根據(jù)物種注釋結(jié)果，可培養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)勢門有4大類(圖4)，按比例大小依次為變形菌門(Proteobacteria，54.97%～71.47%)、厚壁菌門(Firmicutes，11.19%～37.69%)、放線菌門(Actinobacteria, 2.79%～21.09%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，1.88%～16.73%)，占總原核微生物群落的99.55%～99.83%。相對于健康煙株根際土壤，患病煙株根際土壤中Proteobacteria的相對豐度提高9.30%～22.63%，Bacteroidetes的相對豐度提高5.17%～57.73%；而Firmicutes的相對豐度降低5.39%～39.93%，放線菌門的相對豐度降低30.35%～41.04%。

圖3 門分類水平UPGMA聚類樹

圖4 門分類水平可培養(yǎng)細(xì)菌種群組成

在綱的分類水平上，層次聚類分析表明各采樣地的細(xì)菌群落組成相似(圖5)，根據(jù)物種注釋結(jié)果，檢測到的可培養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)勢綱有4大類(圖6)，按比例大小依次為γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria54.74%～71.38%)、桿菌綱(Bacilli，11.36%～39.95%)、放線菌綱(Actinobacteria, 2.78%～30.38%)和擬桿菌綱(Bacteroidia，1.88%～5.17%)，占總原核微生物群落的99.46%～99.71%；與健康煙株根際土壤相比，患病煙株根際土壤中Gammaproteobacteria的相對豐度提高9.25%～22.79%，Bacteroidia的相對豐度提高5.17%～57.73%；Bacilli的相對豐度降低5.07%～39.95%，Actinobacteria的相對豐度降低30.38%～41.02%。

圖5 綱分類水平UPGMA聚類樹

圖6 綱分類水平可培養(yǎng)細(xì)菌種群組成

2.4 煙株根際土壤細(xì)菌種群屬分類水平組成分析

在屬分類水平顯示出相對豐度大于1%的屬，如圖7所示，可培養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)勢屬為假單胞菌屬(Pseudomonas，7.12%～32.71%)、無色桿菌屬(Achromobacter，0.71%～25.77%)、賴氨酸芽胞桿菌屬Lysinibacillus，1.08%～10.88%)、假節(jié)桿菌屬(Pseudarthrobacter，2.10%～18.35%)、劍菌屬(Ensifer，0.94%～7.76%)、土壤芽孢桿菌屬(Solibacillus，1.18%～3.14%)。與健康煙株根際土壤相比，患病煙株根際土壤Pseudomonas、Achromobacter和Ensifer的相對豐度提高了15.60%～226.10%、71.30%～75.99%和13.98%～191.30%；Pseudarthrobacter、Lysinibacillus和Solibacillus的相對豐度降低了20.87%～45.59%、15.63%～90.10%和5.63%～16.20%。

圖7 屬分類水平上的可培養(yǎng)細(xì)菌種群豐度聚類熱圖

基于LEfSe分析，查找各水平上具有顯著差異的細(xì)菌種群(P<0.05)，如圖8所示，健康煙株根際土壤中差異顯著的細(xì)菌種群為鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、假諾卡氏菌目(Pseudonocardiales)和假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)；患病煙株根際土壤中差異顯著的細(xì)菌種群為Chitinophaga_sp__MHS12、Azospirillaceae、Azospirillum和Flavitalea。

圖8 基于 LEfSe 分析的細(xì)菌群落組間差異分析

2.5 煙株根際土壤微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性

土壤細(xì)菌優(yōu)勢門與土壤理化性狀相關(guān)性分析結(jié)果表明(表2)，Proteobacteria與有效磷、速效鉀、有效硼含量呈顯著正相關(guān)，F(xiàn)irmicutes與pH、全鉀含量呈顯著正相關(guān)，與全磷、有效磷、速效鉀、有效錳、有效硼含量呈顯著負(fù)相關(guān)，Actinobacteria與pH、全鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與有效錳、有效硼含量呈顯著正相關(guān)。

表2 優(yōu)勢門豐度與土壤理化因子之間的相關(guān)性

3 討 論

3.1 根莖類病害患病土壤主要理化性質(zhì)特征

土壤環(huán)境因子是影響作物根莖類病害發(fā)發(fā)展生的重要因素，病原菌侵染顯著受到土壤理化性質(zhì)、溫濕度等非生物因素和生物因素的制約，土壤理化因子是影響土壤微生物區(qū)系的重要因素，土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成與變化在很大程度上與土壤理化性質(zhì)的變化相關(guān)[15]。土壤pH通過作用于病原菌影響其侵染過程，同時(shí)影響其他微生物種群的生長繁殖而調(diào)節(jié)其群落結(jié)構(gòu)，而且通過影響土壤的速效養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化而影響病原菌和其他微生物的群落結(jié)構(gòu)[16]；土壤有機(jī)質(zhì)、大量元素和中微量元素等養(yǎng)分指標(biāo)的含量在很大程度上也影響著作物健康植株和患病植株根際微生物的塑造過程[17]。本研究中，由于健康煙株和患病煙株根際土壤采集自同一煙地，施肥管理水平一致，可能導(dǎo)致土壤中pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、水解性氮、有效磷、交換性鈣、交換性鎂、有效銅、有效鋅和有效硼等養(yǎng)分指標(biāo)含量差異性不顯著，但速效鉀含量在患病和健康土壤中具有顯著差異性，其含量對煙草青枯病的發(fā)生發(fā)展的影響需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

3.2 土壤微生物多樣性特征與根莖類病害防控機(jī)制

作為作物根莖類病害生物防治的貢獻(xiàn)者，土壤中真菌、細(xì)菌及放線菌中的有益類群通過拮抗作用抑制或直接殺死病原菌的菌絲及孢子，從而降低作為根莖類病害的發(fā)生發(fā)展，土壤中含有更加豐富、均勻、多樣性高的有益微生物群落結(jié)構(gòu)，對作物根莖類病害就具有更強(qiáng)的綜合防治能力[18-19]。細(xì)菌在植物根系的微生態(tài)環(huán)境中，不但對物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)化起重要作用，還與病原菌競爭養(yǎng)分，產(chǎn)生抗生素和胞外酶[20-21]。放線菌在其生長過程中分泌的抗生素可以抑制其他有害病原微生物的生長。土壤中含有更大比例的有益真菌類群，有助于土壤生態(tài)系統(tǒng)更加穩(wěn)定，增強(qiáng)土壤抑制土傳病原菌的能力[22]。由于特定的土壤生態(tài)環(huán)境具有特定的微生物群落結(jié)構(gòu)，不同地域的土壤具有不同的微生物種群和群落結(jié)構(gòu)，病原菌入侵不同作物和不同病害引起群落結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果不同[23]。

患病與健康土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間的差異可能是影響煙草青枯病發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素。通過對比健康植株和患病植株土壤根際微生物有顯著差異的種群，從而尋找到有效的與土壤抑病或感病相關(guān)的微生物種群。本研究結(jié)果表明，與健康煙株相比，在門分類水平上，患病煙株根際Proteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度提高，F(xiàn)irmicutes和Actinobacteria的相對豐度降低；在綱分類水平上，Gammaproteobacteria和Bacteroidia的相對豐度提高；Bacilli和Actinobacteria的相對豐度降低；在屬的分類水平上，Pseudomonas、Achromobacter和Ensifer的相對豐度提高；Pseudarthrobacter、Lysinibacillus和Solibacillus的相對豐度降低。

健康煙株根際與患病煙株根際富集存在顯著差異的細(xì)菌種群，該物種數(shù)發(fā)生變化可能是導(dǎo)致病害發(fā)生的重要因素。Sphingomonadales、Sphingomonadaceae、Phenylobacterium、Pseudonocardiales和Pseudonocardiaceae是健康煙株根際土壤中富集的細(xì)菌種群，而Chitinophaga_sp__MHS12、Azospirillaceae、Azospirillum和Flavitalea則是患病煙株根際土壤中富集的細(xì)菌種群。健康土壤中豐度顯著增加的Sphingomonadales、Sphingomonadaceae、Phenylobacterium、Pseudonocardiales和Pseudonocardiaceae等種群具有促進(jìn)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化吸收和分泌糖肽類抗生素的生物學(xué)功能；患病土壤中豐度顯著增加的Chitinophaga_sp_MHS12、Azospirillaceae、Azospirillum和Flavitalea等種群具有促進(jìn)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化吸收和分泌糖肽類抗生素的生物學(xué)功能[24]；分解幾丁質(zhì)、葡萄糖、果糖、麥芽糖及甘露醇等生物學(xué)功能，可能與煙草植株受到青枯病菌侵染后在其根際募集大量微生物來抵御原病菌侵染有關(guān)[25-26]；但這些有差異的種群能否指導(dǎo)青枯病的發(fā)生檢測和生物防控調(diào)控還須進(jìn)行深入、全面地研究和驗(yàn)證。通過從健康煙株根際土壤中分離和篩選與抗病相關(guān)的微生物種群，可為煙草青枯病生物防治提供微生物資源支持。

健康土壤微生物多樣性高，物種之間的物質(zhì)交換和轉(zhuǎn)化途徑多樣化，從而維持生態(tài)平衡；利用健康土壤中豐度較高的優(yōu)勢種群抑制病原微生物的生長，實(shí)現(xiàn)病害防控。本研究只是對健株和感染青枯病煙草株根際可培養(yǎng)細(xì)菌種群多樣性及組成進(jìn)行了初步比較分析，在后續(xù)研究中，將對可培養(yǎng)真菌種群多樣性及組成開展研究，以進(jìn)一步揭示煙草青枯病害發(fā)生發(fā)展與微生物區(qū)系之間的關(guān)系。

4 結(jié) 論

健康煙株和患病煙株根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的OUT數(shù)量和α多樣性指數(shù)間差異性不顯著。與健康煙株相比，在門分類水平上，患病煙株根際Proteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度提高，F(xiàn)irmicutes和Actinobacteria的相對豐度降低；在綱分類水平上，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和擬桿菌綱(Bacteroidia)的相對豐度提高；桿菌綱(Bacilli)和放線菌綱(Actinobacteria)的相對豐度降低；在屬的分類水平上，假單胞菌屬(Pseudomonas)、無色桿菌屬(Achromobacter)和劍菌屬(Ensifer)的相對豐度提高；假節(jié)桿菌屬(Pseudarthrobacter)、賴氨酸芽胞桿菌屬(Lysinibacillus)和土壤芽孢桿菌屬(Solibacillus)的相對豐度降低。鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、假諾卡氏菌目(Pseudonocardiales)和假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)是健康煙株根際土壤中富集的細(xì)菌種群，而Chitinophaga_sp__MHS12、Azospirillaceae、Azospirillum和Flavitalea則是患病煙株根際土壤中富集的細(xì)菌種群。健康與患病植煙土壤煙株根際可培養(yǎng)細(xì)菌群落呈分化趨勢，煙草青枯病的發(fā)生發(fā)展可能與煙株根際細(xì)菌種群豐度變化有關(guān)，通過調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)可實(shí)現(xiàn)作物根莖類病害持續(xù)有效綠色防控。