單雅詩(shī)， 彭念念， 王良炎＊

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453007）

甘草（Glycyrrhiza Uralensis Fisch）是我國(guó)最常用的大宗藥材之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，被列為上品,在臨床方劑中使用頻率極高,素有“十方九草”之稱,有補(bǔ)脾益氣,清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效[1]。 甘草的主要成分為甘草酸和甘草甜素，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗艾滋病等藥理作用。 近年來(lái),中草藥由于其成本低、加工方便、無(wú)抗藥性和藥物殘留、副作用小、效果顯著、資源豐富等優(yōu)點(diǎn)受到人們的關(guān)注。 有研究認(rèn)為中草藥對(duì)于強(qiáng)健機(jī)體、加速生長(zhǎng)、提高生產(chǎn)性能和改善機(jī)體營(yíng)養(yǎng)組分等方面有較好的綜合效應(yīng)，而且具有無(wú)抗藥性、無(wú)殘留、不良反應(yīng)小、效果顯著等特點(diǎn)[2]。

黃 河 鯉（Cyprinus carpio haematopterus）主 產(chǎn) 于黃河流域，為我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，與松江鱸、興凱湖鲌、松花江鱖并稱為中國(guó)四大淡水名魚[3]。 黃河鯉以其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)與文化價(jià)值， 深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，在河南省水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖日益集約化和規(guī)?；?， 黃河鯉肉質(zhì)品質(zhì)普遍下降，土腥味加重，脂肪增多，蛋白含量減少。人們感到其產(chǎn)品品質(zhì)及品味不如自然界野生魚類鮮美。改善黃河鯉肉質(zhì)品質(zhì)是急需解決的問(wèn)題。近年來(lái),中草藥作為添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用逐漸增多，但以甘草為飼料添加劑，探討其對(duì)黃河鯉肌肉生長(zhǎng)的研究較少。

肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin，mstn）簡(jiǎn)稱肌抑素，因其具有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factorbeta，tgf-β）超家族成員共有的結(jié)構(gòu)特性，又被稱為生長(zhǎng)分化因子8 （growth differentiation factor8，gdf-8）。Mstn作為一種肌肉負(fù)向調(diào)控因子在肌肉生長(zhǎng)和肉質(zhì)品質(zhì)中發(fā)揮著重要的作用。 在畜牧生產(chǎn)中，抑制mstn表達(dá)可以改善畜禽的瘦肉質(zhì)量和肉質(zhì)， 提高經(jīng)濟(jì)效益；在醫(yī)學(xué)研究中，抑制mstn表達(dá)對(duì)肌肉萎縮癥等疾病有一定的效果。Mstn負(fù)向調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，該基因的多態(tài)性與動(dòng)物骨骼肌的生長(zhǎng)相關(guān)，mstn缺失不但影響骨骼肌發(fā)育， 還對(duì)脂肪沉積有一定的抑制作用。 因此，本研究通過(guò)在飼料中添加不同濃度甘草含量， 探討其對(duì)黃河鯉肌肉生長(zhǎng)相關(guān)基因mstn的影響，從而為甘草在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚來(lái)源和樣品收集

本實(shí)驗(yàn)所用黃河鯉來(lái)自河南省水產(chǎn)科學(xué)院。 挑選體重均一的黃河鯉幼魚750尾， 隨機(jī)分為5個(gè)處理組，每組三個(gè)平行，每個(gè)平行50尾魚。 C組為對(duì)照組，飼料中甘草濃度為0 %，T1組甘草濃度為0.5 %，T2組飼料甘草濃度為1.5 %，T3組甘草濃度為2.5 %，T4組甘草濃度為4.0 %，實(shí)驗(yàn)飼料配方和營(yíng)養(yǎng)成分見表1。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)每組實(shí)驗(yàn)魚的重量，并按照表2進(jìn)行樣品的采集，用于RNA的提取，采集后的樣品放入液氮中速凍，然后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分

表2 實(shí)驗(yàn)樣品采集

1.2 黃河鯉肌肉總RNA提取和cDNA合成

將采集的實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行RNA的提取，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性，ND-2000 核酸蛋白儀（Thermo， 美 國(guó)） 檢 測(cè)RNA 純 度 和 濃 度。 Prime-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara公司， 大連） 合成cDNA用于PCR擴(kuò)增。 利用Primer 3 Plus軟件設(shè)計(jì)mstn和β-actin的引物，引物序列見表3，由金唯智公司進(jìn)行合成。 按照（Takara公司，大連）說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳驗(yàn)證。

表3 所用引物序列

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）

按照Prime Script TMRT Master Mix 和SYBR Premix Ex Taq TM（Ta Ka Ra，大連）試劑盒說(shuō)明書，以cDNA為模板，體系為10 μl，上下游引物各0.3 μl，SYBR PremixⅡTaqTM（2X） 5 μl，cDNA 1 μl，RNase free H2O 3.4 μl。 QRT-PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，62℃20 s，95℃10 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析溶解曲線以及Ct值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將每組實(shí)驗(yàn)魚的背部肌肉、 紅肌和腹部肌肉依次進(jìn)行稱重，并計(jì)算出平均值。 熒光定量所得圖譜和數(shù)據(jù)用Light Cycler 96分析得出Ct值，最后采用2-△△Ct法計(jì)算的mstn的相對(duì)表達(dá)水平， 利用spss18.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在單因素方差分析（One-Way ANOVA）基礎(chǔ)上采用Duncan多重比較檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間的差異（P＜0.05），結(jié)果用mean±SE表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 喂食甘草后對(duì)黃河鯉背部肌肉mstn mRNA表達(dá)量影響

圖1結(jié)果顯示，四個(gè)處理組中的黃河鯉背部肌肉mstnmRNA表達(dá)量均有一定變化， 表明甘草對(duì)黃河鯉背部肌肉mstn基因的表達(dá)有影響。 表達(dá)水平為先增高后下降的趨勢(shì)，T1、T2、T3和T4四個(gè)處理組在表達(dá)量上不存在顯著差異（P＞0.05）。 添加甘草的實(shí)驗(yàn)組跟對(duì)照組相比，mstn表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，具有顯著的差異（P＜0.05），其中甘草添加量為0.5 %的實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量最低， 為0.43； 其余三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別為0.23、0.11和0.06。

圖1 喂食甘草后鯉背部肌肉MSTN基因相對(duì)表達(dá)量

2.2 喂食甘草后鯉紅肌對(duì)黃河鯉背部肌肉mstn mRNA表達(dá)量影響

圖2結(jié)果顯示，甘草處理組紅肌肉的mstn基因表達(dá)量與對(duì)照組存在顯著差異（P＜0.05）；處理組T2和T3不存在顯著差異（P＞0.05），而T1和T4存在顯著差異（P＜0.05）；其中甘草添加量為0.5 %的實(shí)驗(yàn)組mstn表達(dá)量最低； 其余三個(gè)處理組中， 甘草添加濃度為4%時(shí)，mstnmRNA表達(dá)量最高；另外兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量介于兩者之間。

圖2 喂食甘草后鯉紅肌MSTN基因相對(duì)表達(dá)量

2.3 喂食甘草后對(duì)黃鯉背部肌肉MSTN mRNA表達(dá)量影響

圖3結(jié)果顯示， 處理組甘草添加濃度為1.5%和2.5%時(shí)，鯉腹部肌肉mstn基因表達(dá)存在顯著差異（P＜0.05），表達(dá)量趨勢(shì)同魚背部肌肉相似，表現(xiàn)為先升高后下降。 0.5%甘草處理組mstn基因表達(dá)量為1.97，與對(duì)照組不存在顯著差異 （P＞0.05）；1.5%甘草處理組mstn基因表達(dá)量為3.53， 與對(duì)照組差異顯著 （P＜0.05）；2.5%甘草處理組中mstn基因表達(dá)量為4.19，與對(duì)照組存在顯著差異（P＜0.05）；4 %甘草處理組mstn基因表達(dá)量為2.59， 與對(duì)照組的差異不顯著 （P＞0.05）。T3處理組的表達(dá)量高于T1、T2和T4處理組（P＜0.05）。 綜上所述：T2和T3組與C組存在顯著差異（P＜0.05）， 其它處理組與對(duì)照組之間不存在顯著性的差異（P＞0.05）。

圖3 喂食甘草后鯉腹部肌肉MSTN基因相對(duì)表達(dá)量平均值

3 討論

黃河鯉屬于鯉形目鯉科鯉屬， 因肉質(zhì)鮮美而聞名，是我國(guó)內(nèi)陸水域最重要的養(yǎng)殖品種。 近年來(lái)，人們開始尋求適宜的飼料添加劑來(lái)降低脂肪的含量，提高蛋白質(zhì)的沉淀， 從而改善魚的肉質(zhì)品質(zhì)和風(fēng)味[4]，在飼料中植物性添加劑對(duì)肌肉品質(zhì)的影響受到廣泛關(guān)注。有研究表明，在飼料中添加不同成分的螺旋藻、 復(fù)方中草藥和不同劑型微量元素等都可以影響鯉肌肉mstnmRNA的表達(dá)水平。 然而， 肌肉的分化、生長(zhǎng)和發(fā)育是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)節(jié)和過(guò)程，且在不同層次受多種因素的影響[5]。魚類肌肉在肌原發(fā)生調(diào)節(jié)因子的作用下， 將各體節(jié)進(jìn)一步分化成為不同類型肌纖維或肌肉組織， 位于軀干深層的白色肌肉為快肌，位于表皮下的紅色肌肉為慢肌。本文根據(jù)黃河鯉肌肉分布的位置以及其它特點(diǎn)以背部肌肉、紅肌以及腹部肌肉為研究對(duì)象，通過(guò)qRT-PCR的方法研究甘草對(duì)鯉肌肉mstn表達(dá)的影響， 旨在為中草藥甘草作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)。

最近已從許多魚類組織中分離出mstn， 包括斑馬魚、羅非魚、虹鱒和鯰等[6]。此外，與哺乳動(dòng)物相比，魚類不僅在紅色和白色肌肉中表達(dá)mstn， 而且在其他組織中也表達(dá)mstn，這表明mstn可能在魚類中不僅在肌肉生長(zhǎng)中起作用， 而且在其他生理過(guò)程中也起作用[7]。 在本實(shí)驗(yàn)中，背部肌肉喂食甘草后mstn基因的表達(dá)明顯降低，且隨著甘草濃度的增加，表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，甘草濃度約在0.5% ～2.5%之間可使mstn基因表達(dá)量降低，加速背部肌肉生長(zhǎng)。在紅肌中，雖然喂食甘草后mstn基因的表達(dá)量降低，但是與對(duì)照組差異不顯著， 表明飼料中添加甘草可能對(duì)紅肌生長(zhǎng)的影響較小。 Galt[8]等通過(guò)對(duì)虹鱒紅肌注射mstn,12 h后在紅肌體內(nèi)均未檢測(cè)到差異，此外，也可能與紅肌自身特點(diǎn)相關(guān)， 紅肌富含線粒體和肌紅蛋白，主要用于緩慢游泳和平衡，隨著魚體增長(zhǎng)，紅肌會(huì)保持恒定，所以添加甘草后，mstn表達(dá)量也不會(huì)發(fā)生較大變化。 在腹部肌肉中，喂食甘草后mstn基因的表達(dá)存在較大差異，甘草濃度為1.5%和2.5%時(shí)，mstn表達(dá)量顯著增加， 表明飼料中添加1.5%和2.5%甘草可能影響腹部肌肉的生長(zhǎng)。 此外， 一些研究報(bào)道，飼料中添加甘草粉、甘草提取物和甘草莖葉等均可影響肌肉品質(zhì)，侯芳[9]等研究表明飼料中添加14.95 %的甘草莖葉具有提高阿勒泰羊肌肉品質(zhì)；王旭東[10]等研究表明，飼料中添加甘草藥渣的實(shí)驗(yàn)組羊肉品質(zhì)高于飼料中未添加甘草藥渣的對(duì)照組，混合藥渣對(duì)羊肉并沒(méi)有影響。綜上所述，飼料中添加甘草對(duì)黃河鯉不同肌肉組織的mstn表達(dá)量變化影響存在較大差異，這可能也與骨骼肌類型不同相關(guān)。而甘草添加后背部肌肉和腹部肌肉mstn的表達(dá)差異對(duì)肌肉品質(zhì)改善的作用還有待進(jìn)一步深入研究。