王亞玲 王常安 劉紅柏 韓世成 陸紹霞 張 穎

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所, 哈爾濱 150070; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中, 因魚粉價(jià)格上漲, 飼料生產(chǎn)商開始用其他來源的蛋白質(zhì)替代魚粉蛋白, 主要為植物蛋白[1]。但是, 植物蛋白的氨基酸組成不同于魚粉蛋白。往往出現(xiàn)必需氨基酸缺乏或含量很低,引起飼料氨基酸不平衡, 導(dǎo)致水生動(dòng)物不能高效利用飼料蛋白質(zhì)或氨基酸, 影響機(jī)體的相關(guān)代謝[2,3]。蘇氨酸是哺乳動(dòng)物和魚類機(jī)體不能合成的必需氨基酸, 也是許多飼料原料的第二或第三限制性氨基酸。

魚類易受氧化損傷, 因?yàn)闄C(jī)體組織中不飽和脂肪酸含量高, 易受氧自由基的攻擊[4]。超氧化物歧化酶作為主要的抗氧化酶, 被認(rèn)為是生物抗氧化的重要指標(biāo)。丙二醛作為常用的膜脂過氧化指標(biāo), 通過過氧化程度來間接反映機(jī)體細(xì)胞的受損情況[5]。已有研究表明, 在飼料中添加蘇氨酸可以顯著的降低丙二醛的含量和提高超氧化物歧化酶的活性[6]。腸道是水產(chǎn)動(dòng)物重要的營養(yǎng)和免疫器官, 但容易受到抗原、微生物和食物有毒元素等外來物的攻擊[7]。蘇氨酸及代謝產(chǎn)物可以提高腸道消化酶活性, 促進(jìn)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)育, 進(jìn)而提高魚類的生長速度[8]。目前, 蘇氨酸促進(jìn)魚類消化酶活性的研究較多, 在一些魚類中已經(jīng)證實(shí), 但是關(guān)于蘇氨酸對魚類腸道免疫的研究較少, 有報(bào)道稱, 最佳的蘇氨酸水平可以調(diào)節(jié)促炎和抗炎細(xì)胞因子[9]。對草魚(Ctenopharyngodon idellus)的研究發(fā)現(xiàn), 蘇氨酸缺乏組下調(diào)了促炎細(xì)胞因子IL-8和TNF-α的基因表達(dá)水平, 表明蘇氨酸缺乏加重了炎癥反應(yīng); 對團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycepbala)的研究也有相似的發(fā)現(xiàn), 最佳的蘇氨酸水平下調(diào)了腸道促炎細(xì)胞因子IL-10的基因表達(dá)[10,11]。然而, 關(guān)于這方面的研究還缺乏系統(tǒng)性, 需要系統(tǒng)地研究蘇氨酸與腸道免疫功能的關(guān)系,深入探討蘇氨酸在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的分子機(jī)制。

虹鱒(Oncorhynchus mykiss)屬鮭形目、鮭科、大麻哈魚屬, 因其肉質(zhì)鮮美、無肌間刺等優(yōu)點(diǎn)深受歡迎, 是我國乃至世界養(yǎng)殖的主要冷水性魚類, 與二倍體相比, 三倍體虹鱒具有生長速度快, 飼料系數(shù)低, 含肉率高等優(yōu)點(diǎn)[12,13]?？焖侔l(fā)展的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)因養(yǎng)殖環(huán)境變化、飼料品質(zhì)不佳等因素, 也面臨著巨大的挑戰(zhàn), 感染細(xì)菌、病毒引發(fā)的疾病和飼料中植物蛋白的使用[14,15]。然而關(guān)于低魚粉飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒腸道蛋白合成、炎癥相關(guān)基因的報(bào)道較少。在本研究中, 以三倍體虹鱒為研究對象, 在低魚粉飼料中添加蘇氨酸研究虹鱒血清抗氧化能力和腸道消化生理與炎癥因子基因的表達(dá)能力, 從消化酶活性和腸道炎癥因子的表達(dá)來探討蘇氨酸促進(jìn)虹鱒生長和消化的原因[16—19], 旨在為優(yōu)化三倍體虹鱒人工配合飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

如表 1所示, 以半純化飼料為基礎(chǔ)飼料, 蛋白源為魚粉、豆粕和明膠, 糖源為糊精, 脂肪源為魚油、豆油和磷脂, 配制成粗蛋白水平為41.5%, 粗脂肪水平為18.7%的基礎(chǔ)飼料。如表 2所示, 測量基礎(chǔ)飼料中的氨基酸含量, 除了蘇氨酸以外其他各種氨基酸含量達(dá)到虹鱒魚體中的含量[20], 在飼料中分別添加不同水平的蘇氨酸使5組試驗(yàn)中蘇氨酸水平含量達(dá)到0.45%、0.76%、1.09%、1.29%和1.64%,其中蘇氨酸的增減用等量的甘氨酸代替。所有原料粉碎后經(jīng)過80目篩后用鼓型混合機(jī)混合在一起,按照配比逐級混合均勻后經(jīng)小型制粒機(jī)HKJ-218(無錫同力糧機(jī)有限公司)加工成顆粒飼料制成制粒(直徑為3 mm), 風(fēng)干后將其密封在真空包裝袋中, 置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平Tab. 1 Ingredients and approximate composition of the experimental diets (air-dry basis, %)

表2 基礎(chǔ)飼料氨基酸組成Tab. 2 Amino acids composition of the basal diets(air-dry basis, %)

1.2 試驗(yàn)魚和飼養(yǎng)試驗(yàn)

三倍體虹鱒從中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水魚試驗(yàn)站購買, 開始試驗(yàn)前, 挑選規(guī)格一致的健康三倍體虹鱒放入室內(nèi)循環(huán)流水系統(tǒng), 投喂2周基礎(chǔ)飼料, 以適應(yīng)試驗(yàn)設(shè)施和條件,2周后開展養(yǎng)殖試驗(yàn)。

在馴化期結(jié)束后, 先饑餓24h, 挑選平均質(zhì)量為(18.42±0.02) g的三倍體虹鱒隨機(jī)分配到200 L的循環(huán)流水水族箱中, 試驗(yàn)分5個(gè)處理組(G1—G5), 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)30尾, 分別投喂G1、G2、G3、G4和G5的試驗(yàn)飼料。每天投喂2次(09: 00和16: 00), 達(dá)飽食, 養(yǎng)殖周期56d。試驗(yàn)用水為曝氣控溫后的自來水, 水溫(15±1)℃, 溶氧＞ 6.0 mg/L, 氨氮含量＜ 0.2 mg/L, pH 7.0—7.2, 試驗(yàn)期間保持光照充足, 每天記錄投喂量, 如有死魚稱重并記錄數(shù)量。在試驗(yàn)結(jié)束后, 為減少對魚的處理壓力, 禁食24h,稱每缸魚的總重, 并分別稱每尾魚的體重和測體長。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后, 虹鱒饑餓24h, 分別從每個(gè)水族箱隨機(jī)抽取3尾虹鱒, 每個(gè)飼料組9尾, 用100 mg/L Ms-222(間氨基苯甲酸乙酯甲硫酸鹽)麻醉, 測體長,稱量體重, 放置冰盤上, 尾靜脈采血, 在常溫下靜置4h, 用冷凍離心機(jī)3000 r/min離心15min, 取上清液,裝入1.5 mL離心管中, 用于檢測血清抗氧化指標(biāo)。每個(gè)處理組取3尾魚, 編好號后放置-80℃超低冰箱中保存?zhèn)溆? 用于體成分分析。

每個(gè)魚缸隨機(jī)取7尾魚, 用100 mg/L Ms-222(間氨基苯甲酸乙酯甲硫酸鹽)麻醉, 在解剖之前, 用75%的酒精對魚體進(jìn)行消毒, 放置冰盤上迅速取出腸道, 先取2尾魚剔除腸道內(nèi)多余的脂肪和內(nèi)含物,迅速裝入速凍管放入液氮中儲(chǔ)存, 隨后在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆? 用于RNA的提取及分子的檢測。之后取2尾魚, 取出腸道, 剔除腸道內(nèi)多余的脂肪和內(nèi)含物, 用預(yù)冷生理鹽水清洗腸道內(nèi)容物, 濾紙吸干水分, 用于消化酶的檢測。最后每個(gè)處理組取3尾魚, 解剖后取中腸(幽門盲囊和后腸中間部分), 剔除內(nèi)容物, 放置用磷酸鹽緩沖的4%的福爾馬林緩沖溶液中用于腸道組織學(xué)觀察。

生長性能的測定生長性能指標(biāo)計(jì)算公式如下:

成活率 (Survival rate,SR, %)=100%×終末試驗(yàn)魚數(shù)量/初始試驗(yàn)魚數(shù)量;

攝食率 (Feed intake,FI, %/d)=100%×攝食飼料干重×2/[(終末體重+初始體重)×試驗(yàn)天數(shù)];

飼料效率 (Feed efficiency,FE, %)=100%×(終末體重-初始體重)/攝食量;

蛋白質(zhì)沉積率 (Protein productive value,PPV,%)=100%×(魚體蛋白增量/攝入蛋白)。

血清抗氧化酶活性的測定取待測離心好的血清樣品放置在4 ℃解凍后備用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD, 貨號: A001-3-2)、過氧化氫酶(Catalase assay kit, CAT, 貨號: A007-2-1)的活性及丙二醛(Malondialdehyde, MDA, 貨號:A003-1-2)的含量嚴(yán)格按照南京建成生物工程有限公司試劑盒提供的說明書測定。

腸道消化酶活性的測定取待測的腸道樣品在4℃解凍后稱重, 加入0.86%的預(yù)冷生理鹽水,加入的生理鹽水是質(zhì)量體積比的1∶9, 采用FJ-200高速分散組織勻漿機(jī), 勻漿液4000 r/min離心10min,取上清液備用。脂肪酶(Lipase assay kit, LPS, 貨號:A054-2-1)、淀粉酶(Amylase Asssay Kit, AMS, 貨號: C016-1-1)和胰蛋白酶(貨號: A080-2-2)含量采用南京建成生物工程有限公司試劑盒測定。胰蛋白酶采用紫外比色法測定, 淀粉酶活性采用淀粉-碘比色法測定, 脂肪酶采用比色法測定, 組織蛋白的含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定。酶活性單位用每克組織蛋白質(zhì)的酶活性單位(U/g prot)表示。

組織切片觀察腸道組織切片: 每重復(fù)隨機(jī)取3尾魚的中腸固定于Bouin’s液中。按常規(guī)組織切片制備程序, 進(jìn)行水流沖洗、梯度乙醇脫水, 二甲苯中透明及石蠟包埋。然后采用KD 1508切片機(jī)橫向切片, 厚度為6 μm, 展片后采用HE染色, 中性樹膠封片, 具體方法參考林佳潔的報(bào)道[21]。用顯微鏡(LeicaMD 4000B)觀察后拍片, 每組腸道切片觀察10個(gè)以上。

RNA提取和熒光定量PCR總RNA的提取:取出采集的腸道組織樣品, 加入適量的液氮, 在-80℃遇冷過的研缽中研磨至粉末狀, 倒入遇冷過的EP管中, -80℃保存?zhèn)溆谩０凑誘RIzol試劑盒中說明書的方法提取腸道組織中的總RNA。

RNA濃度的檢測: 采用超微量紫外可見光分光光度計(jì)(Thermo ScientificTMNanoDrop 8000)檢測總RNA濃度及純度。

反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR: 按照TaKaRa RR047A試劑盒說明書將檢測合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一條鏈。采用Applied Biosystems公司7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作系統(tǒng), 檢測三倍體虹鱒腸道待測基因的表達(dá)水平。熒光定量結(jié)果2-ΔΔCt方法處理數(shù)據(jù)[22]。

引物的設(shè)計(jì)與合成: 利用NCBI網(wǎng)址及Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表 3), 以β-actin為內(nèi)參基因, 通過這些基因的擴(kuò)增顯示不同組之間的表達(dá)差異。

表3 熒光定量引物序列Tab. 3 Primer sequences of Real-time PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS for Windows 23.0, 將數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s多重比較, 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,P＜0.05表示組內(nèi)數(shù)據(jù)差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒生長性能的影響

如表 4所示, 各組間的成活率差異不顯著(P＞0.05), 而終末體質(zhì)量和飼料效率相比對照組顯著增高(P＜0.05), 飼料效率在G3組最高; 與對照組相比,攝食率和蛋白質(zhì)沉積率隨著蘇氨酸水平的增加, 顯著降低(P＜0.05), G4組攝食率最低, G3組的蛋白質(zhì)沉積率最低。

表4 飼料中添加蘇氨酸對虹鱒魚生長性能的影響Tab. 4 Effects of dietary threonine on growth performance of O.mykiss in various groups (n=3)

2.2 飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒血清抗氧化酶活性的影響

如表 5所示, 隨著飼料中蘇氨酸水平的增加, 虹鱒血清超氧化物歧化酶(SOD)活力明顯升高(P＜0.05), 與對照組(0)相比, 1.09%、1.29%組的值增加迅速。血清丙二醛(MDA)的含量隨著飼料中蘇氨酸水平的增加有所下降(P＜0.05), 當(dāng)蘇氨酸添加量為1.29%時(shí), 丙二醛含量下降顯著(P＜0.05)。過氧化氫酶(CAT)在1.29%組活性最高, 差異性顯著(P＜0.05)。

表5 飼料中添加蘇氨酸對虹鱒血清抗氧化酶活性的影響Tab. 5 Effects of dietary threonine on serum antioxidant capacity in O. mykiss in various groups (n=3;±SD)

表5 飼料中添加蘇氨酸對虹鱒血清抗氧化酶活性的影響Tab. 5 Effects of dietary threonine on serum antioxidant capacity in O. mykiss in various groups (n=3;±SD)

指標(biāo)Index組別Group G1 G2 G3 G4 G5超氧化物歧化酶SOD (U/mL)88.69±3.26a98.00±4.48a113.64.±14.62b116.72±4.09b101.85±10.16b過氧化氫酶CAT (U/mL)9.42±0.22a10.34±0.37b10.70±0.08b11.80±0.30e11.25±0.25c丙二醛MDA (nmol/mL)3.53±1.10c3.32±0.10b3.16±0.05b2.91±0.08a3.24±0.10b

2.3 飼料中添加蘇氨酸對虹鱒腸道消化生理的影響

飼料中添加蘇氨酸對虹鱒腸道消化酶活性的影響 如表 6所示, 各組間隨著飼料中蘇氨酸水平含量的增加, 脂肪酶含量升高(P＜0.05), 但隨著蘇氨酸的含量達(dá)到1.64%時(shí), 脂肪酶活性有所下降。淀粉酶活性也隨著蘇氨酸含量的增加顯著升高(P＜0.05), 1.09%和1.29%組顯著高于對照組, 隨著蘇氨酸水平進(jìn)一步的增加, 淀粉酶活性有下降的變化趨勢。相比對照組, 1.09%、1.29%和1.64%組胰蛋白酶含量顯著升高(P＜0.05), 1.29%組活性最高。

表6 飼料中添加蘇氨酸對虹鱒腸道消化酶的影響Tab. 6 Effects of dietary threonine on intestinal digestive enzyme in O. mykiss in various groups (n=3; ±SD; %)

表6 飼料中添加蘇氨酸對虹鱒腸道消化酶的影響Tab. 6 Effects of dietary threonine on intestinal digestive enzyme in O. mykiss in various groups (n=3; ±SD; %)

指標(biāo)Index組別 Group G1 G2 G3 G4 G5脂肪酶Lipase(U/g prot)50.55±0.12a50.63±0.21a51.41±0.32b51.51±0.32b50.98±0.12ab胰蛋白酶Trypsin(U/mg prot)544.95±11.48a594.18±12.43b632.81±19.88c671.76±11.50e615.28±24.24bc淀粉酶Amylase(U/g prot)114.45±33.28a150.09±47.87b167.08±18.57c156.22±45.58bc134.51±33.48ab

飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒腸道組織形態(tài)的影響如表 7所示, 各組間隨著飼料中蘇氨酸水平含量的增加, 絨毛寬度和肌層厚度升高(P＜0.05), 但隨著蘇氨酸的含量達(dá)到1.29%時(shí), 絨毛寬度和肌層厚度有所下降。絨毛高度也隨著蘇氨酸含量的增加顯著降低, 在G4組達(dá)到最低值(P＜0.05)。

表7 飼料中添加蘇氨酸對虹鱒腸道形態(tài)的影響Tab. 7 Effects of dietary threonine on intestinal morphology in O.mykiss in various groups (n=3;±SD; μm)

表7 飼料中添加蘇氨酸對虹鱒腸道形態(tài)的影響Tab. 7 Effects of dietary threonine on intestinal morphology in O.mykiss in various groups (n=3;±SD; μm)

指標(biāo)Index 組別Group G1 G2 G3 G4 G5絨毛高度Villus length725.82±14.51c738.76±18.83d716.29±15.17b706.56±11.86a718.67±15.43bc絨毛寬度Villus width334.71±6.55ab332.07±5.43ab331.29±4.21a356.96±3.45c348.17±5.17b肌層厚度Muscle thickness225.90±4.36a232.98±4.76b249.76±5.89c238.52±3.32bc240.32±4.41bc

通過光學(xué)顯微鏡觀察中腸形態(tài)的組織切片發(fā)現(xiàn), 投喂蘇氨酸缺乏組, G1和G2組(圖 1A和1B)的組織結(jié)構(gòu)不夠完整, 組織微絨毛脫落, 形態(tài)輪廓模糊,出現(xiàn)邊緣缺刻; 隨著蘇氨酸水平的增加, G3組(圖 1C)腸絨毛有少量脫落; G4和G5組(圖 1D和1E)的腸道組織形態(tài)最佳, 絨毛發(fā)達(dá), 排列整齊, 無融合和脫落現(xiàn)象, 杯狀細(xì)胞增多, 柱狀上皮細(xì)胞整齊排列。

圖1 蘇氨酸水平對三倍體虹鱒腸道組織形態(tài)的影響Fig. 1 Effects of dietary threonine level on intestinal tissue morphology of triploid O. mykiss

2.4 飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒腸道炎癥因子和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)量的變化

如圖 2所示, 隨著蘇氨酸水平的增加,IgM基因的相對表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢, 在1.29%組達(dá)到最高值, 與對照組相比, 差異顯著(P＜0.05); 而TNF-α基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)降低的變化趨勢, 在1.64%組有最小值, 差異顯著(P＜0.05)。

圖2 蘇氨酸水平對三倍體虹鱒IgM和TNF-α基因表達(dá)量的影響Fig. 2 Effects of dietary threonine level on IgM and TNF-α gene expression in triploid O. mykiss

如圖 3所示, 在飼料中添加蘇氨酸對IL-2、IL-10和IL-8表達(dá)量都有顯著影響, 與對照組相比, 隨著蘇氨酸水平的增加,IL-2和IL-8基因的相對表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢, 分別在1.29%和1.64%組達(dá)到最高值, 與對照組相比, 差異顯著(P＜0.05);IL-10的基因表達(dá)量逐漸降低, 與對照組相比, 差異顯著(P＜0.05)。

圖3 蘇氨酸水平對三倍體虹鱒IL-2, IL-8和IL-10基因表達(dá)量的影響Fig. 3 Effects of dietary threonine level on IL-2、IL-8 and IL-10 gene expression in triploid O. mykiss

如圖 4所示, 隨著蘇氨酸水平的增加,PepT1基因的相對表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢, 在1.29%組達(dá)到最高值, 與對照組相比, 差異顯著(P＜0.05)。

圖4 蘇氨酸水平對三倍體虹鱒PepT1基因表達(dá)量的影響Fig. 4 Effects of dietary threonine level on PepT1 gene expression in triploid O. mykiss

3 討論

3.1 飼料中添加蘇氨酸對魚類血清抗氧化酶活性的影響

前期研究表明, 低魚粉飼料中添加蘇氨酸組的生長性能顯著高于對照組[19]。Habte-Tsion等[23]在團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)幼魚飼料中添加不同水平的蘇氨酸, 研究發(fā)現(xiàn), 適宜的蘇氨酸水平可以顯著的改善免疫反應(yīng), 增強(qiáng)抗氧化酶活性,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)的活性均隨著飼料蘇氨酸水平的增加而升高, 當(dāng)超過蘇氨酸最佳含量范圍1.58%—2.08%, 上升趨勢減緩。在本試驗(yàn)中, 隨著飼料中蘇氨酸水平含量的增加, SOD活性顯著升高(P＜0.05), CAT活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,當(dāng)蘇氨酸水平為1.29%時(shí), CAT活性最高, 隨著蘇氨酸含量的進(jìn)一步增加, CAT活性有所下降。在草魚(Ctenopharyngodon idella)的研究中也有相似的發(fā)現(xiàn), 添加適量的蘇氨酸, 增強(qiáng)了肝和腸的SOD、CAT酶活性, 這表明蘇氨酸水平可提高魚類抗氧化酶活性[8]。在本試驗(yàn)中, 蘇氨酸缺乏組的MDA含量最高, 最佳的蘇氨酸水平顯著降低了MDA含量(P＜0.05)。這表明, 蘇氨酸通過抑制魚類的氧化損傷來保護(hù)機(jī)體, 最佳的蘇氨酸水平對虹鱒的氧化損傷具有保護(hù)作用。本試驗(yàn)同時(shí)測得SOD和MDA指標(biāo)的變化, 能更加充分地表明機(jī)體的抗氧化能力和受損程度, 在飼料中添加適量的蘇氨酸可以調(diào)節(jié)機(jī)體的抗氧化狀態(tài), 降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對細(xì)胞的毒害作用, 降低細(xì)胞中過氧化氫的濃度, 使細(xì)胞免受毒害[24—27]。

3.2 飼料中添加蘇氨酸對魚類腸道消化生理的影響

蘇氨酸參與了腸的功能和維持[28—29], 動(dòng)物機(jī)體的生長狀況與消化酶活性存在正比例關(guān)系[30,31]。對草魚的研究發(fā)現(xiàn), 飼料中添加蘇氨酸能顯著提高草魚腸內(nèi)α-淀粉酶、脂肪酶、堿性磷酸酶、胰蛋白酶的活性[8]。對幼建鯉(Cyprinus carpiovar.Jian)的研究發(fā)現(xiàn), 蘇氨酸能顯著提高幼建鯉腸道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力, 當(dāng)蘇氨酸含量分別達(dá)1.5%和1.62%時(shí), 腸道的胰蛋白酶和脂肪酶活力最高, 蘇氨酸含量與腸道脂肪酶和胰蛋白酶活力呈顯著的二次相關(guān)關(guān)系[30,32]。因此這說明飼料中添加適量的蘇氨酸水平有提高腸道消化酶活性和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的能力, 進(jìn)而提高魚體的生長發(fā)育。在本試驗(yàn)中, 隨著蘇氨酸含量的增加, 脂肪酶活性顯著提高(P＜0.05), 胰蛋白酶和淀粉酶活性隨著蘇氨酸含量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。推測原因可能是, 試驗(yàn)魚的種類和大小、基礎(chǔ)飼料的組成(純化、半純化實(shí)用飼料等)、試驗(yàn)設(shè)計(jì)和養(yǎng)殖條件等多個(gè)原因造成[33—35]。

有報(bào)道稱, 在幼建鯉飼料中添加適宜水平的蘇氨酸可以促進(jìn)腸道的生長發(fā)育, 腸道的皺襞高度、腸長、腸長指數(shù)、腸體指數(shù)及腸道蛋白含量都有增加[36]。對鯉(Cyprinus carpio)腸上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng), 研究發(fā)現(xiàn)添加適宜水平的蘇氨酸能夠促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的增殖和分化[37]。在草魚中也有相似的發(fā)現(xiàn), 生長后期草魚的腸重、腸長、腸體指數(shù)和腸道蛋白都隨著蘇氨酸水平的增加顯著提高, 表明蘇氨酸對生長后期草魚腸道的生長發(fā)育有著至關(guān)重要的作用, 但是對腸道相對長度沒有顯著影響,與草魚的研究不一致, 蘇氨酸水平的變化可以提高幼建鯉腸道的相對長度, 可能與魚的品種有關(guān)[38]。本試驗(yàn)研究表明, 飼料中添加適宜水平的蘇氨酸能提高三倍體虹鱒腸道的絨毛高度和肌層厚度, 投喂蘇氨酸缺乏組的腸道組織微絨毛脫落, 隨著蘇氨酸含量的增加, 腸道組織結(jié)構(gòu)完整, 絨毛發(fā)達(dá)。在陸生生物的研究中也有相似發(fā)現(xiàn), 蘇氨酸缺乏造成腸道結(jié)構(gòu)破壞, 微絨毛脫落, 黏膜固有層松弛。腸道結(jié)構(gòu)受損會(huì)直接影響腸道功能的發(fā)揮, 導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[39—44]?？梢? 蘇氨酸在促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和保護(hù)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要的作用。

3.3 飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒腸道炎癥因子和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)量的影響

小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1主要位于腸道上皮細(xì)胞,它是一種完整的膜蛋白載體, 主要參與腸道內(nèi)小肽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn), 通過轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽為機(jī)體運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì), 促進(jìn)動(dòng)物發(fā)育, 同時(shí)也參與炎癥反應(yīng)的免疫應(yīng)答, 在炎癥細(xì)胞因子通訊中發(fā)揮作用[45,46]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示, 隨著蘇氨酸水平的增加,PepT1呈先升高后降低的變化趨勢, 在1.29%組為最高, 與對照組相比, 有顯著差異。添加適宜水平的蘇氨酸上調(diào)了PepT1基因的表達(dá)量, 促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

蘇氨酸是免疫球蛋白生成中的主要限制性氨基酸, 在機(jī)體的免疫系統(tǒng)組織、器官中發(fā)揮著重要的作用[47]。蘇氨酸缺乏時(shí)會(huì)抑制免疫球蛋白及T、B淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生, 從而影響免疫功能[48,49]。在魚類中, 腸道免疫反應(yīng)的關(guān)鍵組成是炎癥反應(yīng), 該反應(yīng)主要由細(xì)胞因子介導(dǎo)。IL-2由IL-1β刺激分泌, 是T細(xì)胞生長因子, 通過活化T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表達(dá)促進(jìn)免疫反應(yīng), 并有效控制免疫應(yīng)答[50]。IL-8和TNF-α是重要的促炎細(xì)胞因子。IL-8在白細(xì)胞的趨化性和功能中具有重要作用, 對恢復(fù)感染組織有一定作用。TNF-α由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生, 在炎癥反應(yīng)中刺激免疫細(xì)胞并介導(dǎo)免疫應(yīng)答, 具有殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞的功效[51]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn), 飼料蘇氨酸缺乏組上調(diào)了腸道腫瘤壞死因子TNF-α基因的表達(dá), 隨著蘇氨酸水平的增加, 下調(diào)了TNF-α基因的表達(dá), 這表明最佳的蘇氨酸水平預(yù)防或減輕了腸道炎癥反應(yīng), 而IL-2、IL-8和IgM基因的表達(dá)則相反。對草魚幼魚的研究也有相似的發(fā)現(xiàn), 與最佳蘇氨酸補(bǔ)充組相比, 蘇氨酸缺乏組用嗜水氣單胞菌攻擊14d后, 抗腸炎的能力降低, 腸IgM含量都顯著降低; 上調(diào)了腸道促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-8的mRNA水平[52]。IL-10是重要的抗炎因子, 主要被用來抑制免疫反應(yīng)的過度激活。在本試驗(yàn)中, 0.76%和1.09%組上調(diào)了IL-10的表達(dá), 隨著蘇氨酸的進(jìn)一步增加, 下調(diào)了IL-10基因的表達(dá)。結(jié)果表明, 蘇氨酸水平顯著影響三倍體虹鱒腸道炎癥因子相關(guān)基因的表達(dá), 魚體在投喂不同水平的蘇氨酸時(shí), 蘇氨酸能刺激T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖, 促進(jìn)免疫反應(yīng), 隨著蘇氨酸水平的增加, 炎癥因子在不同的濃度下達(dá)到峰值, 說明蘇氨酸能夠作用于免疫防御系統(tǒng), 通過提高免疫因子的表達(dá)量, 進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能, 保護(hù)機(jī)體免受損傷, 減少死亡率。但是當(dāng)蘇氨酸水平過高時(shí), 對免疫反應(yīng)有抑制作用, 各種細(xì)胞因子也會(huì)適度表達(dá)來保護(hù)機(jī)體, 而過度的免疫反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生。因此, 高水平添加蘇氨酸不利于機(jī)體內(nèi)部的動(dòng)態(tài)平衡。

4 結(jié)論

在低魚粉飼料(15%)中添加適量水平的蘇氨酸,對提高三倍體虹鱒幼魚生長、消化酶活性、促進(jìn)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育和增強(qiáng)魚體免疫等方面都具有積極的作用。綜合試驗(yàn)結(jié)果, 建議在低魚粉飼料中添加1.09%—1.29%的蘇氨酸, 其生長和免疫效果最佳。在前期研究的基礎(chǔ)上, 可以進(jìn)一步探索, 植物蛋白替代魚粉, 最適的蘇氨酸添加量, 旨在為優(yōu)化三倍體虹鱒人工配合飼料提供理論依據(jù)。