王佰濤, 楊文玲, 雷 高, 李珊珊, 劉德海

(河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司, 鄭州 450008)

【研究意義】魔芋(Amorphophalluskonjac, K.Koch)，別名蛇玉米、鬼芋，屬南天星科魔芋屬，產(chǎn)地主要在中國(guó)、日本等東南亞國(guó)家[1]。作為世界衛(wèi)生組織公布的“十大保健食品”之一，魔芋本身營(yíng)養(yǎng)豐富，其作為一些地區(qū)的重要食物來(lái)源種植歷史悠久，當(dāng)前在食品、醫(yī)療、畜牧等領(lǐng)域應(yīng)用較多[2-4]。魔芋種植過(guò)程中對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高，不僅需要合適的海拔和濕度，魔芋根際微生物平衡對(duì)魔芋的生長(zhǎng)也非常重要，當(dāng)魔芋根際微生物失衡時(shí)更易導(dǎo)致病害的發(fā)生[5-6]，目前對(duì)魔芋根際土壤細(xì)菌多樣性研究較多，而對(duì)真菌群落多樣性研究較少。因此，了解魔芋根際真菌群落多樣性不僅有利于了解魔芋的生長(zhǎng)情況和病害情況，還能促進(jìn)魔芋行業(yè)的發(fā)展[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】魔芋的主要成分是葡甘露聚糖(Konjac Glucomannan, KGM)[8]，葡甘露聚糖主要是降解成為葡甘露低聚糖進(jìn)行應(yīng)用[9]。目前存在一些物理化學(xué)方法[10]，但生物方法利用微生物發(fā)酵降解，具有綠色、高效等優(yōu)勢(shì)好[11-14]，分析根際土壤真菌群落多樣性有助于尋找相關(guān)微生物，而目前關(guān)于魔芋根際土壤細(xì)菌多樣性分析的研究?jī)?nèi)容較多[15]，對(duì)魔芋根際土壤真菌群落研究?jī)?nèi)容較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】魔芋根際真菌群落的生態(tài)功能對(duì)于魔芋生長(zhǎng)非常重要，其不僅能夠促進(jìn)魔芋生長(zhǎng)，還具備降解農(nóng)藥及重金屬污染、防治病害等功能[16-17]。微生物測(cè)序技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，其快速、高效、精確的特點(diǎn)在微生物多樣性分析中應(yīng)用廣泛[18]。如圖1所示，本研究通過(guò)從不同地區(qū)采集魔芋根際土壤樣品，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序?qū)δв蟾H土壤真菌群落進(jìn)行了多樣性分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)不同地區(qū)的根際土壤真菌多樣性進(jìn)行了對(duì)比，詳細(xì)分析了不同地區(qū)真菌群落在門、綱、屬不同水平的優(yōu)勢(shì)菌屬和豐度高低，以期為魔芋的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供幫助，為實(shí)現(xiàn)高效制備葡甘露低聚糖奠定基礎(chǔ)。

圖1 魔芋根際土壤真菌群落多樣性分析流程

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)樣品地點(diǎn)為3處(表1)。在每個(gè)取樣地分別隨機(jī)選擇3株魔芋進(jìn)行取樣，取樣時(shí)，除去表層土壤，在0～20 cm深度范圍內(nèi)采集魔芋根際土壤。將采集的魔芋根際土壤樣品快速保存至低溫保藏箱中，無(wú)菌條件研磨后用于實(shí)驗(yàn)。

表1 采樣信息統(tǒng)計(jì)

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置3組樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別是昆明樣品(A)：A1、A2、A3；南平樣品(B)：B1、B2、B3；南陽(yáng)樣品(C)：C1、C2、C3。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 基因組提取和PCR擴(kuò)增 根據(jù) DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行微生物群落總 DNA 提取，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000測(cè)定DNA 濃度和純度；使用ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)對(duì)核糖體核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid, rRNA)基因ITS區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

1.3.2 Illumina Miseq 測(cè)序 將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用微型熒光計(jì)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用DNA建庫(kù)試劑盒進(jìn)行建庫(kù): ①接頭鏈接；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用PCR擴(kuò)`增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；④磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI 序列讀取(Sequence read archive，SRA)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 數(shù)據(jù)優(yōu)化與聚類分析

使用Trimmomatic軟件原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接：使用UPARSE軟件操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)聚類，根據(jù) 97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類，使用UCHIME 軟件剔除嵌合體，利用RDP classifier 軟件對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 三地區(qū)真菌序列統(tǒng)計(jì)和多樣性分析

利用Illumina Miseq 測(cè)序之后分別獲得有效序列數(shù)為A1：73 192、A2：69 003、A3：71 663、B1：72 179、B2：68 728、B3：70 393、C1：71 077、C2：73 958、C3：67 715。對(duì)樣品序列數(shù)進(jìn)行抽平處理，抽平后序列數(shù)為67 715。在序列相似性97%水平進(jìn)行序列劃分OTU，9個(gè)樣品共得到3770個(gè)OTUs。對(duì)3組樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析，Shannon指數(shù)值越高，Simpson指數(shù)值越低，說(shuō)明群落多樣性越高，Chao1指數(shù)或ACE指數(shù)越大，說(shuō)明群落豐富度越高[19]。如表2所示，不同地區(qū)真菌群落多樣性不同，比較3組樣品的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)，C樣品的香農(nóng)指數(shù)較高，辛普森指數(shù)較低，說(shuō)明C樣品的真菌群落多樣性較高。C樣品的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)對(duì)比A樣品和B樣品均較高，說(shuō)明C樣品真菌群落豐富度較高?？偟膩?lái)說(shuō)，無(wú)論是豐富度還是多樣性，C樣品均較高。覆蓋率越接近于1，說(shuō)明測(cè)序深度越合理，測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中的所有物種。由表可知A樣品、B樣品、C樣品覆蓋率均>99%，表明取樣合理，測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)反映昆明、南平、南陽(yáng)3地的真菌群落。如圖2所示，對(duì)3組數(shù)據(jù)OTU水平進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果顯示C樣品的香農(nóng)指數(shù)與A、B 樣品存在顯著性差異。通過(guò)3組樣品對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，南陽(yáng)樣品為半年生魔芋植株，其在3組樣品中真菌群落多樣性最高，推測(cè)在魔芋種植半年以后逐漸建立微生態(tài)平衡，真菌群落多樣性達(dá)到最大，南平樣品為3年生魔芋植株，真菌群落多樣性下降，說(shuō)明隨著年限的增長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度逐漸增長(zhǎng)，導(dǎo)致整體真菌群落多樣性有所降低，而海拔高度和經(jīng)緯度對(duì)魔芋根際土壤真菌群落多樣性影響較小。

*代表顯著相關(guān)(P<0.05)

表2 不同地區(qū)樣品真菌群落多樣性分析

稀釋曲線能夠反映采集樣品測(cè)序結(jié)果的覆蓋度和真菌群落的測(cè)序深度[20]，如圖3所示，3組樣品序列數(shù)達(dá)到4000 OTU水平時(shí)變化較大，隨后隨著測(cè)序數(shù)量的增加，稀釋曲線趨于平穩(wěn)，曲線變化趨勢(shì)近似一條直線，更多的取樣只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，說(shuō)明本次3組樣品取樣測(cè)序數(shù)據(jù)合理。

圖3 基于香農(nóng)指數(shù)不同地區(qū)樣品的稀釋曲線

2.2 真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.2.1 昆明地區(qū)樣品真菌菌落結(jié)構(gòu)組成 A組樣品真菌屬于16個(gè)真菌門，55個(gè)綱，117個(gè)目，246個(gè)科，489個(gè)屬。在門水平，有4個(gè)真菌門的豐度≥1%，是A組樣品的優(yōu)勢(shì)菌群，其中子囊菌門(Ascomycota)的豐度為55.24%，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的豐度為21.49%，被孢霉菌門(Mortierellomycota)的豐度為20.18%，其余12個(gè)門均低于1%，共占1.25%(圖4)。

圖4 A樣品門水平真菌群落組成

如表3所示，在綱水平屬于55個(gè)綱，相對(duì)豐度≥1%的綱有7個(gè)，其中子囊菌門的糞殼菌綱(Sordariomycetes，32.29%)豐度最高，被孢霉菌門的被孢霉綱(Mortierellomycetes，20.13%)次之，其他還有擔(dān)子菌門的銀耳綱(Tremellomycetes)等優(yōu)勢(shì)菌群。

表3 A樣品綱水平真菌組成及相對(duì)豐度

昆明地區(qū)樣品真菌群落在屬水平上共有489個(gè)屬，其中有13個(gè)真菌屬的豐度≥1%，屬于優(yōu)勢(shì)菌屬，主要包含被孢霉屬(Mortierella)20.13%、赤霉屬(Gibberella)6.07%、截盤多孢霉屬(Truncatella)3.91%、鐮刀霉屬(Fusarium)3.25%、青霉屬(Penicillium)2.57%和硬皮地星屬(Astraeus)2.22%等(圖5)。

圖5 A樣品屬水平真菌群落組成

2.2.2 南平地區(qū)樣品真菌菌落結(jié)構(gòu)組成 B組樣品真菌屬于12個(gè)真菌門，38個(gè)綱，88個(gè)目，189個(gè)科，361個(gè)屬。在門水平，有4個(gè)真菌門的豐度≥1%，是B組樣品的優(yōu)勢(shì)菌群，其中子囊菌門(Ascomycota)的豐度為81.71%，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的豐度為13.00%，被孢霉菌門(Mortierellomycota)的豐度為2.83%，未分類門為1.24%，其余8個(gè)門均低于1%，共占1.22%(圖6)。

圖6 B樣品門水平真菌群落組成

如表4所示，在綱水平屬于38個(gè)綱，相對(duì)豐度≥1%的綱有8個(gè)，其中子囊菌門的糞殼菌綱(Sordariomycetes,66.15%)豐度最高，擔(dān)子菌門的傘菌綱(Agaricomycetes,8.05%)次之，其他還有子囊菌門的座囊菌綱(Dothideomycetes)等優(yōu)勢(shì)菌群。

表4 B樣品綱水平真菌組成及相對(duì)豐度

南平地區(qū)樣品真菌群落在屬水平上共有361個(gè)屬，有22個(gè)真菌屬的豐度≥1%，屬于優(yōu)勢(shì)菌屬，主要包含赤霉屬(Gibberella，17.77%)、亡革菌屬(Thanatephorus，7.79%)、隱囊菌屬(Aphanoascus，4.22%)、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia，3.96%)、枝孢霉屬(Cladosporium，3.50%)、鐮刀霉屬(Fusarium，2.90%)、綠僵菌屬(Metarhizium，2.87%)、被孢霉屬(Mortierella，2.72%)等(圖7)。

圖7 B樣品屬水平真菌群落組成

2.2.3 南陽(yáng)地區(qū)樣品真菌菌落結(jié)構(gòu)組成 C組樣品真菌屬于16個(gè)真菌門，48個(gè)綱，109個(gè)目，256個(gè)科，540個(gè)屬。在門水平，有5個(gè)真菌門的豐度≥1%，是C組樣品的優(yōu)勢(shì)菌群，其中子囊菌門(Ascomycota)的豐度為67.72%，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的豐度為13.36%，被孢霉菌門(Mortierellomycota)的豐度為5.27%，羅茲菌門(Rozellomycota)的豐度為6.88%，未分類門為5.61%，其余11個(gè)門均低于1%，共占1.16%(圖8)。

圖8 C樣品門水平真菌群落組成

如表5所示，在綱水平屬于48個(gè)綱，相對(duì)豐度≥1%的綱有11個(gè)，其中子囊菌門的糞殼菌綱(Sordariomycetes，41.20%)豐度最高，子囊菌門的座囊菌綱(Dothideomycetes，13.35%)次之，其他還有擔(dān)子菌門的銀耳綱(Tremellomycetes)等優(yōu)勢(shì)菌群。

表5 C樣品綱水平真菌組成及相對(duì)豐度

如圖9所示，南陽(yáng)地區(qū)樣品真菌群落的豐富度和均勻度均較高，在屬水平上共有540個(gè)屬，有25個(gè)真菌屬的豐度≥1%，屬于優(yōu)勢(shì)菌屬，主要包含Paraboeremia屬(6.46%)、被孢霉屬(Mortierella，5.26%、)新赤殼屬(Neocosmospora，3.68%)、木霉屬(Trichoderma，3.60%)、Solicoccozyma屬(3.40%)、青霉屬(Penicillium，2.99%)、鐮刀霉屬(Fusarium，2.60%)、Tausonia屬(2.49%)、膝梗孢屬(Gonytrichum，2.39%)、支孢霉屬(Aremonium，2.21%)、綠僵菌屬(Metarhizium，1.18%)等。其中木霉屬真菌在我國(guó)工業(yè)、農(nóng)業(yè)及環(huán)境修復(fù)方面都占據(jù)舉足輕重的地位[21]，木霉屬真菌的生物降解轉(zhuǎn)化及產(chǎn)纖維素酶在工業(yè)和農(nóng)業(yè)上應(yīng)用較多[22]，并且通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)利用木霉屬真菌進(jìn)行重金屬污染修復(fù)方面也能表現(xiàn)不錯(cuò)的效果[23]。昆明樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬主要是被孢霉屬(Mortierella)、截盤多孢霉屬(Truncatella)、青霉屬(Penicillium)和硬皮地星屬(Astraeus,2.22%)等。其中，青霉屬真菌為較常見(jiàn)且應(yīng)用范圍較廣的真菌屬，其在生物轉(zhuǎn)化、醫(yī)學(xué)及環(huán)保等方面應(yīng)用較多[24]，在自然界青霉菌屬能夠參與多種天然產(chǎn)物降解，也能產(chǎn)生多種蛋白酶、木質(zhì)素酶等多種生物酶[25]，還能在多環(huán)芳烴污染物處理方面發(fā)揮重要作用[26]。此外，青霉菌屬的許多次級(jí)代謝產(chǎn)物在抗生素領(lǐng)域應(yīng)用歷史悠久[27]，近年來(lái)其在癌癥治療方面的應(yīng)用也有了新的突破[28]。

圖9 C樣品屬水平真菌群落組成

2.3 組間差異比較分析

由樣品菌落構(gòu)成分析和物種Venn圖(圖10)可知，3組采集樣品真菌群落多樣性較高，真菌群落結(jié)構(gòu)差異性適中，存在共有和特有物種。3組樣品真菌物種廣泛存在擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉菌門(Mortierellomycota)3個(gè)門類。A樣品OTU數(shù)量為1704個(gè)，B樣品OTU數(shù)量為1204個(gè)，C樣品OTU數(shù)量為2118個(gè)。A組樣品與B組樣品共有384個(gè)OTUs，A組樣品與C組樣品共有640個(gè)OTUs，B組樣品與C組樣品共有515個(gè)OTUs，3組樣品共有283個(gè)OTUs。A組樣品和B組樣品共有優(yōu)勢(shì)真菌屬：赤霉屬(Gibberella)、鐮刀霉屬(Fusarium)、被孢霉屬(Mortierella)、毛殼菌屬(Chaetomium)。B組樣品和C組樣品共有優(yōu)勢(shì)真菌屬：鐮刀霉屬(Fusarium)、支頂孢屬(Acremonium)、新赤殼屬(Neocosmospora)、被孢霉屬(Mortierella)、Ramophialophora屬、Chordomyces屬。A組樣品和C組樣品共有優(yōu)勢(shì)真菌屬：被孢霉屬(Mortierella)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、鐮刀霉屬(Fusarium)、Solicoccozyma屬、Saitozyma屬。三者共有優(yōu)勢(shì)真菌屬為被孢霉屬(Mortierella)和鐮刀霉屬(Fusarium)。

圖10 不同地區(qū)樣品Venn分析

基于3組樣品中群落豐度數(shù)據(jù)，運(yùn)用嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢測(cè)不同樣品真菌群落中表現(xiàn)出的豐度差異的物種，進(jìn)行假設(shè)性檢驗(yàn)，評(píng)估觀察到的差異的顯著性。對(duì)比3組樣品真菌群落豐度水平，結(jié)果顯示被孢霉屬、赤霉屬、Saitozyma屬、Solicoccozyma屬、Paraboeremia屬、青霉屬、木霉屬等菌屬在3組樣品中群落豐度差異較大，其中赤霉屬、木霉屬真菌群落豐度在3組樣品中存在顯著性差異(P<0.05，圖11)。

*表示差異顯著，**表示差異極顯著

2.4 真菌群落功能預(yù)測(cè)分析

如表6所示，通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，真菌參與了多種代謝功能，其中包含β-甘露聚糖酶、α-葡聚糖合酶、α-甘露聚糖酶等功能，為以后篩選或指導(dǎo)微生物利用提供幫助。

表6 不同地區(qū)樣品真菌群落KEGG功能豐度統(tǒng)計(jì)

3 討 論

通過(guò)利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)三地區(qū)樣品真菌群落多樣性進(jìn)行了分析，共得到3770個(gè)OTUs，獲得真菌菌落17門、62綱、141目、326科、747屬、1302種。C樣品的香農(nóng)指數(shù)較高，辛普森指數(shù)較低，Chao1 指數(shù)和ACE指數(shù)高，表明C樣品真菌群落多樣性和豐富度較高。物種組成分析結(jié)果表明不同地區(qū)魔芋根際土壤真菌群落存在差異，赤霉屬、木霉屬真菌群落豐度在3組樣品中存在顯著差異(P<0.05)。3組采集樣品真菌群落多樣性較高，A組樣品與B組樣品共有384個(gè)OTUs，A組樣品與C組樣品共有640個(gè)OTUs，B組樣品與C組樣品共有515個(gè)OTUs，3組樣品共有283個(gè)OTUs。C樣品真菌參與了多種代謝功能，其中包含β-甘露聚糖酶、α-葡聚糖合酶、α-甘露聚糖酶等功能，為以后篩選或者定向指導(dǎo)微生物利用提供幫助。3組樣品對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，種植年限對(duì)魔芋種魔芋根際土壤真菌群落多樣性影響較大，而海拔高度和經(jīng)緯度對(duì)其影響較小。

4 結(jié) 論

通過(guò)利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)三地區(qū)真菌群落多樣性進(jìn)行了分析，對(duì)比分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)魔芋根際土壤真菌群落差異較大，種植年限對(duì)魔芋根際土壤真菌群落多樣性水平影響較大，而海拔高度和經(jīng)緯度對(duì)魔芋根際土壤真菌群落多樣性水平影響較小，為魔芋的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了幫助。